Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp của virus dengue các type sử dụng trong chẩn đoán sốt dengue sốt xuất huyết dengue

Bộ Khoa học Công nghệ Viện công nghệ sinh học Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật Đề tài: Đề tài KC.04-18 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp virus Dengue type sử dụng chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue PGS.TS Đinh Duy Kháng 6050 12/9/2006 Hà Nội, 3- 2006 Bản quyền 2006 thuộc Viện CNSH, Viện KH&CN Việt Nam Lời cảm ơn Tập thể cán khoa học thuộc đề tài KC.04.18 xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới Bộ Khoa học Công nghệ, Ban Chủ nhiệm Chơng trình KC.04, Bộ Tài chính, Ban Lãnh Đạo Viện Công nghệ Sinh học Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ơng đạo sát tạo điều kiện thuận lợi để đề tài hoàn thành nhiệm vụ Thay mặt tập thể Cán Khoa học thực Đè tài KC.04-18 PGS.TS Đinh Duy Kháng Mục lục Tr A thông tin đề tài A.1 Danh sách cán thực đề tài I A.2 trích lợc thuyết minh đề tài II B Báo cáo b.1 Danh mục từ viết tắt III b.2 Cáo cáo toàn văn Mở đầu Chơng 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Bệnh sốt Dengue sốt xuất huyết Dengue 1.1.1 Biểu lâm sàng 1.1.2 Tác nhân truyền bệnh 1.1.3 Tình hình dịch bệnh giới 1.1.4 Tình hình dịch bệnh Việt Nam 1.2 ViruS Dengue 1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc 1.2.2 Hệ gen (Genome) virus dengue 1.2.3 Chu trình nhân lên chế gây bệnh virus Dengue 12 1.2.4 Đặc điểm kháng nguyên 13 1.2.5 Các kháng nguyên dùng chẩn đoán 15 1.3 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 17 1.3.1 Chẩn đoán huyết học 17 1.3.2 Phân lập virus 19 1.3.3 Xác định typ huyết virus dengue 20 1.4 Dự phòng kiểm soát bệnh 20 1.4.1 Phát triển vắc xin phòng sốt dengue/sốt xuất huyết dengue Chơng 2: Đối tợng phơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối tợng vật liệu 21 23 23 2.2.1 Đối tợng 23 2.2.2 Các sinh phẩm 23 2.2.2.1 Hệ tách dòng pCR2.1 24 2.2.2.2 Vector biểu pET-TRX-FuS 25 2.2.2.3 Hệ biểu Pichia pastoris 26 2.2.3 Hoá chất 28 2.2.4 Dung dịch môi trờng 28 2.1 Máy móc thiết bị 40 2.3 Phơng pháp 41 2.3.1 Phơng pháp sản xuất kháng nguyên virus Dengue tế 41 bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/ 36 2.3.2 Kỹ thuật huỳnh quang trực tiếp kiểm tra tế bào nhiễm 43 virus Dengue 2.3.3 Phơng pháp tách chiết RNA tổng số 44 2.3.4 Phơng pháp khuếch đại gen mã hoá tiền kháng nguyên 44 màng (pre-M) kháng nguyên vỏ (E) typ virus dngue phản ứng RT-PCR 2.3.5 Phơng pháp tạo dòng đoạn gen khuếch đại 48 2.3.6 Phơng pháp biến nạp plasmid vào tế bào E coli khả biến 48 sốc nhiệt 2.3.7 Biến nạp vào tế bào P pastoris xung điện 49 2.3.8 Phơng pháp tách chiết plasmid từ E coli 51 2.3.9 Phơng pháp tách chiết DNA genome từ tế bào P pastoris 51 2.3.10 Phơng pháp cắt DNA enzyme giới hạn 52 2.3.11 Phơng pháp điện di DNA gel agarose 53 2.3.12 Phơng pháp xác định trình tự axit nucleic 54 2.3.13 Phơng pháp chiết DNA từ gel agarose 55 2.3.14 Phơng pháp điện di protein gel polyacrylamide 56 2.3.15 Phơng pháp biểu protein tái tổ hợp E coli 57 chủng BL21 2.3.16 Phơng pháp biểu protein tái tổ hợp Pichia 57 pastoris 2.3.17 Tinh chế protein dung hợp cột Probond Nikel 58 Resin 2.3.18 Sản xuất thioredoxin tái tổ hợp kháng thể kháng 60 thioredoxin tái tổ hợp gắn peroxidase (HRP) 2.3.19 Phơng pháp Western blot 64 2.3.20 Phơng pháp Dot blot 64 2.3.21 Phơng pháp Elisa tóm bắt IgM (MAG-ELISA) tóm 65 bắt IgG (GAG-ELISA) Chơng 3: Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Nhân virus Dengue typ I (DEN-1), virus Dengue 67 67 typ II (DEN-2), virus Dengue typ III (DEN-3) virus Dengue typ IV (DEN-4) tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/36 3.1.1 Tuyển chọn type virus Dengue phân lập từ năm 2001 67 đến năm 2005 miến Bắc, miền Trung Tây Nguyên 3.2 Tách dòng xác định trình tự đoạn gene Prem- 74 m e type virus dengue 3.2.1 Tách RNA tổng số tế bào muỗi C6/36 3.2.1.1 Kiểm tra RNA tách chiết phơng pháp quang phổ 74 74 kế 3.1.1.2 Kiểm tra RNA tách chiết phơng pháp điện di 74 gel agarose 3.2.2 Khuếch đại đoạn gene PreM E phơng pháp RT- 75 PCR 3.2.3 Gắn sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng pCR2.1 79 3.2.4 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli 80 chủng INVF 3.2.5 Kết tách chiết kiểm tra plasmid tái tổ hợp từ E 80 coli 3.2.6 Kết xác định trình tự 3.3 biểu e coli, tinh sạch, kiểm tra tính 82 91 đặc hiệu kháng nguyên domain thuộc protein vỏ virus dengue type 3.3.1 Thiết kế vector biểu pET TRX FuS E3 91 3.3.1.1 Khuếch đại đoạn gen E3 cặp mồi biểu 92 3.3.1.2 Thiết kế plasmid tái tổ hợp pET-TRX-FuS-DxE3 93 3.3.2 Biểu DxE3 E coli 95 3.3.3 Tinh kháng nguyên tái tổ hợp 3.3.4 Kiểm tra phản ứng kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể kháng kháng nguyên tự nhiên virus Dengue Western Blot 3.4 biểu kháng nguyên màng vỏ virut 99 Dengue type 1, 2, 3, hệ nấm men Pichia pastoris 3.4.1 Thiết kế vector biểu vùng gen preM E 99 3.4.1.1 Ghép nối hai nửa Dx3 Dx5 thành đoạn Dx hoàn 103 chỉnh 3.4.1.2 Khuếch đại đoạn Dx cặp mồi biểu 107 3.4.1.3 Gắn đoạn Dx vào vector pPICvà chọn dòng pPICDx 109 3.4.2 Biểu gen mã hoá kháng nguyên preM-E (gen preM-env) 112 Pichia pastoris 3.4.3 Kiểm tra phản ứng kháng nguyên DxME tái tổ hợp với 114 kháng thể kháng virus Dengue tự nhiên Western Blot 3.5 Sử dụng protein tái tổ hợp để chế tạo kit 116 chẩn đoán SD/SXHD kỹ thuật Dot blot Elisa 3.5.1 Thiết kế vector biểu tinh Thioredoxin 117 3.5.2 Sản xuất Kit chẩn đoán SD/SXHD MAG-ELISA 120 GAG-ELISA 3.5.3 Thử nghiệm chẩn đoán kỹ thuật Dot Blot 122 3.5.4 Sản xuất thử nghiệm KIT phát kháng thể kháng 123 virus dengue dot blot 3.6 kết đào tạo 125 3.7 công trình công bố 127 3.8 tóm lợc kết đề tài theo hợp đồng 129 thuyết minh đề tài Kết luận đề nghị 132 Tài liệu tham khảo 134 Danh sách cán thực đề tài kc.04-18* Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp virus Dengue type sử dụng chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Họ tên PGS TS Đinh Duy Kháng PGS TS Trơng Nam Hải TS Phạm Thúy Hồng TS Lê Quang Huấn CN Nguyễn Tiến Minh CN Bạch Thị Nh Quỳnh CN Nguyễn Thị Ngọc Diệp CN Trịnh Quý Bôn CN Dơng Hồng Quân CN Phạm Minh Tuấn CN Dơng Văn Cờng CN Nguyễn Thị Sinh ThS Bùi Hoàng Anh ThS Phùng Thu Nguyệt CN Lê Thị Thu Hồng CN Trần Thị Hờng CN Nguyễn Hồng Thanh CN Bùi Thanh Xuân CN Trần Thị Thanh Huyền GS TS Trơng Uyên Ninh TS Lê Thị Quỳnh Mai TS Nguyễn Thị Hồng Hạnh TS Đỗ Thị Thoa ThS Trơng Thừa Thắng CN Nguyễn Thị Thu Thủy TS Nguyễn Xuân Quang TS Vũ Thị Tờng Vân BS Nguyễn Thị Hạnh Cơ quan công tác Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ơng Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ơng Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ơng Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ơng Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ơng Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ơng Bệnh Viện Bạch Mai Bệnh Viện Bạch Mai Bệnh Viện Bạch Mai * Chú thích: Một số tác giả đăng ký tham gia đề tài thuyết minh ban đầu nhng điều kiện cụ thể lý cá nhân nên không tham gia đợc Ngợc lại, yêu cầu đề tài, số cán tên thuyết minh nhng đợc mời tham gia đề tài trích lợc Thuyết minh đề tài (Mục 1-9, 12, 14-17, 23) I Thông tin chung đề tài Tên đề tài M số Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp virut Dengue typ sử KC.04.18 dụng chẩn đoán sốt Dengue sốt xuất huyết Dengue Thời gian thực hiện: 30 tháng (Từ tháng 09/2002 đến tháng 03/2005 ) Cấp quản lý Nhà nớc Kinh phí Tổng số: 2800 triệu đồng Trong đó: - Từ Ngân sách SNKH: 2500 triệu đồng - Tự có: 300 triệu đồng viện CNSH hỗ trợ cha kể vốn đối ứng Viện bao gồm thiết bị máy móc đại khoảng 70 tỷ đồng Thuộc Chơng trình: KH&CN trọng điểm cấp Nhà nớc giai đoạn 2001-2005 "Nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ sinh học", Mã số KC.04 Chủ nhiệm đề tài Họ tên: Đinh Duy Kháng Học hàm/học vị: TS Chức vụ: Trởng phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học Điện thoại: CQ: 04 7563386 NR: 04 9870812 Fax: 04 8363144 Mobile: 0913087536 E-mail: vsmt@hn.vnn.vn, dinhduykhang@hotmail.com Địa quan: 18, Đờng Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Địa nhà riêng: Số 106, Tổ 9, Phờng Thanh lơng, Quận Hai Bà Trng, Hà Nội Cơ quan chủ trì đề tài Tên tổ chức KH&CN: Viện Công nghệ Sinh học, Trung Tâm KHTN&CN Quốc gia Điện thoại: 04 8362599 Fax: 04 8363144 E-mail: binh@ibt.ac.vn Địa chỉ: 18, Đờng Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Nội dung KH&CN đề tài Mục tiêu đề tài Mục tiêu chung Xây dựng đợc qui trình công nghệ sản xuất kháng nguyên virut Dengue tái tổ hợp typ I, II, III, IV Đánh giá độ nhậy, độ đặc hiệu tính ổn định chất lợng kháng nguyên tạo Mục tiêu cụ thể 2.1 Tạo đợc chủng E coli nấm men P pastoris tái tổ hợp dùng sản xuất kháng nguyên virut Dengue typ I, II, III, IV 2.2 Sử dụng chủng tái tổ hợp để sản xuất đợc kháng nguyên virut Dengue typ I, II, III, IV đảm bảo tính đặc hiệu ổn định chất lợng sử dụng chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue 2.3 Thử khả tạo đáp ứng miễn dịch phòng vệ kháng nguyên tái tổ hợp để làm đề cho việc tạo vắc xin Dengue thử nghiệm 2.4 Đào tạo đội ngũ cán chuyên sâu lĩnh vực công nghệ gen vi sinh để chủ động khâu giống trong công nghệ sản xuất chế phẩm tái tổ hợp từ vi sinh vật 12 Nội dung nghiên cứu (liệt kê mô tả nội dung cần nghiên cứu, nêu bật đợc nội dung phù hợp để giải vấn đề đặt ra, kể dự kiến hoạt động phối hợp để chuyển giao kết nghiên cứu đến ngời sử dụng) Nghiên cứu qui trình công nghệ để tạo kháng nguyên tái tổ hợp dùng chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue bao gồm khâu sau: 1.1 Tách dòng xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên vỏ (kháng nguyên E) type virut Dengue 1.2 Thiết kế vector biểu gen tách dòng 1.3 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli P pastoris 1.4 Chọn lọc dòng E coli P pastoris tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên vỏ virut dengue 1.5 Nghiên cứu biểu hiện, thu nhận protein tái tổ hợp 1.6 Nghiên cứu tối u hóa điều kiện biểu chủng tái tổ hợp để thu nhận lợng kháng nguyên tối đa 1.7 Thiết lập qui trình tách chiết, tinh chế thích hợp, có hiệu suất cao để thu nhận protein tái tổ hợp đủ độ ứng dụng việc chế tạo sinh phẩm chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue 1.8 ứng dụng kỹ thuật miễn dịch để đánh giá tính đặc hiệu, độ nhạy kháng kDa 116 79 kDa 66 43 35 Hình 3.27C: Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamit 12,5% kiểm tra khả biểu vùng D3ME P.pastoris sau ngày cảm ứng Đờng chạy 1: Thang protein chuẩn Đờng chạy 2, 3, 4: Protein dòng chứa vùng gen preM-env Đờng chạy 5: Protein dòng đối chứng kDa 116 66 43 35 25 18 Hình 3.27D: Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamit 12,5% kiểm tra khả biểu vùng D4ME P.pastoris sau ngày cảm ứng Đờng chạy 1: Thang Protein chuẩn Đờng chạy 2: Dịch nuôi cấy tế bào nấm men có chứa vector đối chứng pPIC9 Đờng chạy 3: Dịch nuôi cấy tế bào nấm men có chứa pPICD4 Trong tế bào nấm men thờng xảy trình glycozyl hoá protein sau dịch mã, protein ngoại lai đợc biểu thờng đợc gắn thêm gốc đờng Kết điện di hình 3.27 cho thấy protein tái tổ hợp DxME có kích thớc khoảng 79 kDa (cao so với tính toán kDa trình glycozyl hóa) đợc biểu tế bào nấm men P pastoris sau đợc cảm ứng methanol 1%, 30 dòng đối chứng chứa vector pPIC9 không thấy xuất băng protein tơng ứng Từ kết kết luận biểu thành công toàn vùng gen preM - env virus dengue type 1,2,3,4 nấm men P pastoris Tuy nhiên, điều quan trọng phải chứng minh đợc khả phản ứng protein tái tổ hợp với kháng thể kháng virus Dengue tự nhiên Kỹ thuật Western blot với kháng thể kháng virus Dengue tự nhiên đợc sử dụng để chứng minh điều 3.4.3 Kiểm tra phản ứng kháng nguyên DxME tái tổ hợp với kháng thể kháng virus Dengue tự nhiên Western Blot Protein tái tổ hợp DxME sau biểu nấm men P.pastoris đợc kiểm tra khả liên kết miễn dịch với kháng thể đặc hiệu kháng virus dengue huyết thỏ kỹ thuật Western blot kDa 1 116 66 43 35 79 79 2 79 79 42 37 25 18 14 D1 D2 D3 D4 Hình 3.28: Sự liên kết kháng nguyên tái tổ hợp DxME với kháng thể kháng virus Dengue huyết thỏ kiểm tra Western blot Đờng chạy 1: Thang protein chuẩn Đờng chạy 2: Phản ứng protein tái tổ hợp DxME (D1ME, D2ME, D3ME, D4ME)với kháng thể kháng dengue type D1, D2, D3, D4 tự nhiên Theo nh kết biểu protein tái tổ hợp có kích thớc khoảng 79 kDa Riêng trờng hợp type có băng protein bị đứt gẫy có kích thớc khoảng 37 42 kDa Các protein tái tổ hợp DxME đợc chuyển sang màng PVDF đợc phủ với kháng thể kháng virus dengue tự nhiên Kết hình 3.28 xuất băng kích thớc 79kb (type 1,2,3) ba băng (type 4) với kích thớc với kích thớc protein biểu Điều chứng tỏ protein tái tổ hợp DxME có khả phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus dengue tự nhiên Kết mở triển vọng ứng dụng protein tái tổ hợp DxME cho mục đích tạo sinh phẩm chẩn đoán sốt dengue sốt xuất huyết dengue 31 3.5 Sử dụng protein tái tổ hợp để chế tạo kit chẩn đoán SD/SXHD kỹ thuật Dot blot Elisa Để tạo kit chẩn đoán SD/SXHD, sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp thuộc domain (D1E3, D2E3, D3E3, D4E3) Đây loại kháng nguyên tái tổ hợp với giá thành hạ đợc biểu với suất cao E.coli (đạt 20 mg protein tái tổ hợp/lít môi trờng nuôi cấy), dễ tinh chế Hơn nữa, protein đợc biểu dạng lai ghép có hai nửa, nửa mang kháng nguyên đặc hiệu virus Dengue, nửa chứa Thioredoxin dễ dàng tạo kháng thể kháng Thioredoxin để làm kháng thể 2, sau gắn enzyme để phát phức hợp kháng thể (trong huyết bệnh nhân)+kháng nguyên tái tổ hợp Thioredoxin DE3 Kháng thể kháng Thioredoxin gắn enzyme Kháng thể kháng DE3 Kháng thể kháng TRX tái tổ hợp gắn enzyme IgM IgG Kháng nguyên DE3-TRX tái tổ hợp Kháng thể kháng IgM IgG Hình 3.29: Mô hình kháng nguyên tái tổ hợp dạng lai ghép DE3-Thioredoxin (DE3TRX) ứng dụng chế tạo Kit chẩn đoán SD/SXHD MAG-ELISA GAG-ELISA Tuy nhiên, muốn chế tạo đợc Kit chẩn đoán SD/SXHD MAG-ELISA GAG-ELISA cần phải có kháng thể kháng Thioredoxin gắn enzyme Để thực đợc mục đích này, trớc hết phải có Thioredoxin tái tổ hợp tinh Muốn thế, phải tách biểu riêng tinh Thioredoxin 32 3.5.1 Thiết kế vector biểu tinh Thioredoxin Để có đợc Thioredoxin tái tổ hợp có đuôi His-tag dùng cho việc tinh chế cột sắc ký lực Nikel chelating Resin Chúng tiến hành biến đổi vector nh sau: Thiết kế Adaptor cho đầu có vị trí cắt enzyme hạn chế BamHI, đầu thứ hai có vị trí cắt XhoI Ngoài ra, Adaptor có thêm số vị trí cắt enzyme hạn chế quan trọng nh EcoRI, SacI, SalI, HindIII để tiện cho việc thao tác sau này: GATCCGAATTCGAGCTCGTCGACAAGCTTC |||||||||||||||||||||||||| GCTTAAGCTCGAGCAGCTGTTCGAAGAGCT BamHI EcoRI SacI SalI HindIII XhoI Vector pET-TRX-Fus đợc xử lý phối hợp với enzyme BamHI XhoI để loại bỏ vùng cắt gắn đa vị (MCS), vector xử lý đợc gắn với Adaptor nhờ T4-ligase Sau gắn, vector đợc biến nạp vào E coli chủng DH5 để chọn lọc vector đạt yêu cầu Các vector đạt yêu cầu phải vector đợc thay vùng cắt gắn đa vị cho có khung đọc để tạo đợc Thioredoxin tái tổ hợp có gắn đuôi Histidine (His-tag) Vector đợc kiểm tra lại trình tự hai mồi xuôi ngợc sau biến nạp vào tế bào E coli chủng BL21 DE3 Star để biểu thu nhận thioredoxin tái tổ hợp Thioredoxin tái tổ hợp protein chứa 143 aa với khối lợng phân tử khoảng 15,6 kDa (Hình 3.30) Hình 3.30: Thioredoxin tái tổ hợp biểu E coli M: Chỉ thị phân tử protein 1: Mẫu không cảm ứng IPTG 2: Mẫu sau cảm ứng IPTG 0,5mM 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Các phân đoạn sau tinh cột sắc ký lực Nikel Resin 33 Sau có đợc Thioredoxin tái tổ hợp tinh sạch, dùng protein gây miễn dịch cho thỏ để sản xuất kháng thể kháng Thioredoxin Kháng thể kháng Thioredoxin sản xuất thỏ trớc hết đợc kiểm tra khả phản ứng với Thioredoxin, đồng thời thử khả phản ứng với kháng nguyên virus Dengue nh virus viêm gan B có lai ghép với Thioredoxin nh kháng nguyên DE3-TRX, HBcAg-TRX (Hình 3.31) Hình 3.31: Western blot đánh giá kháng thể kháng Thioredoxin phản ứng với Thioredoxin tái tổ hợp, HBcAg-TRX tái tổ hợp DE3-TRX tái tổ hợp M: Chỉ thị phân tử protein 1: HBcAg-TRX tái tổ hợp 2: Thioredoxin tái tổ hợp 3, 4, 5, 6: D1E3TRX, D2E3-TRX, D3E3-TRX, D4E3-TRX tái tổ hợp Kết cho thấy, kháng thể kháng Thioredoxin sản xuất phản ứng đặc hiệu không với với Thioredoxin, mà với kháng nguyên virus Dengue nh virus viêm gan B có lai ghép với Thioredoxin (DE3-TRX, HbcAgTRX) Nh kháng thể đợc dùng chung nh kháng thể để chẩn đoán virus khác kháng nguyên virus đợc lai ghép với Thioredoxin Ngoài ra, kháng thể dùng để phát protein tái tổ hợp dùng hệ vector pPET-TRX-Fus để biểu protein Hiện tại, kháng thể phải mua hãng với giá thành cao Sau có đợc kháng thể kháng Thioredoxin, tiến hành tinh kháng thể gắn với enzyme Horseradish peroxidase (HRP) để có đợc cộng hợp kháng thể gắn HRP dùng cộng hợp hợp để chế tạo Kit chẩn đoán SD/SXHD MAG-ELISA GAG-ELISA Thử nghiệm bớc đầu cho kết khả quan (Hình 3.32) 34 3.5.2 Sản xuất Kit chẩn đoán SD/SXHD MAG-ELISA GAG-ELISA Từ kết trên, dùng kháng nguyên DE3-TRX tái tổ hợp để chế tạo Bộ sinh phẩm (Kit) chẩn đoán SD/SXHD MAG-ELISA GAG-ELISA Thành phần sinh phẩm GAC- ELISA MAC- ELISA Hình 3.33: Kháng nguyên Dengue tái tổ hợp Bộ Kit chẩn đoán SD/SXHD MAG-ELISA 3.5.3 Thử nghiệm chẩn đoán kỹ thuật Dot Blot Ngoài việc sử dụng kháng nguyên DE3-TRX tái tổ hợp để chế tạo Kit chẩn đoán SD/SXHD MAG-ELISA GAG-ELISA, kiểm tra khả phản ứng kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể huyết bệnh nhân Dot blot Các kháng nguyên tái tổ hợp tinh đợc chấm lên màng PVDF cho phản ứng với kháng thể huyết bệnh nhân Kết Dot blot cho thấy mức độ phản ứng protein tái tổ hợp D1E3, D2E3, D3E3, D4E3 với mẫu huyết bệnh nhân dơng tính âm tính rõ ràng (hình 3.34) Điều gợi ý, dùng kháng nguyên tái tổ hợp chế tạo Kit Dot bot để phát nhanh kháng thể huyết bệnh nhân, phục vụ cho việc điều tra dịch tễ huyết học vùng có dịch Hình 3.34 Dùng protein DxE3 tái tổ hợp để phát kháng thể kháng virus dengue tự nhiên huyết bệnh nhân Dot blot 1-4, 9: Các mẫu huyết đợc xác định dơng tính 5-8, 10: Các mẫu huyết đợc xác định âm tính 35 3.5.4 Sản xuất thử nghiệm KIT phát kháng thể kháng virus dengue dot blot Từ kết chẩn đoán thử nghiệm trên, có đủ sở khoa học để chế tạo KIT phát kháng thể kháng virus Dengue Dot blot (Hình 3.35) Dot Blot Kit Hình 3.35: Kit chẩn phát kháng thể kháng virus Dengue Dot blot 3.6 kết đào tạo Số sinh viên, thạc sỹ, tiến sỹ bảo vệ khoá luận tốt nghiệp, luận văn thạc sỹ luận án tiến sỹ thuộc lĩnh vực đề tài 17 ngời, bao gồm 11 sinh viên, học viên cao học nghiên cứu sinh 36 3.7 công trình công bố Đã có 04 trình tự gen preM-env type virus Dengue đợc đăng ký Ngân hàng gen quốc tế, 09 công trình đợc công áô tạp chí nớc 01 công trình đăng ký quyền giải pháp hữu ích gủi Cục sáng chế Kết luận đề nghị 37 Kết luận: Đã tạo dòng, xác định trình tự, đăng ký Ngân hàng gen quốc tế lu giữ nh tài sản quí trình tự gen mã hoá kháng nguyên màng (M) vỏ (E) virut dengue typ D1, D2, D3, D4 từ chủng virus Dengue phân lập chọn lọc Việt Nam để phục cho nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán SD/SXHD nh nghiên cứu vắc xin phòng chống SD/SXHD tơng lai Đã tạo đợc 08 chủng E coli tái tổ hợp để sản xuất kháng nguyên vỏ virut Dengue typ D1, D2, D3, D4, đặc biệt 04 chủng mang vector tái tổ hợp để biểu kháng nguyên DE3 với độ đặc hiệu sản lợng cao, dễ tinh sạch, giá thành hạ (một lít E coli tái tổ hợp sản xuất đợc tới 20-30mg protein DE3 tinh sạch) đủ cho việc tạo Kit chẩn đoán hàng ngàn mẫu huyết bệnh nhân Đã sản xuất đợc kháng nguyên tái tổ hợp virut Dengue typ D1, D2, D3, D4 dạng chimeric (lai ghép hai protein), protein phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus dengue, protein thứ hai phản ứng với kháng thể chung làm tăng tính đặc hiệu tiện ích sử dụng Công trình đợc đăng ký quyền giải pháp hữu ích Đã sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp tạo đợc 120 sinh phẩm chẩn đoán SD/SXHD MAG-ELISA GAG-ELISA sử dụng có kết địa phơng khác Để dễ dàng điều tra mặt huyết học virus dengue, sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp D1E3, D2E3, D3E3 D4E3 để chế tạo kit Dot blot phát kháng thể kháng virus dengue Bộ kit sử dụng dễ dàng vùng xa xôi, không cần thiết bị máy móc đắt tiền phát đợc kháng thể kháng virus dengue vòng Đã đăng ký đợc 04 trình tự gen mã hoá cho kháng nguyên preM E 04 type virus Dengue với số đăng ký AJ574886, AJ574760, AJ563355, AJ563356; công bố đợc 09 công trình tạp chí nớc 01 công trình đợc gửi lên Cục sáng chế để dăng ký quyền giải pháp hữu ích 38 Trong khuôn khổ đề tài đào tạo đợc 11 cử nhân, 05 thạc sỹ 01 tiến sỹ Đề nghị: Trên sơ gen tách dòng, tiếp tục nghiên cứu để tìm vùng gen đặc hiệu cho type virus Dengue, nghiên cứu biểu để tạo Kit định type nhanh chủng virus Dengue lu hành, phục vụ cho việc giám sát dịch tễ học định hớng điều trị 39 Tài liệu tham khảo Tiếng việt Bùi Đại, Dengue xuất huyết, NXB Y học, 2002 : 400 tr Đào Đình Đức (2000), Tình hình sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue(SD/SXHD) giới Việt Nam, Kết nghiên cứu khoa học, Viện Y học lâm sàng bệnh nhiệt đới Đỗ Quang Hà, Vũ Thị Quế Hơng, Huỳnh Thị Kim Loan (1996), Dịch Dengue xuất huyết 1995 tỉnh phía Nam, Chuyên đề sốt xúât huyết viêm não, Viện Pasteur T.P Hồ Chí Minh Đỗ Quang Hà, Virut Dengue dịch sốt xuất huyết, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2003 : 118 tr Hoàng Thủy Nguyên, Lê Văn Điệt, Trơng Uyên Ninh (1992), ứng dụng kỹ thuật trung hoà giảm đám hoại tử xác định tỷ lệ nhiễm virut dengue ngời trởng thành Hà Nội năm 1989, Tạp chí vệ sinh phòng dịch tập 2, số 3, tr 1-5 Lê Đăng Hà (2000), Lâm sàng xét nghiệm bệnh Dengue xuất huyết, Viện Y học lâm sàng bệnh nhiệt đới Trần Văn Tiến, Lê Đức Hinh, Dơng Đình Thiện, Phùng Đắc Cam, Nguyễn Thu Yến, Trịnh Quân Huấn (2000), Sốt Dengue/Sốt xuất huyết Dengue/Hội chứng sốc Dengue, Sổ tay kiểm soát bệnh truyền nhiễm, Nhà xuất Y học, tr.364-369 Trơng Uyên Ninh, Nguyễn Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Mạnh Cờng, Sự lu hành typ virut Dengue số tỉnh miền Bắc Việt Nam từ 1999 đến 2001, Tạp chí Y học dự phòng, 2003, 13(4) : 61 - 64 Trơng Uyên Ninh, Kết giám sát huyết học, virut học bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue tỉnh phía Bắc năm 2002, Tạp chí Y học dự phòng, 2003, 13(2+3) : 15 - 20 10 Trơng Uyên Ninh, Giám sát chủ động huyết học, virut học bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue ba tỉnh miền Trung Việt nam 2000 - 2002, Tạp chí Y học dự phòng, 2003, 13(5) : 16 - 19 11 Trờng Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Vi sinh vật (2000), Vi sinh y học, Nhà xuất Y học Hà Nội 40 Tiếng anh 12 Bach Thi,Q.N., Bui Hoang,A., Truong Uyen,N., Truong Thua,T., Le Thi,M.Q., Nguyen Thi,H.H and Dinh Duy,K (2003), Cloning and expression of the gene coding for preM and Eelope protein of dengue virus typ EMBL GenBank Database, ACCESSION AJ574886 13 Bisht, H., Chugh, D.A., Swaminathan, S., Khanna, N (2001) Expression and purification of dengue virus type Envelope protein as a fusion with Hepatitis B surface antigen in Pichia pastoris Protein Expr Purif 23, 84-96 14 Bray, M., and C.-J Lai 1991 Construction of intertypic chimeric dengue viruses by substitution of structural protein genes Proc Natl Acad Sci USA 88:10342-10346 15 Chen, W., H Kawano, R Men, D Clark, and C.-J Lai 1995 Construction of intertypic chimeric dengue viruses exhibiting type antigenicity and neurovirulence for mice J Virol 69:5186-5190 16 Chiu MW, Yang YL (2003) Blocking the dengue virus infections on BHK-21 cells with purified recombinant dengue virus E protein expressed in Escherichia coli Biochem Biophys Res Commun 309(3):672-8 17 Chungue E., Marche R., Plichart R., Boutin J.P, Roux J (1989), Comparision of immunoglobulinG enzymed-linked immunosorbent assay and hemaglutination inhibition test for detection of Dengue antibodies, J.Trop.Med.Hyg, (83), pp 708-771 18 Cohen S, Powell CJ, Dubois DR, Hartman A, Summers PL, Eckels KH (1990) Expression of the envelope antigen of dengue virus in vaccine strains of Salmonella Res Microbiol 141(7-8):855-8 19 Delenda C, Frenkiel MP, Deubel V Protective efficacy in mice of a secreted form of recombinant dengue-2 virus envelope protein produced in baculovirus infected insect cells Arch Virol 1994 Vol 139:197-207 20 Deubel, V., M Bordier, F Megret, M K Gentry, J J Schlesinger, and M Girard 1991 Processing, secretion, and immunoreactivity of caboxy terminally truncated dengue-2 virus envelope proteins expressed in insect cells by recombinant baculoviruses Virology 180:442-447 21 Deubel, V 1997 The contribution of molecular techniques to the diagnosis of dengue infection, p 335-366 In D J Gubler, and G Kuno (ed.), Dengue and dengue hemorrhagic fever CAB International, London, United Kingdom 22 Duong Hong,Q., Truong Uyen,N., Truong Thua,T., Le Thi,M.Q., Nguyen Thi,H.H and Dinh Duy,K.: Cloning and Expression of the genes coding for 41 PreM and Envelope proteins of Dengue virus type ACCESSION AJ574760 (25-JUN-2003) 23 Gubler, D J., and A Casta-Velez 1991 A program for prevention and control of epidemic dengue and dengue hemorrhagic fever in Puerto Rico and the U.S Virgin Islands Bull Pan Am Health Org 25:237-247 24 Gubler, D.J (1997), Dengue and dengue hemorrhagic fever: its history and resurgence as global public health problem, CAB International, London, p 122 25 Henchal, E A., J M McCown, M C Sequin, M K Gentry, and W E Brandt 1983 Rapid identification of dengue virus isolates by using monoclonal antibodies in an indirect immunofluorescence assay Am J Trop Med Hyg 32:164-169 26 Hermida L., R Rodr_guez, L Lazo, C L_opez, G M_arquez, R P_aez, C Su_arez, R Espinosa, J Garc_a, G Guzm_an, G Guill_en (2002) A recombinant envelope protein from dengue virus purified by IMAC is bioequivalent with its immune-affinity chromatography purified counterpart J Biotechnol 94: 213216 27 Igarashi, A 1978 Isolation of Singh's Aedes albopictus cell clone sensitive to dengue and chikungunya viruses J Gen Virol 40:530-544 28 Jaiswal S, Khanna N, Swaminathan S (2004) High-level expression and onestep purification of recombinant dengue virus type envelope domain III protein in Escherichia coli Protein Expression and Purification 33: 80-91 29 Kapoor, M., L Zhang, P M Mohan, and R Padmanabhan 1995 Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain) Gene 162:175-180 30 Kochel, T., S.-J Wu, K Raviprakash, P Hobart, S L Hoffman, and C G Hayes 1997 Inoculation of plasmids expressing the dengue-2 envelope gene elicit neutralizing antibodies in mice Vaccine 15:547-552 31 Kuberski, T T., and L Rosen 1977 A simple technique for the detection of dengue antigen in mosquitoes by immunofluorescence Am J Trop Med Hyg 26:533-537 32 Kuno G., Gomez I., Gubler D.J (1991), An ELISA procedure for the diagnosis of Dengue infections, J Virol Meth, No 33, pp.101-103 33 Kuno G., Gubler D.J., Croop C.B., Wong-Lee J., (1998), Dengue IgM immunoblot, Am Trop Med Hyg, No 87, pp.111-113 34 Laemmli U.K (1970), Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227, pp 680-685 42 35 Lin, B., C R Parrish, J M Murray, and P J Wright, Localization of a neutralizing epitope on the envelope protein of Dengue virus type 2, Virology, 1994, 202 : 885 - 890 36 Mason, P W., J M Dalrymple, M K Gentry, J M McCown, C H Hoke, D S Burke, M J Fournier, and T L Mason 1989 Molecular characterization of a neutralizing domain of the Japanese encephalitis virus structural glycoprotein J Gen Virol 70:2037-2049 37 Nguyen Tien,M., Truong Uyen,N., Truong Thua,T., Le Thi,M.Q., Nguyen Thi,H.H and Dinh Duy,K Cloning and expression of the genes encoding PreM and Envelope proteins of Dengue virus type ACCESSION AJ563355 (13MAY-2003) 38 Polo, S., G Ketner, R Levis, and B Falgout 1997 Infectious RNA transcripts from full-length dengue virus type cDNA clones made in yeast J Virol 71:5366-5374 39 Pupo-Antunez M, Rodriguez R, Alvarez M, Amin N, Rodriguez H, Otero A, Guzman G Development of a monoclonal antibody specific to a recombinant envelope protein from dengue virus type expressed in Pichia pastoris Hybridoma 2001 Vol 20:35-41 40 Rey, Felix A., Dengue virus envelope glycoprotein structure: New insight into its interactions during viral entry, PNAS, 10 June 2003, 100(12) : 6899 - 6901 41 Russell, P K 1978 Progress toward dengue vaccines Asian J Infect Dis 2:118-120 42 Russell, P K 1978 Progress toward dengue vaccines Asian J Infect Dis 2:118-120 43 Sambrook, J., E F Fritsch and T Maniatis, 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 44 Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R (1977), DNA sequencing with chain termination inhibitors, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74, pp 5463-5467 45 Srivastava AK, Putnak JR, Warren RL, Hoke CH Jr Mice immunized with a dengue type virus E and NS1 fusion protein made in Escherichia coli are protected against lethal dengue virus infection Vaccine 1995 Vol 13:1251-8 46 Sugrue R.J., T Cui, Q Xu, J Fu, Y.C Chan (1997) The production of recombinant dengue virus E protein using Escherichia coli and Pichia pastoris J Virol Methods 69: 159169 43 47 Tan, B.-H., J Fu, R J Sugrue, E.-H Yap, Y.-C Chan, and Y H Tan 1996 Recombinant dengue type virus NS5 protein expressed in Escherichia coli exhibits RNA-dependent RNA polymerase activity Virology 216:317-325 48 Tesh, R B 1979 A method for the isolation and identification of dengue viruses, using mosquito cell cultures Am J Trop Med Hyg 28:1053-1059 49 Towbin, H., T Staehelin, and J.Gordon 1979 Electrophoretic transfer of Proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some application Proc Nalt Acad Sci 76: 4350 50 Trinh Quy,B., Truong Uyen,N., Truong Thua,T., Le Thi,M.Q., Nguyen Thi,H.H and Dinh Duy,K.: Cloning and expression of the genes encoding PreM and Envelope proteins of of Dengue virus type ACCESSION AJ563356 (13-MAY-2003) 51 Wang, S; R Hi; R Anderson (1999), Pre M and cell-binding domains of the dengue virus E protein, Journal of Virology, Vol 73, No 3, pp 2547-51 52 Yuill, T M., P Sukkhavachana, A Nisalak, and P K Russell 1968 Denguevirus recovery by direct and delayed plagues in LLC-MK2 cells Am J Trop Med Hyg 17:441-448 53 Zhao BT, Prince G, Horswood R, Eckels K, Summers P, Chanock R, Lai CJ Expression of dengue virus structural proteins and nonstructural protein NS1 by a recombinant vaccinia virus J Virol 1987 Vol 61: 4019-22 44 [...].. .nguyên tái tổ hợp đã đợc tạo ra 1.9 Xây dựng đợc qui trình công nghệ cho sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp của virut Dengue các typ có đủ độ đặc hiệu, độ nhạy để chẩn đoán sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue Qui trình tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp, ứng dụng trong sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp chẩn đoán sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue là hoàn toàn mới ở Việt Nam Việc nghiên cứu áp dụng qui... phản ứng đặc hiệu của các kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể kháng virus dengue tự nhiên bằng các kỹ thuật ELISA, Western blot và Dot blot - Sử dụng các kháng nguyên tái tổ hợp để tạo ra các Kit chẩn đoán sốt dengue/ sốt xuất huyết dengue 17 Chơng I tổng quan tài liệu 1.1 Bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue 1.1.1 Biểu hiện lâm sàng Sốt dengue/ sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD) đợc chia thành nhiều... (mỗi loại 1000 ml) - Kháng nguyên tái tổ hợp của virut Dengue các typ I, II, III, IV có độ nhạy, độ tinh khiết và độ đặc hiệu cao - Kết luận về độ sạch và độ đặc hiệu của kháng nguyên 6 - Đánh giá kháng nguyên tái tổ hợp và kháng thể chống kháng nguyên tái tổ hợp bằng các kỹ thuật miễn dịch 6 - ứng dụng các protein tái tổ hợp để tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue bằng MAC-ELISA... Đinh Duy Kháng, Lê Quang Huấn Viện CNSH, Trơng Nam Hải, Phan Văn Chi, Lê Quang Huấn, Lê Thanh Hòa Viện Công nghệ Sinh học 10 5 P pastoris Sàng lọc các chủng tái tổ hợp có khả năng tổng hợp kháng nguyên E của virut Dengue các typ I, II, III, IV hợp tạo ra kháng nguyên E của virut Dengue các typ - Nghiên cứu qui trình công nghệ biểu hiện, tách chiết, tinh chế kháng nguyên Dengue tái tổ hợp các typ (mỗi... 31 1.3 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm bao gồm các khâu: phân lập virus, phát hiện các kháng nguyên hoặc vật liệu di truyền của virus (RNA) trong huyết thanh hay trong các mô nhiễm virus, hoặc phát hiện các kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh bệnh nhân [38, 46, 106] 1.3.1 Chẩn đoán huyết thanh học Các phơng pháp chủ yếu chẩn đoán huyết thanh học của virut Dengue bao... virut Dengue (Kuberski T.T và Rosen L., 1977) Tuy nhiên gần đây, với sự phát triển của sinh học phân tử, các kháng nguyên virut Dengue đã đợc sản xuất bằng phơng pháp tái tổ hợp Từ năm 1987 ngời ta đã bắt đầu nghiên cứu để tạo tạo ra các kháng nguyên virut Dengue tái tổ hợp Zhao B.T., 1987, đã tạo ra đợc chủng virut đậu bò tái tổ hợp sản xuất 2 protein quan trọng của virut dengue là PreM và E (kháng nguyên. .. tái tổ hợp sản xuất vỏ của virut dengue type 4 và sản xuất kháng thể dơn dòng kháng protein tái tổ hợp này (Pupo-Antunez M, 2001) Ngoài ra, ngời ta còn có thể tạo ra chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sản xuất ra một protein lai giữa kháng nguyên bề mặt của virut viêm gan B và kháng nguyên vỏ của virut dengue (Bisht H, 2001) Năm 2002, ngời ta đã tạo ra đợc chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sản xuất ra protein... những nghiên cứu cơ bản với những nội dung chính sau đây: - Tách dòng và xác định trình tự các đoạn gene mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng nhất là kháng nguyên màng (PreM) và kháng nguyên vỏ (E) của bốn type dengue - Thiết kế các vector biểu hiện vùng kháng nguyên màng và vỏ của bốn type dengue - Biểu hiện và tinh sạch các protein tái tổ hợp - Đánh giá khả năng phản ứng đặc hiệu của các kháng nguyên. .. Flavivirus khác Kháng nguyên của virus dengue khu trú ở đại thực bào phổi, lách, gan, tuyến ức, các tổ chức da và bạch cầu đơn nhân Khi xâm nhập vào cơ thể các kháng nguyên của virus là kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên ngng kết hồng cầu và kháng nguyên kết hợp bổ thể sẽ kích thích cơ thể hình thành các kháng thể đặc hiệu tơng ứng [6, 7] Các kháng nguyên quan trọng về mặt dịch tễ học của virus Dengue chủ... hiện trong E coli để tạo ra các kháng nguyên tái tổ hợp dùng trong chẩn đoán SD/SXHD còn có một lợi thế khác là kháng nguyên tái tổ hợp giá thành hạ, biểu hiện ra đợc một lợng lớn trong một thời gian ngắn, và chỉ cần tinh chế một bớc là có thể thu đợc kháng nguyên sạch Ngoài ra, các kháng nguyên này cũng phản ứng rất đặc hiệu với kháng thể kháng virus dengue tự nhiên (Jaiswal S và cs, 2004) 31 1.3 Chẩn ... chung đề tài Tên đề tài M số Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp virut Dengue typ sử KC.04.18 dụng chẩn đoán sốt Dengue sốt xuất huyết Dengue Thời gian thực hiện:... nguyên tái tổ hợp virut Dengue typ có đủ độ đặc hiệu, độ nhạy để chẩn đoán sốt Dengue sốt xuất huyết Dengue Qui trình tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp, ứng dụng sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp. .. kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể kháng virus dengue tự nhiên kỹ thuật ELISA, Western blot Dot blot - Sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để tạo Kit chẩn đoán sốt dengue/ sốt xuất huyết dengue