Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ nattokinase được định nghĩa là lượng enzym xúc tác thuỷ phân fibrin tạo thành lượng sản phẩm tương ứng với 1 µg tyrosine trong 1 phút ở nhiệt độ 37oC, pH 7,4 [4].
Nguyên tắc: NK thủy phân fibrin thành những đoạn peptid nhỏ và lượng sản phẩm được đo ở độ hấp phụ 275 nm.
Chuẩn bị mẫu đo hoạt độ Nattokinase: Dịch lên men được ly tâm ở 10000rpm trong 10 phút ở điều kiện 4oC. Sau khi ly tâm tách sinh khối dịch enzyme được pha loãng bằng dịch đệm Tris-HCl pH 7,4.
Tỷ lệ trong 1 phản ứng: 150 µl cơ chất, 420 µl đệm, 30 µl enzyme, 300 µl TCA tổng thể tích là V = 900 µl.
Quy trình đo hoạt tính:
Mẫu thí nghiệm Mẫu kiểm chứng
150 µl fibrin + 420 Tris- CaCl2
Vortex, ủ 37oC, 10 phút
150 µl fibrin + 420 Tris-CaCl2 Vortex, ủ 37oC, 10 phút
Thêm 30 µl, vortex nhanh đặt lại vào 37oC
Thêm 300 µl TCA vortex, thêm 30 µl, vortex nhanh đặt lại vào 37oC
Thời gian phản ứng 30 phút
Thêm 300 µl TCA vortex Ly tâm 12000 rpm/10 phút/ 4oC Ủ 37oC 20 phút
Ly tâm 12000 rpm/10 phút/ 4oC
Đo quang 275 nm (A) Đo quang 275 nm (Ao) Cơng thức tính hoạt độ enzyme
𝐹𝑈 =(𝐴 − 𝐴𝑜). 𝐷. 𝑉 𝑎. 𝑡. 𝑣
Trong đó:
FU- Hoạt độ của NK (FU/mL) D- Hệ số pha loãng enzym
t - Thời gian diễn ra phản ứng (phút) A - Giá trị OD của mẫu thí nghiệm Ao - Giá trị OD của mẫu kiểm chứng v - Lượng Enzym dùng phản ứng (mL) V- Tổng thể tích phản ứng (mL)
a- Độ tăng độ hấp thụ ở bước sóng 275nm ứng với tăng nồng độ tyrosine 1µg/mL.
2.2.3. Điện di SDS-Page
Nguyên tắc: sử dụng sodium dodecyl sulfate (SDS), β mecarptorthanol và nhiệt độ để biến tính protein về cấu trúc bậc 1 và mang điện tích âm tỷ lệ với kích thước, nhờ vậy protein sẽ di chuyển từ cực âm xuống cực dương dựa trên kích thước của chúng [71].
Phương pháp tiến hành: Đổ gel 12%
Gel tách (5 ml) 12% Gel cô (2 ml) 4%
H2O 2,145 ml 1,26 ml Acrylamide 40% 1,5 ml 0,2 ml Tris-HCl pH 8,8 1,25 ml Tris-HCl pH 6,8 0, 5 ml SDS 10% 50 µl 20µl APS 10% 50 µl 20 µl Temed 5 µl 4 µl
Hút 30 µl dịch enzyme với 10 µl dye 4X, hít nhiệt 99oC 5 phút, cắm đá 5 phút. Load 10 µl mẫu vào mỗi giếng
Chạy điện di 15 mA (2 – 3 giờ) Nhuộm 1-3 giờ
Tẩy 1-2 giờ.
2.2.4. Đo nồng độ protein.
Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford [72].
Hút 790 µl nước deion vào ống efpendoff 1,5 ml. Thêm 10 µl dung dịch cần đo nồng độ protein, vortex đều. Bổ sung 200 µl dung dịch Bradford 1 X, vortex. Ủ 10 phút tại nhiệt độ phịng trong bóng tối. Mẫu đo ở bước sóng 595 nm.
2.2.5. Xác định mật độ tế bào.
Mật độ tế bào được xác định bằng cách trải 100 µl canh trường đã được pha
loãng 106 và 107 lần và lặp trên 2 đĩa LBWC agar để lấy sai số. Mật độ tế bào = 𝐴.𝐷.1000
100 (CFU/ml)
Trong đó: A là số tế bào trên đĩa D là hệ số pha hoãng
2.2.6. Phương pháp sai số
Các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 2 lần để lấy sai số. Sai số được thực hiện trên Excel.
2.3. Phương pháp thí nghiệm