Dịch enzyme thô thu được bằng cách ly tâm dịch lên men 10000 rpm, 4oC, 10 phút. NK được thu hồi qua 2 bước:
+ Bước 1: lọc màng 0,2 µm, thu dịch qua màng.
+ Bước 2: lọc màng 10 kDa cut-off, 7500 rpm, 4oC, 30 phút. Thu dịch không qua màng (enzyme tinh sạch).
Đo hoạt độ và nồng độ protein qua các bước thu hồi.
Điện di mẫu enzyme thơ, dịch qua màng 0,2 µm và dịch trên màng 10 kDa.
2.3.6. Một số đặc tính của nattokinase
2.3.6.1. pH tối ưu và độ bền pH
pH tối ưu:
Đệm phản ứng enzyme Tris-HCl được điều chỉnh pH lần lượt đạt 6 - 7,4 - 8 - 8,5 đệm Na2CO3 - NaHCO3 có pH là 9 - 9,5 - 10.
Đo hoạt độ enzyme bằng các đệm đã điều chỉnh pH. So sánh hoạt độ enzyme tại các pH khác với hoạt mức tại pH tối ưu.
Độ bền pH:
pH của dịch enzyme được điều chỉnh về 2,5 (pH dạ dày), 7,4 (pH máu), 8,5 (pH ruột). Đo hoạt độ enzyme còn lại sau 30 phút - 5 giờ. So sánh hoạt độ enzyme với hoạt độ enzyme không chỉnh pH.
Hoạt độ tương đối (%) là tỷ lệ giữa hoạt độ của NK tại các điều kiện phản ứng khác (nhiệt độ, pH) trên hoạt độ của NK tại điều kiện phản ứng tối ưu.
2.3.6.2. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu
Phản ứng enzyme được thực hiện từ 30 - 75oC. So sánh hoạt độ enzyme được đo ở các nhiệt độ khác so với hoạt độ ở nhiệt độ tối ưu.
Độ bền nhiệt độ
Enzyme được bảo quản ở dải nhiệt độ 30 - 40 - 50 - 60 - 70 - 80oC. So sánh hoạt độ enzyme với enzyme ban đầu.
2.3.6.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và chất kìm hãm
Đệm phản ứng (Tris-HCl) được thêm các ion kim loại với hàm lượng 1 - 5 mM. Đo hoạt độ enzyme, so sánh với hoạt độ enzyme khi đo với đệm khơng có mặt các ion kim loại.
2.3.6.4. Km & Vmax
Hoạt độ NK được xác định dựa trên phản ứng giữa NK và fibrin (0,25 - 4 g/l). phản ứng được thực hiện tại nhiệt độ 37oC, pH 7,4 và hoạt độ NK là 31,8 FU/ml. Đồ thị Weaver-Burk được tạo ra cho 1 / S so với 1 / v. Bằng cách sử dụng giá trị chặn và độ dốc của đồ thị này, hằng số Michaelis-Menten (Km) và vận tốc tối đa (Vmax) đã được tính tốn.
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lên men theo mẻ
Chủng R0H1 đã được lên men trên bình tam giác với mơi trường tối ưu (kết quả đồ án tốt nghiệp đại học). Để nâng quy mơ lên men nhằm mục đích tăng khả năng sinh tổng hợp NK, chủng R0H1 đã được lên men trên thiết bị lên men 2 L với thể tích 1 L môi trường. Kết quả thu được từ mẻ lên men 1 L sẽ được so sánh với bình tam giác. Dưới đây là kết quả lên men chủng R0H1 trên bình tam giác Hình 3.1.
Hình 3.1: Sinh trưởng của chủng R0H1 trên bình tam giác 500 ml.
Từ Hình 3.1 cho thấy pha tăng trưởng của chủng bắt đầu từ 2 giờ và kết thúc 9 giờ lên men và đạt OD cao nhất là 10,17 tại thời điểm 9 giờ lên men. Từ đồ thị biết được chủng R0H1 sinh tổng hợp NK cao nhất đạt 135,5 ± 7,5 FU/ml tại thời điểm 14 giờ lên men.
Các thông số: mật độ quang (OD 600 nm), pH, PO2 theo thời gian lên men của chủng R0H1 trên thiết bị 2 L và hoạt độ NK được biểu diễn dưới Hình 3.2
Hình 3.2: Sinh trưởng của chủng R0H1 trên thiết bị lên men 2 L
Từ Hình 3.2 cho thấy 3 tiếng đầu là q trình thích nghi của chủng, pha log kéo dài từ 3 - 9 giờ, pha cân bằng 4 giờ, OD 600nm đạt 14,79 ± 0,04 sau 13 giờ lên men. pH trong q trình sinh trưởng của chủng khơng thay đổi q nhiều, tăng từ 6,2 lên 8,3 sau 14 giờ lên men. DO giảm xuống dưới 20% sau 4 giờ lên men và đến pha cân bằng DO bắt đầu tăng dần. Hoạt độ NK đạt 158,0 ± 1,4 FU/ml sau 13 giờ lên men cũng là tại thời điểm cuối pha cân bằng (5 giờ kể từ thời điểm kết thúc pha log).
Chủng R0H1 sau khi lên men trên thiết bị 2 L với yếu tố như lên men trên bình tam giác nhận thấy. Sau 7 giờ lên men chủng đều đạt OD 600 nm khoảng 10. Tuy nhiên đồi với thiết bị bình tam giác chủng bắt đầu phát triển chậm và bắt đầu vào pha cân bằng. Trong khi đối với thiết bị lên men thì pha log của chủng vẫn tăng. có vẻ như yếu tố oxi là một yếu tố quan trọng trong quá trình sinh trưởng của chủng R0H1. Sinh trưởng của chủng trên bình tam giác và thiết bị lên men đều cho thấy cuối pha log là 9 giờ sau khi lên men. Chủng R0H1 lên men trong bình tam giác OD 600 nm là 10,17 ± 0,53 và hoạt độ đạt 135,50 ± 7,5 FU/ml còn trên thiết bị lên men là 14,35 và 158,00 FU/ml tăng gấp 1,4 lần và 1,2 lần tương ứng với OD 600 nm và hoạt độ. Từ kết quả đã đạt được cho thấy hoạt độ NK của chủng R0H1 tăng tương ứng với việc tăng sinh khối của chủng. Dựa vào yếu tố này, phương pháp lên men có bổ sung cơ chất theo hàm số mũ được nhóm nghiên cứu sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.3: Tốc độ sinh trưởng của chủng R0H1 trong pha tăng trưởng
Hệ số tốc độ sinh trưởng của chủng được xác định µ=0,24 (h-1).
3.2. Lên men có cấp dưỡng
Chủng R0H1 được lên men với kỹ thuật lên men cấp dưỡng theo hàm số mũ. Với các thông số đã được xác định như hệ số tốc độ sinh trưởng µ = 0,24 (h-1), thời gian bắt đầu cấp dưỡng là 6 giờ kể từ khi bắt đầu lên men, nồng độ cơ chất Tryptone ln duy trì 30 g/L trong pha sinh trưởng. Dưới đây là kết quả OD 600nm (Hình 3.4), mật độ tế bào (Hình 3.5) và hoạt độ NK (Hình 3.6) của chủng R0H1 theo thời gian lên men.
Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng của chủng R0H1 theo phương án cấp dưỡng
Từ kết quả Hình 3.4 nhân thấy trong vịng 10 giờ đầu đường cong sinh trưởng của chủng trong 3 thí nghiệm cấp dưỡng gần như giống nhau. Sau 10 giờ lên men chủng bắt đầu sinh trưởng khác nhau như sau:
Trong phương án cấp dưỡng trong vòng 5 giờ từ 6 giờ đến 11 giờ lên men thì sau 5 giờ kể từ khi kết thúc quá trình cấp dưỡng chủng mới bắt đầu vào pha cân bằng. Cịn trong phương án cấp 3 giờ thì khi kết thúc quá trình cấp dưỡng pha log vẫn phát triển thêm 3 giờ nữa. Thêm vào đó ở phương án cấp dưỡng 7 giờ lại cho kết quả hồn tồn khác, sau khi kết thúc q trình cấp dưỡng thì cũng là thời điểm kết thúc pha log của chủng. Có thể thấy rằng khi tăng thời gian cấp dưỡng lên 7 giờ khơng giúp cho q trình sinh trưởng của chủng tốt hơn so với cấp dưỡng 5 giờ.
OD 600nm đạt cực đại lần lượt là 26,4 ± 0,2; 37,6 ± 0,0; 31,7 ± 0,0 trong các khoảng thời gian cấp dưỡng tương ứng là 3, 5, 7 giờ. Như vậy trong 3 khoảng thời gian cấp dưỡng đã được khảo sát thì phương án 5 giờ đem lại hiệu quả trong quá trình sinh trưởng của chủng R0H1 là tốt nhất.
Ngoài ra mật độ tế bào sống cũng được xác định bằng cách trải canh trường trên môi trường LBWC sau 4, 8, 12, 16, 20 và 24 giờ lên men. Kết quả mật độ tế bào (CFU/ml) cao nhất của mỗi mẻ được biểu diễn dưới Hình 3.5.
Hình 3.5 Mật độ tế bào CFU/ml theo phương án cấp dưỡng
Kết quả trải mật độ trên các phương án thí nghiệm được hiển thị trên Hình 3.5. Kết quả mật độ tế bào tại phương án cấp dưỡng trong vòng 5 giờ là tốt nhất, đạt 790 ± 4 (x107 CFU/ml) sau 16 giờ lên men. Trong khi thời gian cấp dưỡng là 3 giờ và 7 giờ thì mật độ cao nhất đạt 550 ± 4,5 (x107 CFU/ml) sau 12 giờ và 250 ± 3,5 (x107 CFU/ml) sau 8 giờ lên men. Kết quả cho thấy mặc dù ở phương án cấp dưỡng trong vòng 3 giờ đạt mật độ tế bào cao hơn so với 7 giờ nhưng sự thối hóa của
phương án 3 giờ lại nhanh hơn. Điều đó được chúng minh là sau 20 giờ ở cả 2 phương án 3 và 7 giờ đều có mật độ tế bào tương đường nhau.
Hoạt độ được theo thời gian lên men của chủng được biểu diễm dưới Hình 3.6 dưới đây:
Hình 3.6: Hoạt độ NK từ chủng R0H1 theo phương án cấp dưỡng
Hoạt độ của chủng R0H1 trong các thời gian cấp dưỡng khác nhau đều có khoảng thời gian từ 13-15 giờ khá tương đồng. Từ kết quả trên Hình 3.6 nhận thấy hoạt độ cao nhất là trong phương án cấp dưỡng 5 giờ và đạt 351,43 + 8,57 FU/ml sau 22 giờ lên men. Phương án cấp dưỡng 7 giờ và 3 giờ đạt hoạt độ cao nhất lần lượt là 321,43 + 12,86 FU/ml và 254,90 + 8,58 FU/ml sau 20 giờ lên men.
Dựa vào những kết quả đã đạt được thì phương án cấp dưỡng trong khoảng thời gian là 5 giờ đem lại hiệu quả tốt nhất: OD 600nm đạt 37,6; mật độ tế bào đạt 7,9 x 109 CFU/ml và hoạt độ đạt 351,43 + 8,57 FU/ml tăng lần lượt 2,22 lần và 2,60 lần so với hoạt độ NK trong lên men theo mẻ trên thiết bị và trên bình tam giác. Kết quả nhóm nghiên cứu đã đạt được tương tự như một số kết quả đã được công bố như Cho và cộng sự (2010) [4] (tăng 2,1 lần) cùng với nhóm Liu và cộng sự (2019) [5] (tăng 3,1 lần).
3.3. Thu hồi nattokinase
Dịch lên men được ly tâm 10000 rpm, 10 phút, 4oC để loại bỏ sinh khối thu được dịch enzyme thô. NK sinh tổng hợp từ chủng R0H1 được thu hồi qua 2 bước lọc màng cut - off 0,2 µm và 10 kDa. Hoạt độ enzyme, nồng độ protein và hiệu suất thu hồi NK qua từng bước được biểu diễn dưới Bảng 3.1. Kết quảBảng 3.1 cho thấy enzyme được giữa trên màng 10 kDa có hoạt độ riêng tăng gấp 3 lần so với enzyme thơ đầu vào. Q trình thu hồi đạt hiệu suất là 89,7 ± 8,0 % được thể
hiện ở thông số tổng hoạt độ của dịch thu được đạt 524,55 FU so với ban đầu là 585,00 FU. Nồng độ protein sau khi tinh sạch còn 0,252 mg giảm 3,5 lần so với tổng protein ban đầu (0,911 mg), việc giảm mạnh nồng độ protein cho thấy lượng protein tạp là khá nhiều và chủ yếu có thước nhỏ hơn 10 kDa. Gần đây, nhóm nghiên cứu Tian và cộng sự (2018) đạt hiệu suất thu hồi 80% khi tinh sạch NK từ chủng from B. subtilis WB800N/pHT43-pro-aprN bằng phương pháp kết tủa muối và lọc dịng ngang [57]. Nhóm Tuấn và cộng sự (2015) cũng đã đạt hiệu suất thu hồi tương tự là 79% khi tinh sạch NK từ chủng B. subtilis pBG01-aprN/BD104 sử dụng phương pháp kết tủa muối và sau đó là sắc ký lọc gel [53]. Trong khi Xia và cộng sự (2005) cùng Xin và cộng sự (2019) đã đạt hiệu suất thu hồi NK tương ứng là 42,60% và 46,30% sau khi sử dụng phương pháp kết tủa muối và sắc ký lọc gel [65, 74]. Dựa vào đặc trưng của protein tái tổ hợp là có sự hiện diện của đoạn His - tag giúp cho quá trình tinh sạch dễ dàng hơn nhờ liên kết ái độ giữ đuôi His - tag với ion kim loại Niken hoặc Coban. Điển hình như NK từ chủng tái tổ hợp B. subtilis pHT01-aprN đã được thu hồi bằng phương pháp kết tủa muối sau đó là sắc
ký ái độ Ni-NTA và đã đạt hiệu suất là 65% [7]. Bên cạnh đó hiệu suất thu hồi 89,70% đã thu được cao hơn các nhóm nghiên cứu như Bora và cộng sự (2018) đạt 0,91% [55]; Hu và cộng sự (2019) đạt 12,73% [56]. Dựa vào hiệu suất thu hồi của các nhóm nghiên cứu đã đạt được có thể thấy hiệu suất thu hồi NK phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính của nguồn enzyme thơ đầu vào. Hiệu suất thu hồi NK được sinh tổng hợp từ chủng R0H1cao có thể liên quan đến đặc tính ban đầu của chủng mang gen B. subtilis 3NA được biết đến là chủng sản sinh ra lượng protease thấp [47].
Bảng 3.1 Hiệu suất thu nhận NK từ chủng B.subtilis R0H1
Các bước Tổng hoạt độ (FU) Tổng protein (mg) Hoạt độ riêng (FU/mg)
Hệ số thu nhận Hiệu suất (%) Enzyme thô 585,00 ± 5,00 0,911 ± 0,050 642,21 ± 41,07 1 ± 0 100 ± 1 Dịch qua màng 0,2 µm 556,87 ± 26,29 0,816 ± 0,007 682,52 ± 37,97 1,10 ± 0,02 95,2 ± 5,0 Dịch không qua màng 10 KDa 524,55 ± 39,67 0,252 ± 0,005 2082,23 ± 36,42 3,20 ± 0,19 89,7 ± 8,0
Sự thay đổi dải protein qua các bước thu hồi được thể hiện qua kết quả chạy điện di SDS - PAGE dưới Hình 3.7A. Từ kết quả nhận thấy ngay ở dịch enzyme thô chỉ xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước khoảng 28 kDa (giếng số 1),
cũng tương tự kích thước của enzyme kỹ thuật ở giếng 3. Kích thước NK từ chủng R0H1 tương tự như kích thước NK tái tổ hợp là 28 kDa đã được phân bố như Weng và cộng sự (2009) [52], Trần Quốc Tuấn và cộng sự (2015) [53], Tian và cộng sự (2019) [57], Purwaeni và cộng sự (2020) [59] cùng với nhóm Zhang và cộng sự (2020) [7].
A B
Hình 3.7 A. giếng 1 - enzyme thô, giếng 2 - enzyme qua màng 0,2 µm và giếng 3 - enzyme kỹ thuật, giếng 4 - marker, B. Điện di sản phẩn giữa NK và fibrinogen
trong đó giếng 1 - Marker, giếng 2 - fibrinogen, giếng 3 - 8 là sản phẩm phản ứng fibrinogen với NK sau 5 - 10 - 30 giây và 1 - 10 - 60 phút
Fibrinogen là protein huyết tương hịa tan có kích thước 340 kDa. Fibrinogen được cấu tạo từ 3 chuỗi α, β và γ bởi các cầu nối disulfiel [75]. Các chuỗi của fibrinogen từ huyết tương bị có kích thước tương ứng 63,5 kDa, 56 kDa và 47 kDa (https://www.sigmaaldrich.com). Thời gian phản ứng giữa NK và fibrinogen sẽ quyết định phổ sản phẩm sinh ra. Kết quả chạy điện di SDS - PAGE theo dõi phổ sản phẩm của quá trình NK thủy phân fibrinogen được thể hiện trên Hình 3.7 B. Từ kết quả thấy chỉ sau 5 giây phản ứng, kích thước phân tử của protein đã có sự thay đổi, 2 chuỗi α và β có kích thước 63,5 và 56 kDa gần như bị phân hủy hồn tồn và phổ sản phẩm có kích thước nằm trong khoảng 11- 48 kDa. Như vậy NK từ chủng R0H1 thủy phân lần lượt các chuỗi α, β và sau cùng là γ, thời gian để thủy phân hoàn toàn chuỗi α, β và γ là 5 giây, 10 phút và 60 phút. Kết quả của nhóm nghiên cứu phù hợp với các bài báo đã được công bố như sự phân hủy fibrinogen từ chủng B. subtilis BD104 [53] và B. subtilis [76].
3.4. Một số đặc tính của nattokinase
3.4.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NK từ chủng R0H1 được biểu diễn dưới Hình 3.8.
Hình 3.8 Nhiệt độ tối ưu của enzyme nattokinase
Kết quả từ Hình 3.8 cho thấy hoạt độ enzyme được tăng đáng kể khi nhiệt độ tăng từ 30oC đến 55oC. Phản ứng tại nhiệt độ 55oC đem lại hoạt độ cao nhất cho NK và nó hồn tồn mất hoạt tính ở nhiệt độ 75oC. Nhiệt độ tối ưu của NK từ chủng R0H1 tương tự như NK tái tổ hợp của nhóm nghiên cứu Trần Quốc Tuấn và cộng sự (2015) [53], NK từ chủng B. subtilis IMR-NK1 [64]. Ngoài ra nhiệt độ tối ưu của NK từ chủng R0H1 cao hơn so với NK từ một số chủng như: Bacillus
cereus SRM-001(37oC) [63]; Bacillus subtilis natto B-12 [61], Bacillus subtilis
TKU007 [62] (40oC); Rhizopus chinensis 12 [65], Bacillus subtilis DC27 [56]
(45oC). Bên cạnh đó thấp hơn so với nhiệt độ tối ưu 60oC của NK từ chủng Bacillus
sp. B24 [77].
Độ bền NK tại các nhiệt độ khác nhau từ 30 - 80oC được hiển thị dưới Hình 3.9
Kết quả Hình 3.9 cho thấy tại nhiệt độ 60oC NK từ chủng R0H1 hoạt độ ổn định trên 80% sau 4 giờ. Khi nhiệt độ được tăng lên dẫn đến hoạt độ của NK giảm dần. Tại nhiệt độ 70oC, hoạt độ enzyme còn lại dưới 40% sau 5 giờ và NK từ chủng R0H1 hoàn toàn bất hoạt tại nhiệt độ 80oC sau 1 giờ. Nhóm Lin và cộng sự (2015)