Để khảo sát khả năng hoạt động của NK khi điều trị bệnh CVD, NK đã được đánh giá độ ổn định tại các pH khác nhau như pH dạ dày (2,5), pH máu (7,4) và pH ruột (8,5). Kết quả biểu diễn trên Hình 3.11 cho thấy sự bất hoạt nhanh chóng của NK từ chủng R0H1 chỉ sau 30 phút tại pH 2,5. Sự mất hoàn toàn hoạt độ của NK tại pH thấp từ 2 - 4 đã được báo cáo với NK từ Rhizopus chinensis 12 [65], B.
subtilis natto B-12 [61], B. subtilis natto [80]. Tuy nhiên hoạt tính của NK giảm
khơng đáng kể tại pH 7,4 và 8,5 sau 5 giờ ủ tại 37oC.
3.4.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và chất ức chế đến hoạt độ enzyme
Hoạt độ enzyme khi có mặt của ion kim loại hoặc chất ức chết được thể hiện dưới Bảng 3.2
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của ion kim loại và chất ức chế đến hoạt độ NK
Ion kim loại and chất kìm hãm Hoạt độ tương đối (%)
Nồng độ 1 mM Nồng độ 5mM None 100 ± 1 100 ± 1 Na+ 109 ± 6 98 ± 6 Mg2+ 116 ± 4 103 ± 4 Mn2+ 100 ± 2 53 ± 2 K+ 100 ± 0 95 ± 0 Zn2+ 74 ± 5 38 ± 5 Co2+ 73 ± 2 0 ± 0 Fe2+ 46 ± 0 0 ± 0 Ca2+ 115 ± 4 113 ± 4 Cu2+ 87 ± 2 85 ± 1 EDTA 101 ± 4 88 ± 4 SDS 49 ± 6 22 ± 0
Kết quả trên Bảng 3.2 cho thấy hoạt độ của enzym được tăng lên tới 109 %, 115 % và 116 % khi có mặt Na+, Ca2+ và Mg2+ tương ứng ở 1 mM. Tuy nhiên, việc tăng thêm nồng độ của ion lên 5mM không cải thiện hoạt độ của enzyme. Các tác nhân khác như Mn2+ (1mM), K+ (1 - 5 mM), EDTA (1 - 5 mM) và Na+ (1 - 5 mM) hầu như không ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động của nattokinase. Ngồi ra, enzyme cịn bị ức chế bởi Co2+, Zn2+, Cu2+ và SDS. Sự hiện diện của các ion hoặc chất ức chế này dẫn đến sự mất hoạt tính của enzym, hoạt độ enzyme đạt từ 13 - 78 % tùy thuộc vào nồng độ ion/chất ức chế. Tác động của ion kim loại và chất ức chế lên hoạt độ của NK phần nào phù hợp với một số kết quả đã được công bố trước đây. Nhóm Xin và cộng sự (2018) đã báo cáo hoạt độ của NK từ chủng
Bacillus tequilensis (No. 11462) đạt 86 % khi có mặt 5 mM Cu2+ [54]. Chang và
cộng sự (2012) cũng đã cơng bố khơng có ảnh hưởng nào của các ion kim loại như K+, Na+, Ca2+, Mg2+ and Zn2+ lên hoạt độ của NK từ đậu đỏ lên men bởi chủng B.
subtilis [80]. Trong các kết quả đã được cơng bố, có vẻ như ảnh hưởng của ion kim
loại lên hoạt độ NK vẫn chưa được thống nhất. Ví dụ như ion Fe2+ ở nồng độ 5 mM được chứng minh là ion làm tăng hoạt độ NK từ chủng B. subtilis TKU007 [62], nhưng kết luận ngược lại đã được công bố đối với NK từ chủng B. subtilis Natto B-12 [61] và chủng B. subtilis DC27 [56]. Tương tự, những công bố mâu thuẫn về ảnh hưởng của Zn2+ và Cu2+ đối với hoạt độ NK đã được báo cáo. Grap và cộng sự (2014) đã nhận thấy hoạt độ NK từ chủng Bacillus natto (NRRL B-
3666) tăng thêm 8 % khi có mặt 5 mM Zn2+ hoặc Cu2+ [69]. Mặt khác, hoạt độ NK từ chủng Bacillus tequilensis (No. 11462) bị giảm 15 % so với hoạt độ khi khơng có mặt của 2 ion này [54]. Ngồi ra NK tư chủng B. subtilis BD104 đã tăng hoạt độ gấp 1,72 lần khi có mặt 5 mM Zn2+, trong khi đó sự có mặt 5 mM Cu2+ làm giảm hoạt độ 20 %. [53]
3.4.4. Một số thông số động học phản ứng enzyme
Các thông số động học của NK từ chủng B. subtilis R0H1 được xác định từ tốc độ phản ứng ở các nồng độ cơ chất khác nhau. Biểu đồ Lineweaver - Bur Hình 3.12 cho thấy điểm chặn y ở vị trí 1/V là 148,96 (phút/µmol) và điểm chặn x ở vị trí 1/S là -0,33 (L/mmol). Các giá trị của Km và Vmax được tính tốn từ dữ liệu thu được tương ứng là 3,08 mM và 6,70 nmol/phút. Khi Km thu được giá trị thấp, điều đó cho thấy NK có ái độ với fibrin cao. Grap và cộng sự (2014) đã báo cáo giá trị Km và Vmax của NK từ chủng Bacillus natto NRRL B - 366 với cơ chất được sử
dụng là N - Succinyl - Ala - Ala - Pro - Phe - p - nitro - anilide (S - 7388) đạt tương ứng 3,50 mM và 1250 nmol/phút.