Sản xuất enzyme protease tái tổ hợp từ chủng bacillus sp

Sản xuất enzyme Protease tái tổ hợp từ chủng Bacillus sp I Tổng quan enzyme Protease vi khuẩn Bacillus Tổng quan enzyme Protease 1.1 Giới thiệu chung * Protease nhóm enzyme thủy phân có khả cắt liên kết peptide (CO-NH) phân tử polypeptide, protein số chất khác tương tự thành amino acid tự peptide phân tử thấp * Phân loại: **Dựa vào vị trí tác dụng cua protease lên liên kết peptide phân tử protein, người ta chia protease làm hai nhóm chính: Endopeptidase (protease): chủ yếu phân giải liên kết peptide nằm phân tử protein tạo thành đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ (polypeptide mạch ngắn, peptone, ) Exopeptidase (polypeptidase): chủ yếu phân cắt liên kết hai đầu mạch Ví dụ: nhóm cacboxylpeptidase aminopeptidase phân giải liên kết peptide từ hai đầu mạch polypeptide có nhóm cacboxyl amin tự ** Dựa vào thành phần amino acid vùng pH tối ưu cho hoạt động protease, người ta chia protease thành nhóm sau: _ Protease axit: pepsin, renin, hoạt động vùng pH axit _ Protease kiềm: trypsin, chymotrypsin, hoạt động vùng pH kiềm, có nhiều hệ enzym ruột non, tuyến tụy, nấm men _ Protease trung tính: amylase, papain, hoạt động vùng pH trung tính Loại protease có nhiều lồi nấm mốc khác Ngồi nấm mốc protease trung tính thấy vi khuẩn Bacillus Tuy nhiên, việc tạo loại protease axit, trung tính hay kiềm phụ thuộc nhiều thành phần môi trường vào chất mà chúng tác dụng **Dựa vào chế thủy giải liên kết peptide liên quan tới cấu trúc đặc biệt trung tâm hoạt động Protease chia làm nhóm nhỏ, tên nhóm gồm tên axit amin quan trọng có vai trò xúc tác trung tâm hoạt động enzym: - Serin-protease : protease có nhóm ( _OH) serin trung tâm hoạt động Các serin_protease hoạt động vùng pH kiềm có tính đặc hiệu tương đối rộng Tính đặc hiệu chúng thể phía gốc axit amin chứa nhóm ( _CO_ ) liên kết peptide bị thủy phân Nhóm (_OH_) có vai trò quan trọng với hoạt động xúc tác enzym -Cystein_protease : enzym thuộc nhóm có nhóm (_SH) cystein trung tâm hoạt động Nhóm (_SH) có vị trí đặc biệt trung tâm hoạt động xúc tác enzym có khả phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hoá học oxy hóa, phosphoryl hóa, Các cystein_protease thường hoạt động mạnh pH trung tính có tính đặc hiệu rộng, chúng hoạt động nhóm (_SH_) trung tâm hoạt động không bị bao vây - Aspartic-protease: protease chứa nhóm (_COOH) axit aspartic trung tâm hoạt động, đóng vai trò xúc tác trung tâm hoạt động enzym Các aspartic_protease thường hoạt động mạnh pH axit Chúng có tính đặc hiệu axit amin vòng thơm axit amin kỵ nước nhánh vòng thơm - Metallo-protease:là protease trung tâm hoạt động chúng có ion kim loại trực tiếp tham gia phản ứng Các metallo_protease thường hoạt động mạnh vùng pH trung tính có tính đặc hiệu phía gốc axit amin chứa nhóm (_NH_) liên kết peptid Chúng tác dụng lên nhóm liên kết peptid chứa nhóm (_NH_) axit amin kỵ nước có kích thước lớn liên kết peptid tạo thành từ axit amin có phân tử lượng thấp * Vai trò: - Protease enzyme quan trọng cơng nghiệp, có tác dụng xúc tác cho phản ứng phân giải protein, sử dụng nhiều kỷ, lĩnh vực sử dụng enzyme ngành sản xuất sữa - Trong thể, protease đảm nhiệm nhiều chức sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu phân hủy sợi fibrin cục máu đơng, giải phóng hormon peptid có hoạt tính sinh học từ tiền chất, vận chuyển protein qua màng - Protease cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tế bào, quan đến thể nên phân bố rộng rãi nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) động vật (gan, dày bê ) 1.2.Đặc điểm tính chất Protease vi sinh vật Trước hết hệ Protease vi sinh vật hệ thống phức tạp bao gồm nhiều enzyme giống cấu trúc, khối lượng hình dạng phân tử nên khó tách dạng tinh thể đồng Cũng phức hệ gồm nhiều enzyme khác nên Protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để đa dạng Tổng quan nguồn thu nhận Protease từ vi khuẩn Bacillus Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần thay enzyme từ động vật thực vật hàng loạt ưu điểm sinh lí vi sinh vật kĩ thuật sản xuất sau đây: - Vi sinh vật có khả chuyển hóa khối lượng chất lớn khối lượng thể chúng hàn ngàn lần sau ngày đêm - Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao - Vi sinh vật sinh tổng hợp lúc nhiều loại enzyme khác - Tốc độ sinh sản vi sinh vật nhanh thời gian ngắn thu lượng sinh khối vi sinh vật lớn, giúp thời gian ngắn thu lượng enzyme nhiều lượng sản phẩm trao đổi chất cao - Một đặc điểm riêng có vi sinh vật thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trình sản xuất đơn giản nhiều - Vi sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp sản suất, trình sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp hồn tồn khơng phụ thuộc khí hậu bên ngồi - Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô cơng nghiệp rẻ tiền dễ kiếm, khơng có ý nghĩa mặt kinh tế mà ý nghĩa mặt môi trường sống Lượng Protease sản xuất từ vi khuẩn ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme sử dụng Protease động vật hay thực vật chứa hai loại endopeptidase exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả sinh hai loại trên, Protease vi khuẩn có tính đặc hiệu chất cao Chúng có khả phân hủy tới 80% liên kết peptide phân tử protein Các chủng vi khuẩn có khả tổng hợp mạnh Protease Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus số giống thuộc chi Clostridium Trong đó, B.subtilis S5 có khả tổng hợp Protease mạnh Các vi khuẩn thường tổng hợp Protease hoạt động thích hợp vùng pH trung tính kiềm yếu Các Protease trung tính vi khuẩn hoạt động khoảng pH hẹp (pH 5-8) có khả chịu nhiệt thấp Các Protease trung tính tạo dịch thủy phân protein thực phẩm đắng so với Protease động vật tăng giá trị dinh dưỡng Chúng có khả lực cao acid amin ưa béo thơm sinh nhiều B.subtilis, B.mesentericus, B thermorpoteoliticus số giống thuộc chi Clostridium Protease Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện 11, khối lượng phân tử từ 20.000-30.000dalton Ổn định khoảng pH 6-12 hoạt động khoảng pH rộng 7-12 2.4 Một số nghiên cứu protease 2.4.1 Một số nghiên cứu protease giới Từ kỷ 18, nhà tự nhiên học Reomur (người Pháp) phát dịch dày chim ăn thịt có khả tiêu hóa thịt Sau Schwann (1836) quan sát hoạt động phân giải protein dịch vị 30 năm sau tách enzym phân giải protein mà ngày gọi pepsin Năm 1957, Corvisart tách trypsin từ dịch tụy protease dạng chế phẩm chưa tinh Brucke (1861) tách pepsin từ dịch dày chó dạng tương đối tinh khiết Danilevxki (1862) dùng phương pháp hấp phụ colodion tách trypsin với amylase tụy tạng Phương pháp nghiên cứu hấp phụ có ý nghĩa lớn nghiên cứu tinh chế enzym protein Sau hàng loạt protease nghiên cứu tách dạng chế phẩm như: chymotrypsin Hommarsten tách vào năm 1872; papain Wurtz tách từ phần khác đu đủ; bromelin Willstatter, Grassmann, Ambros tách từ phần dứa; cathepsin cua mô động vật Willstatter Bamann tách vào năm 1929 Từ năm 1930 đến nay, sau Summer (1926) kết tinh urease từ đậu tương, nhà khoa học kết tinh hàng loạt protease Nhờ kết tinh enzym có độ tinh cao nên người ta nghiên cứu cấu trúc phân tử, cấu trúc trung tâm hoạt động, tính chất hóa lý tính đặc hiệu protease Từ năm 1950 đến nay, nhờ sử dụng số phương pháp để tinh chế protein enzym nên người ta tách dạng khác nhiều protease, ví dụ năm 1959 Ryle Porter dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion tách hai thành phần chế phẩm pepsin lợn pepsin B pepsin C Metrione Neves Fruton (1966) dùng phương pháp lọc qua gel sephadex kết hợp với sắc ký trao đổi ion thu chế phẩm cathepsin đồng nhất, Trong năm 1950 đến nay, nhà khoa học tập trung nghiên cứu protease VSV đạt số thành tựu đáng kể như: năm 1950 Giintelberg Ottesen tách protease kiềm từ Bac.subtilis, năm 1967 Danno Yoshimura tách protease cua Asp.sydowi 2.4.2 Một số nghiên cứu protease Việt Nam Năm 1964, Nguyễn Lân Dũng, Đào Trọng Hùng Ngô Khắc Truy nghiên cứu sử dụng protease Asp.oryzae xác định sử dụng enzym chế biến nước mắm Sau năm 1967, Nguyễn Lân Dũng Phạm Văn Ty tiến hành cấy trực tiếp số chủng nấm mốc Aspergillus có khả tổng hợp protease lên cá giữ nhiệt độ 55°C 1_3 ngày, kết nghiên cứu cho thấy thịt cá thủy phân nhanh [2] Năm 1983, Phạm Thị Trân Châu cơng bố "Một số đặc tính khả phân giải chất khác protease ngoại bào Bac.pumilus" cho thấy từ môi trường ni cấy thu hai protease: protease kiềm hoạt động pH 10,7 protease trung tính hoạt động pH 7,0 nhạy cảm với DFP gọi serin_metallo protease Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng protease ngoại bào Bac.pumỉlus chế biến cá đem lại hiệu kinh tế cao ngồi sử dụng enzym chế biến gluten, nhộng [7] Năm 1991, Ngô Thị Mại, Nguyễn Thị Dự cộng dùng protease Bac.subtilis bổ sung vào trình thủy phân cá Kết cho thấy bổ sung 0,3% chế phẩm protease Bac.subtilis vào khối chượp nhiệt độ 50°C thời gian chế biến nước mắm rút ngắn 10 ngày 30_35 ngày điều kiện tự nhiên mùa hè [2] Năm 1996, Đặng Văn Hợp có cơng trình "Nghiên cứu cải tiến qui trình sản xuất nước mắm ngắn ngày enzym protease nấm mốc Asp.orỵzae" cho thấy lượng protease nấm mốc Asp.oryzae thích hợp 3% so với khối lượng cá, lượng rỉ đường 1,2% so với chượp, nhiệt độ tối ưu để thủy phân 49°C, thời gian ngày, từ rút ngắn thời gian chế biến nước mắm [19] Năm 1997, Đặng Văn Hợp, Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền tiến hành đề tài "Nghiên cứu chiết xuất thu nhận chế phẩm protease từ canh trường nuôi cấy nấm mốc Asp.oryzae-A4" cho thấy từ môi trường nuôi cấy Asp.oryzaeA4 theo phương pháp bề mặt thu nhận chế phẩm protease từ canh trường nuôi theo cách chiết rút nước cất với tỉ lệ: canh trường/ nước cất 1/4 kết tủa muối (NHR 4R)R 2RSOR 4R với tỉ lệ: 3,5 dd(NHR 4R)R 2RSOR 4R bão hòa/ dd chiết, thu CPE protease có hoạt tính cao [20] Các nghiên cứu protease giới nói chung Việt nam nói riêng mở hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng protease thực tiễn sống  ... nhiều enzyme khác nên Protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để đa dạng Tổng quan nguồn thu nhận Protease từ vi khuẩn Bacillus Nguồn enzyme từ vi sinh... vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp sản suất, trình sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp hồn tồn khơng phụ thuộc khí hậu bên - Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô... Clostridium Trong đó, B.subtilis S5 có khả tổng hợp Protease mạnh Các vi khuẩn thường tổng hợp Protease hoạt động thích hợp vùng pH trung tính kiềm yếu Các Protease trung tính vi khuẩn hoạt động