Nghiên cứu lên men và thu nhận lactoferrin tái tổ hợp từ pichia pastoris

Nhan đề : Nghiên cứu lên men và thu nhận Lactoferrin tái tổ hợp từ Pichia pastoris Tác giả : Ngô Thị Nguyệt Người hướng dẫn: Trương Quốc Phong Từ khoá : Protein; Lactoferrin; Pichia pastoris Năm xuất bản : 2020 Nhà xuất bản : Trường đại học Bách Khoa Hà Nội Tóm tắt : Tổng quan về cấu trúc, chức năng và ứng dụng của Lactoferrin, phương pháp tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực; vật liệu và phương pháp nghiên cứu; kết quả và thảo luận.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu lên men thu nhận Lactoferrin tái tổ hợp từ Pichia pastoris NGƠ THỊ NGUYỆT Ngành: Cơng nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trương Quốc Phong Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu lên men thu nhận Lactoferrin tái tổ hợp từ Pichia pastoris NGƠ THỊ NGUYỆT Ngành: Cơng nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trương Quốc Phong Chữ ký GVHD Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2020 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : NGÔ THỊ NGUYỆT Đề tài luận văn: Nghiên cứu lên men thu nhận Lactoferrin tái tổ hợp từ Pichia pastoris Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: CB190013 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 30 tháng 11 năm 2020 với nội dung sau: - Thiếu thông tin nấm men, tinh protein việc sử dụng nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp tổng quan - Vật liệu phương pháp cần bổ sung, viết lại cho rõ ràng - Chú thích bảng biểu, hình ảnh cần viết lại cho rõ - Nhiều lỗi tả, lỗi dịch thuật tháng Ngày Giáo viên hướng dẫn năm 2020 Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Họ tên học viên: Ngơ Thị Nguyệt Khóa: 2019B Số hiệu học viên: CB190013 Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Ngành: Công nghệ Sinh học Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận Lactoferrin từ Pichia pastoris tái tổ hợp Họ tên cán hướng dẫn: PGS TS Trương Quốc Phong Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 11/05/2020 Ngày hoàn thành đồ án: 30/11/2020 Ngày … tháng … năm 2020 Giảng viên hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Bản luận văn nghiên cứu với hỗ trợ Phịng thí nghiệm proteomics - Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Các kết nghiên cứu luận văn hoàn tồn trung thực, số liệu, tính tốn hồn tồn xác chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Mọi liệu, hình ảnh trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng nguồn liệu mở trích dẫn rõ nguồn gốc Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Học viên Ngô Thị Nguyệt LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cám ơn chân thành tới Thầy, Cô Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trương Quốc Phong – Viện phó Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình làm việc, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh phịng thí nghiệm Proteomics giúp đỡ tơi nhiều trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, cho phép gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè ln quan tâm, cổ vũ cho bước đường học tập nghiên cứu Học viên Ngô Thị Nguyệt MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC HÌNH ẢNH iii DANH MỤC BẢNG BIỂU v LỜI MỞ ĐẦU TỔNG QUAN 1.1 Cấu trúc, chức ứng dụng Lactoferrin 1.1.1 Cấu trúc Lactoferrin 1.1.2 Tình hình sản xuất Lactoferrin 1.1.3 Sản xuất Lactoferrin từ Pichia pastoris 12 1.2 Phương pháp tinh protein sắc ký lực 13 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu 17 2.1.1 Chủng biểu 17 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 17 2.1.3 Mơi trường hóa chất sử dụng 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phương pháp vi sinh 18 2.2.2 Phương pháp lên men 18 2.2.3 Phương pháp hóa sinh 19 2.2.4 Phương pháp lai phân tử Dot Blot 22 2.2.5 Khảo sát kỹ thuật lên men fed-batch điều kiện cảm ứng methanol để biểu Lactoferrin 22 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Nghiên cứu tối ưu sinh khối Pichia pastoris 24 3.2 Nghiên cứu tối ưu biểu Lactoferrin 32 3.3 Nghiên cứu tối ưu điều kiện tách chiết Lactoferrin 38 3.4 Nghiên cứu tối ưu tinh Lactoferrin 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 4.1 Kết luận 50 4.2 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh LF Lactoferrin hLF Homo Latcoferrin LPS lipopolysaccharide RNA Ribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid HIV human immunodeficiency viruses HCV hepatitis C virus HS Heparan sulfat DO dissolved oxygen SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis OD optical density ii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc ba chiều Lactoferrin bò [10] Hình 1.2 Cơ chế hoạt động kháng khuẩn Lactoferrin (LF) Hình 1.3 Cơ chế hoạt động kháng virus Lactoferrin (LF) Hình 1.4 Cơ chế ức chế trình Hình 1.5 Mơ hình tương tác lực polyhistidine hai ma trận sắc ký lực kim loại cố định 16 Hình 3.1 Các thơng số trình lên men theo mẻ 24 Hình 3.2 Đường cong sinh trưởng, lượng axít, bazơ bơm vào q trình lên men theo mẻ 25 Hình 3.3 Thơng số lên men thiết bị L: pO2, nhiệt độ, tốc độ khuấy, pH lên men fed-batch bổ sung glycerol 26 Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng P pastoris mẻ lên men fed-batch bổ sung glycerol 27 Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng Pichia pastoris mẻ lên men fed-batch có bổ sung glycerol cornsteep 28 Hình 3.6 Thơng số lên men Pichia pastoris mẻ lên men fed-batch có bổ sung glycerol cornsteep 29 Hình 3.7 Lên men fed-batch lượng chất cấp fed-batch 30 Hình 3.8 Tốc độ khuấy sục khí thiết bị lên men L 10 L 30 Hình Thông số lên men P Pastoris thiết bị lên men 10 lít 31 Hình 3.10 Các giai đoạn lên men Pichia pastoris 31 Hình 3.11 Kết điện di SDS-PAGE protein nội bào: M: Maker D1, D2, D3, D4, D5: Mẫu phá protein ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 4, ngày 32 Hình 3.12 (a) Điện di SDS-PAGE protein nội bào P pastoris KM71-H sau cảm ứng theo thời gian:12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h, 96h, Marker (b) Kết Quantity One protein nội bào band 75kDa theo thời gian 33 Hình 3.13 (a) Kết Dot blot 1: 24 cảm ứng; 2: 48 cảm ứng; 3: 72 cảm ứng; 4: 96 cảm ứng (b) Kết Quantify 34 Hình 14 (a) Điện di SDS-PAGE protein nội bào P pastoris KM71-3 (b) Kết Quantify protein nội bào theo thời gian Chú thích: Mẫu 1, 2, 3, 4, 5, lần iii lượt mẫu 24 giờ, 36 lên men, 12 giờ, 24 cảm ứng thường, 36 giờ, 48 sau cảm ứng methanol DO stat 35 Hình 15 (a) Kết Dot Blot; (b) Kết Quantify protein nội bào theo thời gian 35 Hình 16 (a) Kết Dot Blot; (b) Kết Quantity One protein nội bào theo thời gian 37 Hình 3.17 (a), (b) Kết điện di (c) Quantify protein nội bào theo thời gian 38 Hình 3.18 Kết điện di SDS – PAGE mẫu lựa chọn đệm phá M, marker protein; PBS1&2, đệm PBS 1X pH 7,4; LS11&2, đệm siêu âm LS1; LS21&2, đệm siêu âm LS2 39 Hình 3.19 Kết so sánh lựa chọn đệm siêu âm 39 Hình 3.20 Kết so sánh lựa chọn lượng siêu âm 40 Hình 21: Kết điện di SDS – PAGE mẫu lựa chọn lượng thời gian 40 Hình 22: Kết so sánh lựa chọn thời gian siêu âm 41 Hình 23: Kết khả sát điều kiện đồng hóa 42 Hình 24: Kết điện di SDS – PAGE khảo sát điều kiện tách chiết thiết bị đồng hóa áp suất 600 bar (A), 900 bar (B) 1200 bar (C) M, marker protein; 1-9, số lần qua máy 44 Hình 25: Kết định lượng protein lựa chọn đệm tinh Non purified – Mẫu thô; Flow through – Dịch qua gel; Elution – Dịch rửa giải 45 Hình 26: Kết điện di SDS – PAGE tinh sử dụng đệm Tris – HCl (A), PBS 1X (B) NaPi (C) M, marker protein; giếng 1, mẫu thô tách chiết; giếng 2, mẫu qua gel (flow – through); giếng 3-6, mẫu rửa; giếng 7, mẫu rửa giải 46 Hình 27: Kết định lượng protein khảo sát thười gian ủ mẫu 47 Hình 28: Kết điện di SDS – PAGE so sánh ion kim loại niken (A), đồng (B) coban (C) Giếng 1, mẫu thô tách chiết; giếng 2, mẫu qua gel (flow – through); giếng 3-5, mẫu rửa; giếng 6, mẫu rửa giải; M, marker protein 48 Hình 29: Kết điện di SDS – PAGE so sánh tương quan phần trăm protein sử dụng phần mềm Quantity One 49 iv 3.4 Nghiên cứu tối ưu tinh Lactoferrin 3.4.1 Lựa chọn đệm tinh Đệm tinh protein đóng vai trị quan trọng, giúp ích cho hiệu thu hồi tinh dung dịch protein hiệu Trong nghiên cứu này, ba loại đệm khác 50 mM Tris – HCl pH 7,4, 1X PBS pH 7,4 50 mM NaPi sử dụng cho dịch phá protein tồn q trình tinh Từ kết định lượng protein, ta thấy phần trăm protein chứa dịch rửa giải sử dụng đệm PBS đạt 20.2% so với tổng lượng protein tách chiết, sử dụng đệm Tris – HCl NaPi đạt 14% 16.9% (Hình 3.25) 100 100 100 Phần trăm lượng protein (%) 100 90 Tris 80 PBS 70 NaPi 60 50 43.1 38.1 40 30 21.0 20 20.2 14.0 16.9 10 Non purified Flow through Tổng Elution Hình 25: Kết định lượng protein lựa chọn đệm tinh Non purified – Mẫu thô; Flow through – Dịch qua gel; Elution – Dịch rửa giải Kết điện di SDS – PAGE cho thấy lượng protein Lactoferrin nguyên vẹn (75kDa) dịch rửa giải sử dụng đệm NaPi thấp nhiều so với sử dụng đệm Tris – HCl PBS Protein Lactoferrin kích thước 75 kDa bị thơi bước rửa sử dụng đệm NaPi Qua thấy khả gắn kết 45 protein Lactoferrin lên gel đệm NaPi tương đối yếu Trong tương quan so sánh đệm PBS Tris – HCl, hiệu tinh tương đồng lượng Lactoferrin thu rửa giải hai điều kiện cao đáng kể so với sử dụng đệm NaPi Hình 26: Kết điện di SDS – PAGE tinh sử dụng đệm Tris – HCl (A), PBS 1X (B) NaPi (C) M, marker protein; giếng 1, mẫu thô tách chiết; giếng 2, mẫu qua gel (flow – through); giếng 3-6, mẫu rửa; giếng 7, mẫu rửa giải 46 Các kết thu cho thấy đệm PBS Tris – HCl phù hợp để tinh protein Lactoferrin tái tổ hợp có His – tag sử dụng gel His – tag Chelate 650M Tuy nhiên, dịch protein Lactoferrin tinh sử dụng cho thí nghiệm sau xác định hoạt tính kháng vi sinh vật, hoạt tính kháng ung thư ứng dụng cho thực phẩm chức năng, đệm PBS thích hợp đệm Tris – HCl nên PBS chọn để dụng cho thí nghiệm sau 3.4.2 Lựa chọn thời gian ủ mẫu Để lựa chọn thời gian ủ mẫu (gắn protein lên gel), hỗn hợp Lactoferrin sau tách chiết gel IMAC ủ khoảng thời gian khác 1, 3, 16 tiếng Kết cho thấy hiệu gắn kết tăng dần thời gian ủ lâu Hiệu gắn đạt cao sau 16 tiếng ủ đạt 16,98 % lượng protein dịch rửa giải so với tổng protein dịch chiết để tinh Phần trăm lượng protein (%) 70.00 65.31 57.92 60.00 57.06 50.80 50.00 40.00 Flow through 30.00 Elution 16.98 20.00 10.00 6.98 6.78 8.23 0.00 16 Thời gian gắn protein lên gel (h) Hình 27: Kết định lượng protein khảo sát thười gian ủ mẫu 3.4.3 So sánh ion kim loại niken, coban đồng để gắn lên gel Có nhiều ion kim loại gắn với gel IMAC, ion niken (Ni2+), coban (Co2+) đồng (Cu2+) thường sử dụng sắc ký lực để tinh protein có His – tag Trong khảo sát này, lượng protein dịch qua gel (flow – through solution – protein khơng liên kết với gel có gắn ion kim loại) mẫu gel liên kết với Cu2+ thấp 1,5 lần so với Ni2+, điều cho thấy nhiều protein liên kết với gel Liên kết mạnh dẫn đến lượng protein không mong 47 muốn lại phần rửa giải so với gel niken Theo quan sát dịch rửa giải thu từ tinh gel gắn Cu2+ chứa lượng đáng kể protein có kích thước từ 35 ÷ 48 kDa Protein Lactoferrin mẫu xác định có kích thước khoảng 75 kDa số phân đoạn peptide nhỏ Những phân đoạn nhỏ hoạt tính phân giải protein Lactoferrin dẫn đến phân cắt q trình tách chiết tinh Đối với ion kim loại Co2+, dịch elution cho thấy độ tinh cao so với niken đồng hiệu suất thấp Niken cho thấy lực yếu hạn chế liên kết không đặc hiệu với protein tạp thu mẫu có độ tinh cao (C) M Hình 28: Kết điện di SDS – PAGE so sánh ion kim loại niken (A), đồng (B) coban (C) Giếng 1, mẫu thô tách chiết; giếng 2, mẫu qua gel (flow – through); giếng 3-5, mẫu rửa; giếng 6, mẫu rửa giải; M, marker protein Sau lựa chọn kim loại Niken để gắn lên gel tinh sạch, tiến hành thử nghiệm bổ sung NaCl 0,5 M vào dung dịch đệm sau phá, trước tiến hành tinh sắc kí lực Do NaCl có tác dụng làm loại bỏ liên kết không đặc hiệu protein his-tag gel Kết thu sau, protein dịch elution loại bỏ band protein tạp nhiều hơn, cịn band vị trí 75 kDa band khoảng 48kDa (Hình 3.29) Đồng thời, dựa vào kết điện di, thơng qua phân tích phần mềm Quantity One cho thấy hàm lượng protein dịch Elution tương đương 13.25% so với hàm lượng protein thô 48 M Thô FT W1 W2 EL 100 So sánh tương quan (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 13.25 10 Protein Thơ Elution Hình 29: Kết điện di SDS – PAGE so sánh tương quan phần trăm protein sử dụng phần mềm Quantity One 49 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã tối ưu điều kiện lên men thu nhận Lactoferrin từ chủng Picha pastoris KM71 – tái tổ hợp sau: - Tối ưu điều kiện lên men P pastoris: môi trường lên men 2xMM-P, kĩ thuật lên men fed-batch Sau 14 nuôi cấy, bổ sung dịch cấp dưỡng Glycerol 29.23% theo chế độ DO stat Sau 48 giờ, tiến hành cảm ứng dung dịch methanol 18%, lưu lượng 0.2ml/phút - Tách chiết siêu âm với sinh khối nấm men hòa tan đệm phá PBS 1X pH 7,4 điều kiện siêu âm 70% lượng, 10 – on , 10 – off, thời gian siêu âm phút - Tách chiết hiệu lượng lớn protein đồng hóa với áp suất cao 900 bar với số lần qua máy từ đến lần Đã khảo sát điều kiện tinh rbLF phương pháp sắc ký lực sử dụng gel sắc ký lực AF – Chelate – 650 resin (Tosoh, Japan) với ion kim loại sử dụng Ni2+; đệm tinh PBS 1X pH 7,4 có bổ sung thêm NaCl 0.5M; thời gian ủ mẫu 16 tiếng 4.2 Kiến nghị Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính kháng tế bào ung thư Lactoferrin ảnh hưởng nhiệt độ, pH lên hoạt tính Lactoferrin Nâng quy mơ lên men P pastoris lên hệ thống 100 lít/mẻ Nghiên cứu điều kiện thu hồi tinh Lactoferrin quy mơ 100 lít/mẻ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] F L Schanbacher, R E Goodman, and R S Talhouk, “Bovine mammary Lactoferrin: implications from messenger ribonucleic acid (mRNA) sequence and regulation contrary to other milk proteins,” J Dairy Sci., vol 76, no 12, pp 3812– 3831, Dec 1993, doi: 10.3168/jds.S0022-0302(93)77725-5 [2] J M Torres and J L Concepción, “DETECCIĨN DE LISOZIMA Y LACTOFERRINA POR WESTERN BLOT EN OVAS DE,” p 3, 2006 [3] B W van der Strate, L Beljaars, G Molema, M C Harmsen, and D K Meijer, “Antiviral activities of Lactoferrin,” Antiviral Res., vol 52, no 3, pp 225– 239, Dec 2001, doi: 10.1016/s0166-3542(01)00195-4 [4] F Giansanti, L Leboffe, and G Antonini, “Antiviral Activity of Lactoferrin and Ovotransferrin Derived Peptides Towards Herpesviridae,” 2012 [5] D A Rodríguez-Franco, L Vázquez-Moreno, and G Ramos-Clamont Montfort, “[Antimicrobial mechanisms and potential clinical application of Lactoferrin],” Rev Latinoam Microbiol., vol 47, no 3–4, pp 102–111, Dec 2005 [6] O M Conneely, “Antiinflammatory activities of Lactoferrin,” J Am Coll Nutr., vol 20, no Suppl, pp 389S-395S; discussion 396S-397S, Oct 2001, doi: 10.1080/07315724.2001.10719173 [7] R M Bennett and T Kokocinski, “Lactoferrin Content of Peripheral Blood Cells,” Br J Haematol., vol 39, no 4, pp 509–521, 1978, doi: https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1978.tb03620.x [8] P Aisen and A Leibman, “Lactoferrin and transferrin: A comparative study,” Biochim Biophys Acta BBA - Protein Struct., vol 257, no 2, pp 314–323, Feb 1972, doi: 10.1016/0005-2795(72)90283-8 [9] “ei062d.pdf.” Accessed: Nov 18, 2020 [Online] Available: https://www.medigraphic.com/pdfs/micro/ei-2006/ei062d.pdf [10] S A Moore, B F Anderson, C R Groom, M Haridas, and E N Baker, “Three-dimensional structure of diferric bovine Lactoferrin at 2.8 A resolution,” J Mol Biol., vol 274, no 2, pp 222–236, Nov 1997, doi: 10.1006/jmbi.1997.1386 51 [11] K Yamauchi, H Wakabayashi, K Shin, and M Takase, “Bovine Lactoferrin: benefits and mechanism of action against infections,” Biochemistry and Cell Biology., vol 84, no 3, pp 291–296, Jun 2006, doi: 10.1139/o06-054 [12] T G Kanyshkova et al., “Multiple enzymic activities of human milk Lactoferrin,” Eur J Biochem., vol 270, no 16, pp 3353–3361, Aug 2003, doi: 10.1046/j.1432-1033.2003.03715.x [13] M A Siimes, L Salmenperä, and J Perheentupa, “Exclusive breast-feeding for months: risk of iron deficiency,” J Pediatr., vol 104, no 2, pp 196–199, Feb 1984, doi: 10.1016/s0022-3476(84)80991-9 [14] U M Saarinen and M A Siimes, “Iron absorption from infant milk formula and the optimal level of iron supplementation,” Acta Paediatr Scand., vol 66, no 6, pp 719–722, Nov 1977, doi: 10.1111/j.1651-2227.1977.tb07978.x [15] S Iyer and B Lönnerdal, “Lactoferrin, Lactoferrin receptors and iron metabolism,” Eur J Clin Nutr., vol 47, no 4, pp 232–241, Apr 1993 [16] P P Ward, M Mendoza-Meneses, G A Cunningham, and O M Conneely, “Iron status in mice carrying a targeted disruption of Lactoferrin,” Mol Cell Biol., vol 23, no 1, pp 178–185, Jan 2003, doi: 10.1128/mcb.23.1.178-185.2003 [17] R T Ellison, T J Giehl, and F M LaForce, “Damage of the outer membrane of enteric gram-negative bacteria by Lactoferrin and transferrin,” Infect Immun., vol 56, no 11, pp 2774–2781, Nov 1988, doi: 10.1128/IAI.56.11.2774-2781.1988 [18] R T Coughlin, S Tonsager, and E J McGroarty, “Quantitation of metal cations bound to membranes and extracted lipopolysaccharide of Escherichia coli,” Biochemistry, vol 22, no 8, pp 2002–2007, Apr 1983, doi: 10.1021/bi00277a041 [19] E C Leitch and M D P Willcox, “Elucidation of the antistaphylococcal action of Lactoferrin and lysozyme,” J Med Microbiol., vol 48, no 9, pp 867– 871, Sep 1999, doi: 10.1099/00222615-48-9-867 [20] L Seganti, A M Di Biase, M Marchetti, A Pietrantoni, A Tinari, and F Superti, “Antiviral activity of Lactoferrin towards naked viruses,” Biometals Int J Role Met Ions Biol Biochem Med., vol 17, no 3, pp 295–299, Jun 2004, doi: 10.1023/b:biom.0000027708.27142.bc 52 [21] R M Viani, T J Gutteberg, J L Lathey, and S A Spector, “Lactoferrin inhibits HIV-1 replication in vitro and exhibits synergy when combined with zidovudine,” AIDS Lond Engl., vol 13, no 10, pp 1273–1274, Jul 1999, doi: 10.1097/00002030-199907090-00018 [22] M Marchetti, F Superti, M G Ammendolia, P Rossi, P Valenti, and L Seganti, “Inhibition of poliovirus type infection by iron-, manganese- and zincsaturated Lactoferrin,” Med Microbiol Immunol (Berl.), vol 187, no 4, pp 199– 204, May 1999, doi: 10.1007/s004300050093 [23] K Hasegawa, W Motsuchi, S Tanaka, and S Dosako, “Inhibition with Lactoferrin of in vitro infection with human herpes virus,” Jpn J Med Sci Biol., vol 47, no 2, pp 73–85, Apr 1994, doi: 10.7883/yoken1952.47.73 [24] L Beljaars et al., “Inhibition of cytomegalovirus infection by Lactoferrin in vitro and in vivo,” Antiviral Res., vol 63, no 3, pp 197–208, Sep 2004, doi: 10.1016/j.antiviral.2004.05.002 [25] M Ikeda et al., “Characterization of antiviral activity of Lactoferrin against hepatitis C virus infection in human cultured cells,” Virus Res., vol 66, no 1, pp 51–63, Jan 2000, doi: 10.1016/s0168-1702(99)00121-5 [26] F Superti, M G Ammendolia, P Valenti, and L Seganti, “Antirotaviral activity of milk proteins: Lactoferrin prevents rotavirus infection in the enterocytelike cell line HT-29,” Med Microbiol Immunol (Berl.), vol 186, no 2–3, pp 83– 91, Oct 1997, doi: 10.1007/s004300050049 [27] L Lu, G Hangoc, A Oliff, L T Chen, R.-N Shen, and H E Broxmeyer, “Protective Influence of Lactoferrin on Mice Infected with the Polycythemiainducing Strain of Friend Virus Complex,” Cancer Res., vol 47, no 15, pp 4184– 4188, Aug 1987 [28] D D Addie, A Radford, P S Yam, and D J Taylor, “Cessation of feline calicivirus shedding coincident with resolution of chronic gingivostomatitis in a cat,” J Small Anim Pract., vol 44, no 4, pp 172–176, Apr 2003, doi: 10.1111/j.1748-5827.2003.tb00140.x [29] R Sato, O Inanami, Y Tanaka, M Takase, and Y Naito, “Oral administration of bovine Lactoferrin for treatment of intractable stomatitis in feline 53 immunodeficiency virus (FIV)-positive and FIV-negative cats,” Am J Vet Res., vol 57, no 10, pp 1443–1446, Oct 1996 [30] C A M de Haan, Z Li, E te Lintelo, B J Bosch, B J Haijema, and P J M Rottier, “Murine Coronavirus with an Extended Host Range Uses Heparan SuLFate as an Entry Receptor,” J Virol., vol 79, no 22, pp 14451–14456, Nov 2005, doi: 10.1128/JVI.79.22.14451-14456.2005 [31] A Milewska, M Zarebski, P Nowak, K Stozek, J Potempa, and K Pyrc, “Human coronavirus NL63 utilizes heparan suLFate proteoglycans for attachment to target cells,” J Virol., vol 88, no 22, pp 13221–13230, Nov 2014, doi: 10.1128/JVI.02078-14 [32] J Lang et al., “Inhibition of SARS Pseudovirus Cell Entry by Lactoferrin Binding to Heparan SuLFate Proteoglycans,” PLOS ONE, vol 6, no 8, p e23710, Aug 2011, doi: 10.1371/journal.pone.0023710 [33] C J Burckhardt and U F Greber, “Virus Movements on the Plasma Membrane Support Infection and Transmission between Cells,” PLOS Pathog., vol 5, no 11, p e1000621, Nov 2009, doi: 10.1371/journal.ppat.1000621 [34] M Hoffmann et al., “SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor,” Cell, vol 181, no 2, pp 271-280.e8, Apr 2020, doi: 10.1016/j.cell.2020.02.052 [35] C H Kirkpatrick, I Green, R R Rich, and A L Schade, “Inhibition of growth of Candida albicans by iron-unsaturated Lactoferrin: relation to host-defense mechanisms in chronic mucocutaneous candidiasis,” J Infect Dis., vol 124, no 6, pp 539–544, Dec 1971, doi: 10.1093/infdis/124.6.539 [36] W Bellamy, H Wakabayashi, M Takase, K Kawase, S Shimamura, and M Tomita, “Killing of Candida albicans by lactoferricin B, a potent antimicrobial peptide derived from the N-terminal region of bovine Lactoferrin,” Med Microbiol Immunol (Berl.), vol 182, no 2, pp 97–105, May 1993, doi: 10.1007/BF00189377 [37] N Takakura et al., “Oral Lactoferrin Treatment of Experimental Oral Candidiasis in Mice,” Antimicrob Agents Chemother., vol 47, no 8, pp 2619– 2623, Aug 2003, doi: 10.1128/AAC.47.8.2619-2623.2003 54 [38] K A Zarember, J A Sugui, Y C Chang, K J Kwon-Chung, and J I Gallin, “Human polymorphonuclear leukocytes inhibit Aspergillus fumigatus conidial growth by Lactoferrin-mediated iron depletion,” J Immunol Baltim Md 1950, vol 178, no 10, pp 6367–6373, May 2007, doi: 10.4049/jimmunol.178.10.6367 [39] H Wakabayashi, K Uchida, K Yamauchi, S Teraguchi, H Hayasawa, and H Yamaguchi, “Lactoferrin given in food facilitates dermatophytosis cure in guinea pig models,” J Antimicrob Chemother., vol 46, no 4, pp 595–602, Oct 2000, doi: 10.1093/jac/46.4.595 [40] “v11n1a06.pdf.” Accessed: Nov 19, 2020 [Online] Available: http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v11n1/v11n1a06.pdf [41] N León-Sicairos, F López-Soto, M Reyes-López, D Godínez-Vargas, C Ordaz-Pichardo, and M de la Garza, “Amoebicidal activity of milk, apoLactoferrin, sIgA and lysozyme,” Clin Med Res., vol 4, no 2, pp 106–113, Jun 2006, doi: 10.3121/cmr.4.2.106 [42] K Dzitko(Dytnerska), B Dziadek, J Dziadek, and H Dlugonska, “Toxoplasma gondii: Inhibition of the intracellular growth by human Lactoferrin,” Pol J Microbiol Pol Tow Mikrobiol Pol Soc Microbiol., vol 56, pp 25–32, Feb 2007 [43] P Botteon and C Massard, “Seroprevalence of Babesia equi in three breeding systems of equines,” Parasitol Latinoam., vol 57, pp 141–145, Jan 2002 [44] H Ikadai et al., “Inhibitory effect of Lactoferrin on in vitro growth of Babesia caballi,” Am J Trop Med Hyg., vol 73, no 4, pp 710–712, Oct 2005 [45] “Lactoferrin: a general review | Haematologica.” https://www.haematologica.org/article/view/683 (accessed Nov 22, 2020) [46] H S, K K, A A, and N H, “Lactoferrin concentrations in milk from normal and subclinical mastitic cows.,” J Vet Med Sci., vol 65, no 3, pp 319–323, Mar 2003, doi: 10.1292/jvms.65.319 [47] J B Cheng et al., “Factors Affecting the Lactoferrin Concentration in Bovine Milk,” J Dairy Sci., vol 91, no 3, pp 970–976, Mar 2008, doi: 10.3168/jds.20070689 55 [48] F K Welty, K Larry Smith, and F L Schanbacher, “Lactoferrin Concentration During Involution of the Bovine Mammary Gland1, 2,” J Dairy Sci., vol 59, no 2, pp 224–231, Feb 1976, doi: 10.3168/jds.S0022-0302(76)84188-4 [49] M H Barton et al., “Serum Lactoferrin and Immunoglobulin G Concentrations in Healthy or Ill Neonatal Foals and Healthy Adult Horses,” J Vet Intern Med., 2006, Accessed: Nov 22, 2020 [Online] Available: https://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201301121512 [50] G Konuspayeva, B Faye, G Loiseau, and D Levieux, “Lactoferrin and Immunoglobulin Contents in Camel’s Milk (Camelus bactrianus, Camelus dromedarius, and Hybrids) from Kazakhstan,” J Dairy Sci., vol 90, no 1, pp 38– 46, Jan 2007, doi: 10.3168/jds.S0022-0302(07)72606-1 [51] P L Masson and J F Heremans, “Lactoferrin in milk from different species,” Comp Biochem Physiol Part B Comp Biochem., vol 39, no 1, pp 119-IN13, May 1971, doi: 10.1016/0305-0491(71)90258-6 [52] M N Berlov, E S Korableva, Yu V Andreeva, T V Ovchinnikova, and V N Kokryakov, “Lactoferrin from canine neutrophils: Isolation and physicochemical and antimicrobial properties,” Biochem Mosc., vol 72, no 4, pp 445–451, Apr 2007, doi: 10.1134/S0006297907040128 [53] J Sinkora et al., “Commercially available rabbit anti-human polyclonal antisera as a useful tool for immune system studies in veterinary species,” Vet Immunol Immunopathol., vol 119, no 1–2, pp 156–162, Sep 2007, doi: 10.1016/j.vetimm.2007.06.023 [54] M Tomita, H Wakabayashi, K Yamauchi, S Teraguchi, and H Hayasawa, “Bovine Lactoferrin and lactoferricin derived from milk: production and applications,” Biochem Cell Biol., Jan 2011, doi: 10.1139/o01-230 [55] J H Nuijens, P H C van Berkel, and F L Schanbacher, “Structure and biological actions of Lactoferrin,” J Mammary Gland Biol Neoplasia, vol 1, no 3, pp 285–295, Jul 1996, doi: 10.1007/BF02018081 [56] “PRIME PubMed | Lactoferrin: structure, function and applications.” https://wwww.unboundmedicine.com/medline/citation/18842395/Lactoferrin:_stru cture_function_and_applications_ (accessed Nov 22, 2020) 56 [57] B Iglesias-Figueroa, N Valdiviezo-Godina, T Siqueiros-Cendón, S Sinagawa-García, S Arévalo-Gallegos, and Q Rascón-Cruz, “High-Level Expression of Recombinant Bovine Lactoferrin in Pichia pastoris with Antimicrobial Activity,” Int J Mol Sci., vol 17, no 6, Jun 2016, doi: 10.3390/ijms17060902 [58] “Production of recombinant porcine Lactoferrin exhibiting antibacterial activity in methylotrophic yeast, Pichia pastoris - Abstract - Europe PMC.” https://europepmc.org/article/med/16088216 (accessed Nov 22, 2020) [59] “Recombinant human Lactoferrin expressed in glycoengineered Pichia pastoris: effect of terminal N-acetylneuraminic acid on in vitro secondary humoral immune response - Abstract Europe - PMC.” https://europepmc.org/article/med/18365311 (accessed Nov 22, 2020) [60] “Principles of Fermentation Technology - 2nd Edition.” https://www.elsevier.com/books/principles-of-fermentationtechnology/stanbury/978-0-08-036131-4 (accessed Nov 19, 2020) [61] Nguyễn Lân Dũng, “Vi sinh vật học”, Nhà sách Giáo dục Onlygol https://giaoducbookstore.com/products/vi-sinh-vat-hoc-nguyen-lan-dung (accessed Nov 19, 2020) [62] W Babel et al., Proteomics of Microorganisms 2004 [63] J A Bornhorst and J J Falke, “[16] Purification of proteins using polyhistidine affinity tags,” in Methods in Enzymology, vol 326, Academic Press, 2000, pp 245–254 [64] J Schmitt, H Hess, and H G Stunnenberg, “Affinity purification of histidinetagged proteins,” Mol Biol Rep., vol 18, no 3, pp 223–230, Oct 1993, doi: 10.1007/BF01674434 [65] E Hochuli, W Bannwarth, H Döbeli, R Gentz, and G D Stuber, “Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent,” Bio/Technology, Nov 1988, doi: 10.1038/nbt1188-1321 [66] R Janknecht, G de Martynoff, J Lou, R A Hipskind, A Nordheim, and H G Stunnenberg, “Rapid and efficient purification of native histidine-tagged protein 57 expressed by recombinant vaccinia virus,” Proc Natl Acad Sci U S A., vol 88, no 20, pp 8972–8976, Oct 1991, doi: 10.1073/pnas.88.20.8972 [67] M W Van Dyke, M Sirito, and M Sawadogo, “Single-step purification of bacterially expressed polypeptides containing an oligo-histidine domain,” Gene, vol 111, no 1, pp 99–104, Feb 1992, doi: 10.1016/0378-1119(92)90608-R [68] D C Kaslow and J Shiloach, “Production, Purification and Immunogenicity of a Malaria Transmission-Blocking Vaccine Candidate: TBV25H Expressed in Yeast and Purified Using Nickel-NTA Agarose,” Bio/Technology, vol 12, no 5, Art no 5, May 1994, doi: 10.1038/nbt0594-494 [69] J F White and R Grisshammer, “Automated Large-Scale Purification of a Recombinant G-Protein-Coupled Neurotensin Receptor,” Curr Protoc Protein Sci., vol 47, no 1, p 6.8.1-6.8.31, 2007, doi: https://doi.org/10.1002/0471140864.ps0608s47 [70] J Crowe, H Döbeli, R Gentz, E Hochuli, D Stüber, and K Henco, “6xHisNi-NTA chromatography as a superior technique in recombinant protein expression/purification,” Methods Mol Biol Clifton NJ, vol 31, pp 371–387, 1994, doi: 10.1385/0-89603-258-2:371 [71] D B Nikolov et al., “Crystal structure of TFIID TATA-box binding protein,” Nature, vol 360, no 6399, pp 40–46, Nov 1992, doi: 10.1038/360040a0 [72] N E David, M Gee, B Andersen, F Naider, J Thorner, and R C Stevens, “Expression and purification of the Saccharomyces cerevisiae alpha-factor receptor (Ste2p), a 7-transmembrane-segment G protein-coupled receptor,” J Biol Chem., vol 272, no 24, pp 15553–15561, Jun 1997, doi: 10.1074/jbc.272.24.15553 [73] A Skerra, “A general vector, pASK84, for cloning, bacterial production, and single-step purification of antibody Fab fragments,” Gene, vol 141, no 1, pp 79– 84, Apr 1994, doi: 10.1016/0378-1119(94)90131-7 [74] J Porath, J Carlsson, I Olsson, and G BeLFrage, “Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation,” Nature, vol 258, no 5536, Art no 5536, Dec 1975, doi: 10.1038/258598a0 [75] E Hochuli, H Döbeli, and A Schacher, “New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues,” J 58 Chromatogr., vol 411, pp 177–184, Dec 1987, doi: 10.1016/s00219673(00)93969-4 [76] G Chaga, J Hopp, and P Nelson, “Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+-carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle,” Biotechnol Appl Biochem., vol 29 ( Pt 1), pp 19–24, Feb 1999 59 ... mức độ tổng hợp protein tái tổ hợp cao đặc biệt Pichia pastoris có khả thực biến đổi sau dịch mã hoàn thiện protein tái tổ hợp Trong nghiên cứu này, sau có chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa Lactoferrin. .. tài: ? ?Nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận Lactoferrin tái tổ hợp từ P pastoris? ?? TỔNG QUAN 1.1 Cấu trúc, chức ứng dụng Lactoferrin Lactoferrin (LF) protein liên kết với sắt khơng có nhân hem thu? ??c... Lactoferrin nghiên cứu điều kiện thích hợp lên men P pastoris sinh tổng hợp Lactoferrin tái tổ hợp quy mơ bình tam giác, nhằm mục đích sản xuất lượng lớn lượng Lactoferin tái tổ hợp, tiến hành