Hoạt độ của chủng R0H1 trong các thời gian cấp dưỡng khác nhau đều có khoảng thời gian từ 13-15 giờ khá tương đồng. Từ kết quả trên Hình 3.6 nhận thấy hoạt độ cao nhất là trong phương án cấp dưỡng 5 giờ và đạt 351,43 + 8,57 FU/ml sau 22 giờ lên men. Phương án cấp dưỡng 7 giờ và 3 giờ đạt hoạt độ cao nhất lần lượt là 321,43 + 12,86 FU/ml và 254,90 + 8,58 FU/ml sau 20 giờ lên men.
Dựa vào những kết quả đã đạt được thì phương án cấp dưỡng trong khoảng thời gian là 5 giờ đem lại hiệu quả tốt nhất: OD 600nm đạt 37,6; mật độ tế bào đạt 7,9 x 109 CFU/ml và hoạt độ đạt 351,43 + 8,57 FU/ml tăng lần lượt 2,22 lần và 2,60 lần so với hoạt độ NK trong lên men theo mẻ trên thiết bị và trên bình tam giác. Kết quả nhóm nghiên cứu đã đạt được tương tự như một số kết quả đã được công bố như Cho và cộng sự (2010) [4] (tăng 2,1 lần) cùng với nhóm Liu và cộng sự (2019) [5] (tăng 3,1 lần).
3.3. Thu hồi nattokinase
Dịch lên men được ly tâm 10000 rpm, 10 phút, 4oC để loại bỏ sinh khối thu được dịch enzyme thô. NK sinh tổng hợp từ chủng R0H1 được thu hồi qua 2 bước lọc màng cut - off 0,2 µm và 10 kDa. Hoạt độ enzyme, nồng độ protein và hiệu suất thu hồi NK qua từng bước được biểu diễn dưới Bảng 3.1. Kết quảBảng 3.1 cho thấy enzyme được giữa trên màng 10 kDa có hoạt độ riêng tăng gấp 3 lần so với enzyme thô đầu vào. Quá trình thu hồi đạt hiệu suất là 89,7 ± 8,0 % được thể
hiện ở thông số tổng hoạt độ của dịch thu được đạt 524,55 FU so với ban đầu là 585,00 FU. Nồng độ protein sau khi tinh sạch còn 0,252 mg giảm 3,5 lần so với tổng protein ban đầu (0,911 mg), việc giảm mạnh nồng độ protein cho thấy lượng protein tạp là khá nhiều và chủ yếu có thước nhỏ hơn 10 kDa. Gần đây, nhóm nghiên cứu Tian và cộng sự (2018) đạt hiệu suất thu hồi 80% khi tinh sạch NK từ chủng from B. subtilis WB800N/pHT43-pro-aprN bằng phương pháp kết tủa muối và lọc dịng ngang [57]. Nhóm Tuấn và cộng sự (2015) cũng đã đạt hiệu suất thu hồi tương tự là 79% khi tinh sạch NK từ chủng B. subtilis pBG01-aprN/BD104 sử dụng phương pháp kết tủa muối và sau đó là sắc ký lọc gel [53]. Trong khi Xia và cộng sự (2005) cùng Xin và cộng sự (2019) đã đạt hiệu suất thu hồi NK tương ứng là 42,60% và 46,30% sau khi sử dụng phương pháp kết tủa muối và sắc ký lọc gel [65, 74]. Dựa vào đặc trưng của protein tái tổ hợp là có sự hiện diện của đoạn His - tag giúp cho quá trình tinh sạch dễ dàng hơn nhờ liên kết ái độ giữ đuôi His - tag với ion kim loại Niken hoặc Coban. Điển hình như NK từ chủng tái tổ hợp B. subtilis pHT01-aprN đã được thu hồi bằng phương pháp kết tủa muối sau đó là sắc
ký ái độ Ni-NTA và đã đạt hiệu suất là 65% [7]. Bên cạnh đó hiệu suất thu hồi 89,70% đã thu được cao hơn các nhóm nghiên cứu như Bora và cộng sự (2018) đạt 0,91% [55]; Hu và cộng sự (2019) đạt 12,73% [56]. Dựa vào hiệu suất thu hồi của các nhóm nghiên cứu đã đạt được có thể thấy hiệu suất thu hồi NK phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính của nguồn enzyme thơ đầu vào. Hiệu suất thu hồi NK được sinh tổng hợp từ chủng R0H1cao có thể liên quan đến đặc tính ban đầu của chủng mang gen B. subtilis 3NA được biết đến là chủng sản sinh ra lượng protease thấp [47].
Bảng 3.1 Hiệu suất thu nhận NK từ chủng B.subtilis R0H1
Các bước Tổng hoạt độ (FU) Tổng protein (mg) Hoạt độ riêng (FU/mg)
Hệ số thu nhận Hiệu suất (%) Enzyme thô 585,00 ± 5,00 0,911 ± 0,050 642,21 ± 41,07 1 ± 0 100 ± 1 Dịch qua màng 0,2 µm 556,87 ± 26,29 0,816 ± 0,007 682,52 ± 37,97 1,10 ± 0,02 95,2 ± 5,0 Dịch không qua màng 10 KDa 524,55 ± 39,67 0,252 ± 0,005 2082,23 ± 36,42 3,20 ± 0,19 89,7 ± 8,0
Sự thay đổi dải protein qua các bước thu hồi được thể hiện qua kết quả chạy điện di SDS - PAGE dưới Hình 3.7A. Từ kết quả nhận thấy ngay ở dịch enzyme thô chỉ xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước khoảng 28 kDa (giếng số 1),
cũng tương tự kích thước của enzyme kỹ thuật ở giếng 3. Kích thước NK từ chủng R0H1 tương tự như kích thước NK tái tổ hợp là 28 kDa đã được phân bố như Weng và cộng sự (2009) [52], Trần Quốc Tuấn và cộng sự (2015) [53], Tian và cộng sự (2019) [57], Purwaeni và cộng sự (2020) [59] cùng với nhóm Zhang và cộng sự (2020) [7].
A B
Hình 3.7 A. giếng 1 - enzyme thơ, giếng 2 - enzyme qua màng 0,2 µm và giếng 3 - enzyme kỹ thuật, giếng 4 - marker, B. Điện di sản phẩn giữa NK và fibrinogen
trong đó giếng 1 - Marker, giếng 2 - fibrinogen, giếng 3 - 8 là sản phẩm phản ứng fibrinogen với NK sau 5 - 10 - 30 giây và 1 - 10 - 60 phút
Fibrinogen là protein huyết tương hịa tan có kích thước 340 kDa. Fibrinogen được cấu tạo từ 3 chuỗi α, β và γ bởi các cầu nối disulfiel [75]. Các chuỗi của fibrinogen từ huyết tương bị có kích thước tương ứng 63,5 kDa, 56 kDa và 47 kDa (https://www.sigmaaldrich.com). Thời gian phản ứng giữa NK và fibrinogen sẽ quyết định phổ sản phẩm sinh ra. Kết quả chạy điện di SDS - PAGE theo dõi phổ sản phẩm của quá trình NK thủy phân fibrinogen được thể hiện trên Hình 3.7 B. Từ kết quả thấy chỉ sau 5 giây phản ứng, kích thước phân tử của protein đã có sự thay đổi, 2 chuỗi α và β có kích thước 63,5 và 56 kDa gần như bị phân hủy hoàn tồn và phổ sản phẩm có kích thước nằm trong khoảng 11- 48 kDa. Như vậy NK từ chủng R0H1 thủy phân lần lượt các chuỗi α, β và sau cùng là γ, thời gian để thủy phân hoàn toàn chuỗi α, β và γ là 5 giây, 10 phút và 60 phút. Kết quả của nhóm nghiên cứu phù hợp với các bài báo đã được công bố như sự phân hủy fibrinogen từ chủng B. subtilis BD104 [53] và B. subtilis [76].
3.4. Một số đặc tính của nattokinase
3.4.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NK từ chủng R0H1 được biểu diễn dưới Hình 3.8.