DAI HOC QUOC GIA HÀ NỘI
TRUONG DAI HOC KHOA HOC TU NHIEN KHOA SINH HOC
: ^^
NGUYEN THI HAI HA be |
Am xui Yup |
NGHIEN CUU BIEU HIEN VA THU NHAN |
PROTEIN TAI TO HGP CUA VIRUS DENGUE TYP 1 DE CHE TAO BO SINH PHAM CHAN DOAN
SOT DENGUE/SOT XUAT HUYET DENGUE
Chuyên ngành : Di truyền học
Mã số :1.05.06 `
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS ĐINH DUY KHÁNG
Trang 2LOI CAM ON
Em xin bay tổ lịng biết ơn sâu sắc tới DG6.T6 Dinh Duy Kháng:
Dhịng Vi sinh vật học phân tử- Viện Cơng nghệ ổinh học- Viện Khoa học
và Cơng nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và hướng dan em hồn thành luận văn này
Trong thời gian nghiên cứu em đã nhận dược sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị cơng tác tại phịng Vi sinh vật học phân tử, đặc biệt là sự giúp dd cla CN Pham Minh Tuan Nhân dịp này em cũng xin cảm ơn những siúp đỡ quý báu đĩ
Em cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cơ giáo trong bộ mơn Di truyền học, cdc thay cơ giáo trong khoa Sinh hoc- Dai hoc Khoa hoe tu nhién - Dai học Quốc gia Hà Nội đã tận tỉnh dạy dỗ trong thời gian qua
Cuối cùng xin chân thành cảm ơn gia đỉnh, bạn bẻ đã luơn ỏ bên tơi, động viên và giúp đỡ tơi trong quá trình học tập và nghiên cứu
Hà Nội, ngày 27 tháng 12 năm 2OOG Học viên
Trang 3ADN ARN Amp BSA dNTP E.coli EDTA Elisa EtBr HCSD IPTG kDal SDS TAE WHO X-gal NHUNG TU VIET TAT Acid Deoxyribonucleic Acid Ribonucleic Ampicillin
Base pair (Cap bazo )
Bovine Serum Albumin (Albumin huyét thanh bị) Deoxynucleotide
Escherichia coli
Ethylen diamin tetraacetic acid
Enzyme Linked Immunosorbent Assay Ethidium bromide
Dengue shock syndrome (hội chứng sốc dengue) Isopropyl- beta- D- thiogalactopyranoside
Kilo Dalton
Mơi trường Lauria Betanin Optical density (mật độ quang)
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
Precursor membrane envelope Dengue fever (sốt dengue)
" Dengue hemorrhagic fever (sot xuat huyét dengue) Sodium Dodecyl Sulfate
Tris- Acetate- EDTA Tris- EDTA
Trang 4_MỤC LỤC 0710007 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU . «cccccvcttriz:crerrri 3
1.1 Bệnh sốt dengue/sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD) . <<- 3 1.1.1 Tình Hình dich B@ah ssssisssssssesssaswsensevevsnsanaveavcvsaveansevsaseveseccsseiesstesssecsedecaeere 3 1.1.2 Tình hình mắc bệnh trên thế giới ¿- ¿+ 555222252 +x+zcz<zc+zcs2 4 II v0 00/1227 .ŒdAd.A.H 6 1.1.4 Triệu chứng và chẩn đốn ¿2+5 255252 Sx+x2EErxerrxvrvrerrrrvrrxee 8 1.1.5 Điều trị và phịng chống .- - - 5+ s2 ST Hy 111111111 xe 14 1.2 Virus: dene Ue ư6656655656561161651566554655405566355465166656153558564863ã8686485488548356G38888566146164938046538638 18 1.2.1 Cấu trúc và thành phầhn - 5-55 tk * vn ve 18
1.2.2 Genome của virus {erigU€ + +5 + sxvsEEvrkrrreervrkrerkrerkrrr 19 1.2.3 Chu trình nhân lên và cơ chế gây bệnh của virus dengue 21
1.2.4 Đặc điểm kháng nguyên +2 5+Sxcx exrerrrtrrrrrkrkrrrrrrrrrrkrrrer 23 1.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong ƑZ.€0Ïi s- < <cscssceseesesseesessrsersee 23 1.3.1 Chủng E.coli biểu hiện protein tái tổ hợp -«-csecsccsccsrrsre 23
Trang 52.3 Phuong phap 2.3.1 Phương pháp khuyếch đại gen bang PCR .sseessseesesesesesescscsteeesseeseees 32 2.3.2 Phương pháp tao Ịng «sọ nH ng TT 32 2.3.3 Phương pháp giải trình tự gen . 5-6 S555 + 221gr 35
2.3.4 Phương pháp thiết kế vector biểu hiện trong E.coli 55+ 36
2.3.5 Phương pháp điện di trên gel agarose l?% -+-+<+<s+crereeree 37
2.3.6 Phương pháp biểu hiện gen trong #.cưÏi - -csc+ccccscvrvererrreerkee 38
2.3.7 Phương pháp điện di trên gel polyacrilamide - - -s+++++++2 38 2.3.8 Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni”” 40 2.3.9 Phương pháp Western bÌÏOf 5< 1 2119 22v ng ng tre 4I 2.310 PHưƯØïiE DPHáP Hút DĐ Gsexndesanranuantrenniitiaainidratiattiisitiin0810100015150318381555E 43
2.3.11 Phương pháp EILISA - - xsS S12 2171711117111 1 re 43
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ccecrrieeerre 45
3.1 Khuyếch đại đoạn gen E3 bằng cặp mồi biểu hiện 45
3.2 Kết quả tách chiết plÌasimi(d .- -<s<5<ss s99 9 01.A.0.10008.0.00 47 3.3 Kết quả cắt kiểm tra dịng plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn
BamH I va Xho T a 33560XESEESXEENESSWISESISEEKEISSS.SE53948 49
3.4 Tỉnh sạch plasmid tái tổ hợp - ssessesseesesseee 50
3.5 Thơi gen đoạn E3 và vector pET-TRX-EuS-E3 xử lý bằng
BamH T và Xho Ì e«es<<<ess<<<5 “ Wai aassnassansvsassnasscuessesenaseoeee 51 3.6 Trinh tự axit amin của vùng DIE3 ; ‘ 52 3.7.Chọn dịng plasmid tái tổ hợp pET-TRX-FuS-E3 - -«eeeseses 53 3.8 Biểu hiện protein E3 tái tổ hợp _ wee 54 3.9 Tỉnh sạch protein tái tổ hợp 4š5565188558380 vas 200 55
3.10 Kiém tra mức độ phản ứng của protein tái tổ hợp bằng kỹ thuật
Trang 63.11 Sử dụng protein tái tổ hợp để chẩn đốn các bệnh nhân nghỉ nhiễm virus
dengue bằng kỹ thuật Dot blot và Elisa 57
3.12 Tạo bộ sinh phẩm chẩn đốn bệnh SD/SXHD bằng Dot blot 60 3.13 Tinh chế và đĩng lọ 1.000ml] kháng nguyên tái tổ hợp dengue typ 1 dùng
trong chan đốn SD/SXHD bằng MAC-ELISA hoặc GAC-ELISA 62
KẾT LUẬN YÃ ĐỂ NGHỊ, « e- 22c,2 2802810 tngDmnmenmsam 64
TAT LIBU THAM KHAO csssssssccscccssnssossesssenssssonnssssoosssescccessesssannnsnaseseneeseeseee 65
Trang 7Luận văn cao học Nguyễn Thị Hải Hà
MỞ ĐẦU
Sốt dengue/Sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở người do 4 typ virus dengue (typ 1, typ 2, typ 3, typ 4) gây nên Tới năm 1997 virus dengue cùng với SD/SXHD đã được lan rộng trên phạm vi tồn thế giới, bệnh lan truyền chủ yếu do muéi Aedes aegypti (mudi van, mudi dém), thit yéu 1a Aedes albopictus va một số muỗi khác Theo Tổ chức Y tế thế giới, hàng năm cĩ khoảng 100 triệu trường hợp SD va 500.000 trường hợp SXHD, 25.000 trường hợp tử vong xảy ra trên thế giới, trong đĩ 90% mắc phải sốt xuất huyết là trẻ em dưới 15 tuổi [15, 18, 29, 32]
Trong 60 năm qua, sự tác động, sự phân bố và tính dữ dội của bệnh đã tăng một cách đột ngột Sự phát triển dân cư ở các nước nhiệt đới tạo ra nguồn vật chủ nhạy cảm với bệnh, bên cạnh đĩ sự thành thị hố khơng cĩ kế hoạch dẫn tới thiếu sự quản lý nguồn nước và nguồn chất thải đã cung cấp địa điểm cho ấu trùng muỗi phát triển đã làm bệnh SD/SXHD trở nên ngày càng trầm trọng Ở Đơng Nam Á, các trường hợp SXHD cĩ xu hướng ngày càng gia tăng Tình trạng tương tự như vậy cũng xảy ra ở các nước trung Mỹ và vùng
biển Caribe SXHD cĩ thể gây bệnh cảnh nguy kịch, hội chứng sốc dengue (HCSD) nhanh chĩng dẫn tới tử vong nếu khơng được chẩn đốn và điều trị
kịp thời Ở Việt Nam, các tỉnh phía Nam, đồng bằng sơng Hồng mà đặc biệt là các tỉnh đồng bằng sơng Cửu Long đang là điểm nĩng của dịch SD/SXHD
[20, 39, 48, 57]
Hiện nay vẫn chưa cĩ vaccine đặc hiệu để chống lại cả bốn typ dengue
nên phát hiện sớm và điều trị thích hợp là quan trọng để giảm bớt tỉ lệ tử vong
Trang 8oe Luận: văn cao học Nguyễn Thị Hải Hỏ + thích hợp và đưa ra những biện pháp phịng trừ phù hợp để tránh sự bùng phát dịch SD/SXHD [10, 32]
Protein vỏ (E) của virus dengue là kháng nguyên cực kỳ quan trọng đối
với các đáp ứng miễn dịch Kháng nguyên này nằm trên bề mặt của virus, vì
vậy chứa đựng phần lớn các quyết định kháng nguyên quan trọng tạo ra các kháng thể trung hồ virus dengue Chính vì vậy, chúng tơi chọn và tiến hành biểu hiện đoạn gen mã hố cho domain 3, tạo ra protein tái tổ hợp dùng cho
Kit chan đốn nhanh SD và SXHD bằng phương pháp Dot blot, Elisa để dần thay thế các phương pháp chẩn đốn truyền thống kém hiệu quả, đồng thời
thay thế các kit nhập ngoại cĩ giá thành cao [38, 49]
Nhằm phục vụ cho mục đích trên chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: "Nghiên cứu biểu hiện và thu nhận protein tái t6 hop cua virus dengue typ 1
để chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đốn sốt denguelsốt xuất huyết dengue”
Trang 9
Luan van cao hoe Nguyễn Thự Mỗi
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Bệnh sốt dengue/sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD)
1.1.1 Tình hình dịch bệnh
Dịch SD và SXHD được xác định và chính thức được thơng báo lần đầu
tiên vào năm 1953 ở Philippines, mặc dù đã cĩ những ghi nhận về những vụ
dịch SD kèm theo xuất huyết xảy ra ở Australia vào năm 1897, ở Hy Lạp năm
1928, ở Đài Loan năm 1931 Trong vịng 50 năm qua, với những nỗ lực phịng
chống và sự phát triển kinh tế đã làm giảm đáng kể sự đe dọa của dịch ở một
số nước Tuy vậy, những vụ dịch SD/SXHD trầm trọng van xảy ra ở nhiều nước khu vực Đơng Nam Á, Thái Bình Dương và vùng vịnh Caribe [22, 25]
Bệnh SD/SXHD trở thành một bệnh dịch lưu hành ở nước ta Bệnh khơng chỉ xuất hiện ở đơ thị mà cả vùng nơng thơn, nơi cĩ muỗi vectơ truyền bệnh Dịch lớn SD/SXHD
- bùng nổ theo chu ki
A khoảng 3-5 năm Năm
1998, trên tồn quốc bùng nổ vụ dịch lớn, số mắc bệnh và tử vong cao (mắc: 234.920 người, tử vong —_ 377 người, theo số liệu :_ của Viện VSDT)
Tuy mới xảy ra lần
- đầu tiên năm 1954 tai
Trang 10tuận văn cao học Nguyễn Thự Hội He nhi khoa quan trọng của nhiều vùng nhất là ở Đơng Nam Á và Tây Thái Bình Dương
Tỉ lệ nhiễm dengue trên tồn thế giới đã gia tăng mạnh mẽ trong những
năm gần đây Khơng chỉ cĩ số trường hợp mắc bệnh gia tăng mà khả năng
nhiễm nhiều typ dengue khác nhau cũng ngày càng đáng báo động (hình 1) 1.1.2 Tình hình mắc bệnh trên thế giới Bảng 1: Tình hình dịch bệnh dengue virus trên thế giới Quốc gia Số trường hợp mắc phải | Số tử vong Ngày nhận tin Campuchia - 38 9/2005 Costa Rica 19.000 1 7/9/2005 Ấn Độ 900 15 9/2005 Indonexia 80.837 1.099 7/2006 Malaysia 32.950 83 1/11/2005 Martinique 6.000 2 26/9/2005 Philippines 13.468 167 8/2006 Singapore 12.700 19 22/10/2005 Sri Lanka 3.000 - 16/9/2005 Thai Lan 31.000 58 9/2005 Viét Nam 20.000 28 4/10/2005 Céng hda Dominic | 3.000 30 9/2006 Australia 2 - 15/3/2006 Trung quốc 70 - 9/2006 a, Tình hình mắc bệnh dịch ở Đơng Nam Á
SXHD (với tỉ lệ bệnh khoảng 300- 440 trường hợp/100.000 người) là một nguyên nhân dẫn đầu của việc nằm viện của trẻ em ở Đơng Nam Á Trong khi tỉ
lệ này hiện nay giảm ở Thái Lan (95-103 trường hợp/100.000 người vào 1997),
Trang 11
Luận văn cao học Nguyễn Thị Hi He
các trường hợp chết ở hầu hết các quốc gia ở Đơng Nam Á cĩ giảm đi và hiện nay giảm ít hơn 1%, và tỉ lệ này ở một số thành phố vẫn vượt quá 4% [41, 60] b, Cuba
Vụ dịch dengue đầu tiên xảy ra ở Cuba vào năm 1977, sự lây lan tiếp diễn đến 1981 và cĩ hơn 500.000 trường hợp nhiễm SD (typ 1) được thơng
báo Vụ dịch thứ 2 xảy ra vào 1981, do virus dengue typ 2 làm cho 344.203 người mắc bệnh, trong đĩ cĩ 10.312 trường hợp SXHD/HCSD và 158 người (101 trẻ em và 57 người trưởng thành) tử vong [27]
c, Tình hình bệnh ở Châu Mỹ
Sự phân bố của dengue virus ở châu Mỹ tăng từ năm 1970, khơng chỉ
một mà cả 4 typ dengue đều được tìm thấy Trong thời gian đĩ cĩ vài quốc gia
khơng thấy thơng báo cĩ dịch, ví dụ Chile Nhung đến thế kỉ 20 thì những quốc gia ở vùng châu Mỹ đều thơng báo cĩ dịch [43]
đ, Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam
Mới bước vào đầu mùa mưa, bệnh SXHD đã xuất hiện ở khắp các tỉnh
phía Nam, đặc biệt nĩ hồnh hành đữ đội tại khắp 13 tỉnh thuộc khu vực đồng
bằng sơng Cửu Long Tính đến ngày 15/07/2006, người ta phát hiện 23.426 ca nhiễm bệnh, tăng 52% so với cùng kì năm ngối, trong đĩ cĩ 14 người thiệt mạng (tăng gấp đơi)
Theo nhận định của các nhà chuyên mơn thì khả năng SXHD sẽ bùng
phát thành dịch do mơi trường biến động, tạo điều kiện cho muỗi và bọ cĩ thể
phát triển nhanh Chính sự biến đổi của chủng virus làm cho sức đề kháng của nhiều người chưa kịp thời thích ứng khiến bệnh diễn biến vơ cùng phức tạp
Trong thời gian tới, SD/SXHD sẽ cịn là vấn đề nĩng bỏng trên thế giới
vì khả năng hiểu biết để phịng ngừa của người dân vẫn cịn thấp và sự tham gia một cách hời hợt cho cĩ lệ của chính quyền từ trung ương đến địa phương [8, 32]
Trang 12Luan van cao hoc Nguyen Thi Hei He về 4 Phân bố dengue trên thế giới từ năm 1961-1990
Hình 2 Sự phân bố dengue trên thế giới giai đoạn 1961-1990 (hình trên) và dự đốn sự phân bố dengue trên thế giới vào năm 2080 (hình dưới), sau khi nhiệt độ nĩng lên
Trong đĩ vùng màu xanh là vùng hâu như khơng cĩ sự lưu hành của virus dengue vùng màu đỏ là vùng cĩ sự lưu hành của virus dengue
Theo thơng báo của Viện Hàn lâm Khoa học quốc gia Mỹ, nhiệt độ bề
mặt trái đất đang ấm dần lên và điều này làm cho nhiều loại cơn trùng gây
bệnh xuất hiện, cĩ nghĩa nhiều bệnh lạ xuất hiện Thêm vào đĩ do sự thay đổi về khí hậu, nguồn nước, dân cư phát triển, sự thành thị hố khơng cĩ tổ chức
làm cho các bệnh truyền nhiễm tăng lên như sởi, sốt dengue Hình 2 là dự
báo về tình hình nhiễm bệnh dengue vào năm 2080 [33, 46, 56]
1.1.3 Muỗi Aedes aegypti a Sinh ly, sinh thai A aegypti
- Mu6i A aegypti xuất phát từ châu Phi rồi sang châu Mỹ, châu Á vào cuối thế kỉ 19 Lồi muỗi này trở nên thích ứng tốt và ngày càng phân bố sâu vào lục địa châu Á trước hết là các vùng thành thị Ở châu Á, đã xuất hiện quá
Trang 13luận văn cao học Nguyễn Thị Mã; /là
trình thay thế dân muéi A albopictus
trước sự xuất hiện của A 4egypii A aegypti phan bố chủ yếu ở các điểm dân cư và các thành phố thuộc miền duyên hải WHO đã đưa ra những hình ảnh về sự phân bố mở rộng của muỗi A zèypfi
ở và tổng kết cho rằng sự phân bố của
1“ chúng phù hợp với sự phân bố của bệnh
nhân SD/SXHD [5, 12, 55]
- Muỗi A zegypri gặp nhiều ở thành phố nên được gọi 1A mudi van
thành thị Muỗi cịn gặp ở các thị trấn dọc theo các trục đường giao thơng cĩ dân cư đơng đúc
- Muỗi A zlbopicius về hình thể rất giống muỗi A aegypti Sinh ly và sinh thái của mudi A albopictus tuong tu như muỗi A egypti, nhung mudi A Ibopictus phan bé chi yéu 6 ving nơng thơn, gặp ít ở ven thành phố
- Việt Nam nam trong vung phan b6 cua ca hai loai A aegypti va A albopictus, tuy nhiên sự phân bố của chúng ở những sinh cảnh và vùng địa lý
khác nhau cĩ khác nhau Gần đây trong báo cáo tại hội nghị quốc gia tổng kết
hoạt động phịng chống SD/SXHD cho biết muỗi A egypíi cĩ mặt ở cả 3 miền Bac, Trung, Nam [6, 8]
b Co ché lay truyén bénh dengue
Người nhiễm virus dengue do muỗi cái thuộc giống Aeđøs đốt Muỗi Aedes aegypri là vector truyền bệnh chủ yếu ở hầu hết các khu vực bệnh lưu hành Khi muỗi cái Aedes hút máu bệnh nhân nhiễm virus dengue, virus nay sẽ ủ bệnh trong cơ thể muỗi khoảng 8- 11 ngày Trong khoảng thời gian sống
cịn lại sau đĩ, muỗi cĩ nguy cơ truyền bệnh cho người Khi virus vào cơ thể người, chúng tuần hồn trong máu từ 2- 7 ngày Trong khoảng thời gian này
nếu muỗi Aedes hút máu thì virus được truyền cho muỗi Người là ổ chứa
Trang 14
Luan van cao hoc Nguyen Thi Hei He
virus chính mặc dù một số nhà khoa học cũng đưa ra giả thuyết rằng khỉ cũng cĩ thể là một ổ chứa mầm bệnh cần quan tâm [3, 22]
Z Muỗi ` Z Muỗi ua Muỗi
Khi TQT ——> Người TQT——> Người TQT
` Muỗi ⁄ ~ Muỗi ⁄ ` Muỗi ⁄
Rừng núi Nơng thơn/Bán thành thị Thành thị (TQT: Truyền qua trứng) Hình 4 Sơ đồ truyền bệnh của virus Dengue 1.1.4 Triệu chứng và chẩn đốn 1.1.4.1 Triệu chứng a, Đối tượng mắc bệnh
- SXHD là bệnh chủ yếu của trẻ em, nhất là ở những địa phương cĩ dịch
lưu hành nhiều năm, người lớn ít bị hơn do đã tiếp xúc và cĩ miễn dịch với nhiều typ virus dengue
- Lứa tuổi thụ bệnh cĩ xu hướng ngày càng nhỏ dần
- Khi địa phương lần đầu tiên cĩ dịch dengue thì lứa tuổi nào cũng cĩ thể mắc và bệnh cảnh thường là sốt dengue - Giới tính khơng khác nhau về tỷ lệ mắc bệnh b, Triệu chứng lâm sàng s* SD (dengue cổ điển) - Nung bệnh: từ 3-15 ngày
- Khởi phát: những biểu hiện lâm sàng phụ thuộc lứa tuổi - Tồn phát: sốt cao 39- 40°C, kèm theo các triệu chứng s Sốt xuất huyết dengue
+ Lâm sàng sốt xuất huyết dengue khơng sốc (SXHD)
Trang 15
luận vấn cao học Nguyễn Thị Mữi Hà
e_ Hội chứng nhiễm trùng: sốt cao đột ngột, nhiệt độ 39- 40°C, sốt kéo
dài 2- 7 ngày, sốt kèm theo các triệu chứng như: mệt mỗi, chán ăn, đau bụng ở thượng vị hoặc hạ sườn phải, đơi khi nơn, gan to (ở trẻ em hay gặp hơn người lớn), đơi khi da xung huyết hoặc cĩ phát ban
e Hội chứng thần kinh: đau người, đau cơ, đau khớp, nhức đầu, đau
quanh hố mắt, trẻ em nhỏ sốt cao, đơi khi co giật, hốt hoảng, khơng cĩ biểu hiện màng não
e_ Hội chứng xuất huyết: thường xuất hiện vào ngày thứ 2 của bệnh Trường hợp khơng cĩ xuất huyết thì cĩ dấu hiệu dây thất dương tính
+ Sốt xuất huyết dengue cĩ sốc: hội chứng sốc dengue (HCSD)
Khi bị SXHD cần theo dõi sốc là biến chứng nặng dễ đưa đến tử vong Do đĩ phải thường xuyên theo dõi huyết áp, mạch, nhiệt độ, hematocrit, số
lượng nước tiểu 1.1.4.2 Chẩn đốn
Chẩn đốn nguyên nhân là cực kì quan trọng và cần thiết nếu xét trên phương diện sức khoẻ cộng đồng nhưng lại tỏ ra khơng cần thiết cho việc thiết
lập một chế độ điều trị hỗ trợ sớm cho bệnh nhân Chẩn đốn dengue thường
dựa vào các yếu tố dịch tế, biểu hiện lâm sàng như trình bày ở trên cũng như dựa vào các xét nghiệm đơn giản: số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu và hematocrit
a Xét nghiệm (triệu chứng cận lâm sàng)
- Số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi: SXHD thường cĩ giảm bạch
cầu Trường hợp tăng bach cầu và tăng bạch cầu trung tính thường là cơ sở để
loại trừ SXHD
- Giảm tiểu cầu (<100.000/mmỶ): cần làm số lượng tiểu cầu ở bất kì
bệnh nhân nào nghi ngờ bị SXHD Tiểu cầu càng giảm, nguy cơ xuất huyết càng cao
Trang 16luận văn cao học Nguyén Thi Hi He
- Hematocrit: khi gia tri hematocrit tang trén 20% so vGi tri sé binh thường trước đĩ thì bệnh nhân được coi là cĩ cơ đặc máu, một tiêu chuẩn chẩn
đốn SXHD Nếu khơng biết được giá trị hemafocrit bình thường của bệnh nhân thì cĩ thể xem giá trị > 45% là mốc chẩn đốn
- Một số xét nghiệm khác nhằm đánh giá mức độ bệnh: điện giải đồ, khí máu, chức năng đơng máu, men gan, X- quang phổi nhằm phát hiện biến
chứng tràn dịch màng phổi b, Chẩn đốn nguyên nhân
Cĩ thể thể hiện mầm bệnh trong máu và huyết thanh bằng phương pháp
phân lập virus, xác định kháng nguyên virus bằng các phương pháp miễn dịch hoặc phát hiện bộ gen của virus bằng kỹ thuật khuếch đại chuỗi ADN (PCR)
[44]
s* Phân lập virus
- Virus dengue cĩ thể phân lập từ các bệnh phẩm: huyết thanh, máu của
bệnh nhân Theo Gubler (1981) thì thời gian cĩ nồng độ cao của virus trong máu từ ngày 1- 6 của bệnh
- Khi bệnh nhân tử vong lấy các bệnh phẩm gan, lách, hạch, tuyến ức để phân lập virus
- Phân lập virus gây bệnh và định typ virus cĩ thể sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang (IFA: Immunofluorescense assay) hoặc phương pháp RT- PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) Trong hai phương pháp nêu trên thì RT- PCR là phương pháp cho kết quả nhanh, nhạy
và đặc hiệu nhưng tiến hành khá phức tạp, địi hỏi kỹ thuật cao, đầu tư tài
chính lớn nên khĩ đáp ứng và phổ biến rộng rãi trong các phịng thí nghiệm
chẩn đốn SD/SXHD ở nước ta [11]
* Huyết thanh chẩn đốn: phương pháp đơn giản, giúp phát hiện bệnh và nghiên cứu dịch tễ, bao gồm các phương pháp sau [19]:
Trang 17
luận văn cao học Nguyén Thi Hei He
+ Phản ứng ức chế ngưng kết hơng cầu (HI Haemaglutination inhibition) Kỹ thuật này nhạy, dễ thực hiện, trang thiết cổng kénh và cần nhiều kinh phí, nhưng đáng tin cậy cho nên đến nay vẫn là kỹ thuật tốt nhất để chẩn đốn cơ bản về huyết thanh học cho hầu hết các nhĩm #/2wivirus Tuy nhiên
kỹ thuật này kém đặc hiệu do cĩ phản ứng chéo giữa các typ virus dengue
+ Phản ứng cố định bổ thể (CF= Complememt Fixation Technique)
Là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể xảy ra trong điều kiện cĩ
mặt của bổ thể Phản ứng này cĩ hai hệ thống tham gia: hệ thống | gồm kháng
nguyên và kháng thể Hệ thống 2 gồm hồng cầu cừu và huyết thanh kháng
hồng cầu cừu Trung gian giữa hai hệ thống là bổ thể Nếu trong huyết thanh bệnh nhân cĩ kháng thể thì kháng thể sẽ kết hợp với kháng nguyên, bổ thể sẽ
gắn vào phức hợp kháng nguyên- kháng thể Phản ứng này kém nhạy cảm hơn
phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu hoặc phản ứng trung hồ nhưng lại tồn
tại lâu hơn mặc dù ở một số trường hợp nĩ cĩ tồn tại ở nồng độ rất thấp do đĩ
CF chỉ dùng để chẩn đốn những bệnh nhân trong vụ dịch cĩ tính chất dịch té
CF đặc hiệu khi nhiễm virus nguyên phát nhưng lại kém đặc hiệu khi
nhiễm virus thứ phát Kỹ thuật này khĩ thực hiện nên ít được sử dụng + Phản ứng trung hồ (NT= Neutralization Test)
Virus dengue cĩ khả năng tạo ra những đám hoại tử trên tế bào nuơi cấy một lớp cảm thụ, khả năng này bị mất đi khi cĩ mặt của kháng thể đặc hiệu huyết thanh bệnh nhân
Kỹ thuật này nhạy hơn 2 kỹ thuật trên nên cĩ thể phát hiện được kháng
thể trung hồ ngay cả khi khơng phát hiện được kháng thể HI ở một số người trước đây đã nhiễm virus dengue
Kỹ thuật NT cũng cĩ thể dùng để xác định kháng thể ở lần nhiễm nguyên phát và cĩ thể phát hiện được các đáp ứng đơn typ ở các mẫu huyết
thanh lấy ở thời kì hồi phục Cịn đối với các trường hợp nhiễm thứ phát thì NT khơng phát hiện được các typ gây bệnh
Trang 18
luận văn cao hỌc Nguyễn Thị ữi thd
NT tồn tại lâu nên kỹ thuật này được sử dụng cho các nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học Tuy nhiên do tính đặc hiệu của kháng thể nên phải sử dụng
cả 4 typ kháng nguyên dengue để phát hiện kháng thể
+ Kỹ thuật ELISA phát hiện lẹM (MAC-ELISA: IgM Antibody Capturre ELISA)
Kháng thể IgM là kháng thể xuất hiện sớm nên kỹ thuật này cĩ ý nghĩa
trong việc chẩn đốn bệnh Sự xuất hiện kháng thể IgM nhanh hay chậm thay
đổi tuỳ từng bệnh nhân nhưng ở lần nhiễm virus nào (nguyên phát hay thứ
phát) thì IzM cũng được hình thành sớm và cũng sớm mất đi
Với kỹ thuật này chỉ cần lấy máu bệnh nhân một lần vào những ngày
đầu của bệnh Kỹ thuật này nhanh, cần ít trang thiết bị vì vậy kỹ thuật này cĩ giá trị đặc biệt trong việc giám sát bệnh SD/SXHD/HCSD Ở các vùng mà SD khơng phải là bệnh địa phương thì kỹ thuật này được dùng để giám sát, phát hiện những trường hợp nhiễm virus ở các bệnh nhân Cịn ở các vùng bệnh cĩ
tính chất địa phương kỹ thuật này cĩ thể dùng để điều tra sàng lọc một lượng lớn mẫu huyết thanh
Kỹ thuật MAC-ELISA kém nhạy hơn kỹ thuật HI nhưng cĩ ưu điểm là
chỉ cần huyết thanh đơn, thực hiện kỹ thuật nhanh, cần ít trang thiết bị Tuy
nhiên kỹ thuật MAC-ELISA khơng giúp chúng ta phân biệt được giữa những trường hợp nhiễm virus dengue nguyên phát hay thứ phát [15, 28, 53]
+ Kỹ thuật ELISA phát hiện IgG (GAC-ELISA= IgG Antibody Capture Enzymelinked Immunosorbent Assay)
Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: kháng thể IgG đặc hiệu của virus dengue cĩ trong huyết thanh bệnh nhân được phát hiện bằng kỹ thuật IgG người gắn trước vào bản nhựa, sau đĩ kháng thể IgG được phát hiện bằng kháng nguyên dengue và kháng thể dengue gắn enzyme cho thêm vào sau Khi
cĩ cơ chất, phản ứng dương tính sẽ xuất hiện màu
Trang 19
Luận văn cao học Nguyễn Thị Hữ tụ
Kỹ thuật này cĩ độ nhạy thấp, chủ yếu là do sự cạnh tranh với lgG
khơng đặc hiệu Tuy nhiên kỹ thuật này cũng cĩ những ưu điểm là cĩ thể dùng để phân biệt giữa nhiễm dengue nguyên hay thứ phát, đồng thời lại đơn giản, chỉ cần một lượng nhỏ huyết thanh và cĩ thể nhận định kết quả bằng mắt
thường [8, 28, 51]
Kháng thể IgG kháng dengue xuất hiện muộn hơn và tồn tại nhiều năm hoặc suốt đời và cĩ miễn dịch với typ dengue gây bệnh Kháng thé IgG khang
dengue xuất hiện trong nhiễm trùng tiên phát và thứ phát, nhưng trong nhiễm
trùng thứ phát hiệu giá rất cao so với nhiễm trùng tiên phát Khi bị bệnh do một typ huyết thanh nào đĩ của virus dengue thì sẽ cĩ miễn dịch suốt đời với typ dengue đĩ, nhưng khơng cĩ miễn dịch với các typ khác [42]
Nhưng cĩ một điều đặc biệt là IgG và IgM ở huyết thanh người phản ứng chéo với cả 4 typ huyết thanh của virus dengue và thậm chí với Flaviviruse khác Sự phân biệt typ huyết thanh cĩ thể làm được chỉ nhờ kiểm
tra phản ứng miễn dịch bằng các kiểm tra trung hồ hoặc RT- PCR của typ
đặc hiệu Glycoprotein E, một kháng nguyên cĩ tính đặc hiệu dengue virus cao, vùng B hoặc vùng HI là đặc trưng Trình tự của nĩ ngắn khoảng 100 amino acid duoc biéu hién 6 E.coli cho virus viêm não Nhật Bản bởi Mason et al và cho các virus dengue bởi Fonseca et al Bằng cách sử dụng những kháng nguyên này, các kháng thể đặc hiệu typ được tìm thấy ở huyết thanh siêu miễn dịch Nghiên cứu này được tiếp tục bởi Simsons et al., ơng đã ứng dụng một hỗn hợp của cả 4 tái tổ hợp vùng B của dengue virus để thiết lập một phản ứng ELISA dac hiéu dengue virus [31]
+ Kỹ thuật Dot blot va Western blot
Ngồi những kỹ thuật trên thì gần đây nhiều phương pháp miễn dịch khác dùng cho chẩn đốn nhiễm dengue trở nên phổ biến, dễ sử dụng bao gồm que thử, phương pháp miễn dịch enzyme, sắc kí miễn dịch và Dot blot, Western blot Đây là những phương pháp để thử khả năng phản ứng của kháng
Trang 20
Ludn van cao hoc Nguyễn Tự tú Ha
thể trong huyết thanh bệnh nhân với protein tái tổ hợp Phản ứng này cĩ thể quan sát bằng mắt thường, dễ thực hiện nên được sử dụng khá rộng rãi Phản
ứng này nhằm phát hiện những kháng thể IgG và IgM dựa trên hai kiểu đáp
ứng miễn dịch của cơ thể là đáp ứng miễn dịch tiên phát đối với người chưa bị
nhiễm virus dengue và một virus khác trong chi #J2wivirus hay chưa dùng vaccine Flavivirus, IgM hiéu gid cao hon han IgG hoac 1a dap tmg miễn dịch thứ phát đối với người cĩ tiền sử nhiễm virus dengue hay đã ding vaccine Vi vậy phản ứng Dot blot, ELISA rất cĩ ý nghĩa trong việc đánh giá nhiễm trùng hiện tại của virus [17, 19, 41]
1.1.5 Điều trị và phịng chống 1.1.5.1 Điều trị
Vì SXHD là một bệnh do virus nên hiện tại chưa cĩ thuốc điều trị đặc hiệu Điều trị chủ yếu là triệu chứng và điều trị biến chứng bệnh Các biện
pháp điều trị chung gồm:
- Thuốc hạ sốt
- Điều trị với corticosteroids methylprednisolone, hydrocortisone hemisuccinate hoặc carbazochrome sodium sulfonate (AC-17) (những thuốc này làm giảm tính thấm mao mạch)
- Bồi phụ nước bằng con đường uống hoặc bằng đường tĩnh mạch trong trường hợp cần thiết nhằm đề phịng và điều chỉnh mất nước
- Nếu cĩ xuất huyết nặng và rối loạn đơng máu trầm trọng, cần phải
truyền máu tươi hoặc khối tiểu cầu
- Theo dõi bệnh nhân chặt chế nhất là trong giai đoạn bắt đầu hạ sốt
[29]
1.1.5.2 Nghiên cứu chế tạo vaccine dự phịng
Ở người, mỗi typ virus đều cĩ thể gây SD và SXHD, chưa rõ typ nào
gây bệnh mạnh hơn Tuy 4 typ rất gần nhau về phương diện kháng nguyên
Trang 21
luận văn đao học Nguyễn Thị Hei He
(chung nhau khoảng 60- 74% gốc amino acid), nhưng cũng đủ khác nhau để
chỉ cĩ một phần gây miễn dịch chéo [40] Virus dengue cịn cĩ chung một số đặc điểm kháng nguyên với các ƑJ2vivirus khác Kháng nguyên virus dengue đã được thấy khu trú ở đại thực bào phổi, lách, gan, tuyến ức, tế bào Kupffer, tổ chức đại thực bào của da và bạch cầu đơn nhân to ở máu ngoại vi Virus dengue cĩ khả năng phát triển rất nhanh trong những bạch cầu đơn nhân to thực bào khi cĩ mặt phân nhĩm dengue (hoặc cùng nhĩm Ƒ/avivir„s) Tình trạng này dẫn đến tăng hoạt thực bào, tăng nhiễm các tế bào, bạch cầu đơn nhân to sẽ giải phĩng ra những chất trung gian hĩa học làm tăng tính thấm
huyết quản, kích hoạt bổ thể, hoạt hĩa thromboplastin tổ chức (nguồn gốc của
đơng máu rải rác nội mạch), từ đĩ bệnh nặng hơn Trong khi chưa rõ độc lực và tính gây bệnh của các typ virus dengue cĩ khác nhau khơng, đáng lưu ý là bệnh cảnh lâm sàng SXHD rất khác nhau tùy theo vụ dịch, tùy theo vùng địa
lý [47]
Kháng thể dengue tồn tại cả đời với typ virus gây bệnh và khơng cĩ cơ chế bảo vệ chéo do đĩ vaccine phải bao gồm cả 4 typ mà chỉ cần tiêm một lần
bảo vệ được 4 typ Thực tế việc sản xuất ra một vaccine đạt yêu cầu thực sự là một vấn đề phải nghiên cứu, đánh giá thật chặt chẽ Nếu ta chỉ sản xuất một vaccine đơn giá và tiêm riêng biệt thì cĩ nhiều người lo ngại về trình tự nhiễm
các typ virus dengue Việc đề xuất một phác đồ tiêm vaccine tạo miễn dịch chắc chắn vẫn cịn là một vấn đề lớn đang được nghiên cứu Một số tác giả cho rằng trong tự nhiên cĩ sự phối hợp ngẫu nhiên các trình tự nhiễm 2 typ
dengue nào đĩ dẫn đến kết quả một số ít người mắc SD/SXHD Mặt khác, cĩ câu hỏi đã được đặt ra rằng liệu trong số các virus vaccine cĩ làm cho người đã tiêm phịng bị mẫn cảm và gây ra nhiễm trùng tăng cường khi tiếp xúc với virus dengue hoang dại hay khơng? Đến nay đã cĩ ít nhất 15 chương trình nghiên cứu vaccine dengue đang được thực hiện ở nhiều nước trên thế giới
như Mỹ, Thái Lan, Trung Quốc song cũng cĩ những khĩ khăn về kỹ thuật,
Trang 22
kuận văn cao học Nguyễn Thị Hữi ts
việc đưa vào sản xuất và sử dụng rộng rãi một vaccine như mong muốn cĩ lẽ
sẽ chưa đạt được trong vài năm tới [5, 8, 14, 16, 24, 45]
Vaccine dengue đầu tiên được phát triển sau một thời gian ngắn khi virus dengue được phân lập đầu tiên bởi các nhà khoa học Nhật và Mỹ Mặc dù đã cố gắng qua nhiều năm nhưng một vaccine hiệu quả mà an tồn vẫn
chưa được phát triển Với sự giúp đỡ của WHO, cơng trình lớn cho sự phát
triển một vaccine dành cho SD và SXHD đã được thực hiện trong những năm gần đây Vaccine làm giảm độc lực đầy hứa hẹn đã được phát triển và được định giá ở giai đoạn 1 và 2 được dùng thử ở Thái Lan Sự tiến triển đầy hứa hẹn trong chiến lược phát triển vaccine khác sử dụng cơng nghệ phân tử mới cũng được thực hiện trong những năm gần đây Các phương pháp gần đây bao gồm sử dụng các vaccine cĩ các virion bị bất hoạt, tổng hợp peptides, các
vaccine cấu trúc siêu phân tử, vector biểu hiện, các hệ thống vector tái tổ hợp
sống, và ADN trần [22, 26]
1.1.5.3 Tình hình nghiên cứu trong nước
Để cĩ thể giám sát dịch tễ học của virus dengue nhằm phát hiện kịp thời
và cĩ biện pháp phịng chống hiệu quả thì việc tạo ra các Kit chẩn đốn và ứng dụng các kỹ thuật hiện đại trong chẩn đốn và phát hiện virus dengue là cực kỳ quan trọng Tại Viện Vệ sinh Dịch tế học Trung ương, các bộ sinh phẩm dùng trong chẩn đốn sốt xuất huyết như MAC-ELISA Đặc biệt các sinh
phẩm cao cấp như kháng thể đơn dịng cũng được sản xuất tại đây và ứng
dụng trong chẩn đốn nhanh SD Các kỹ thuật hiện đại như hiển vi điện tử, trung hịa giảm đám hoại tử, phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT- PCR) cũng đã được ứng dụng trong chẩn đốn SD Bệnh SD/SXHD là bệnh do muỗi truyền, vì vậy phương pháp phịng chống vectơ cũng được xem là một biện pháp cực kỳ quan trọng Việc ứng dụng thành cơng các chủng vi sinh vật
tái tổ hợp như E.coli và nấm men P.pasforis để sản xuất các loại protein tái tổ
hợp phục vụ sản xuất và đời sống trong đĩ cĩ các kháng nguyên và vaccine tái
Trang 23
luận văn cao học Nguyễn Thị Hữi Hà
tổ hợp đã được thực hiện thành cơng ở nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới Tuy nhiên, để cĩ thể cĩ được một lượng kháng nguyên lớn và đủ độ tinh sạch
để sử dụng rộng rãi trong chẩn đốn, đặc biệt chẩn đốn với các kỹ thuật hiện đại như MAC-ELISA hay GAC-ELISA thì việc ứng dụng cơng nghệ ADN tái
tổ hợp là hết sức cần thiết [7]
1.1.5.4 Kiểm sốt vector truyền bệnh
Hiện tại, kiểm sốt vector truyền bệnh được xem là phương pháp phịng
bệnh duy nhất cĩ hiệu quả Kiểm sốt các vector Aeđes cĩ thể làm giảm đáng
kể tỉ lệ mắc bệnh dengue Trong những năm 1950-1960 Tổ chức Y tế tồn châu
My (Pan American Health Organization) đã thành cơng trong việc diệt sạch Aedes aegypti ở nhiều vùng thuộc Trung và Nam Mỹ và trong thời gian này, các vụ dịch dengue rất hiếm ở châu Mỹ Tuy nhiên sau khi chương trình ngimg lai thi Aedes aegypti va sau do 14 dengue lai tai xuat hién
Diệt và chống đốt đối với mudi A aegypti lai khong dé dang, rat tuy thuộc vào trình độ kinh tế xã hội của từng vùng như hệ thống cấp và thốt nước; riêng ở Việt Nam cĩ những khĩ khăn đặc biệt do tỷ lệ gia đình dùng
trực tiếp nước máy cịn thấp, số hộ sử dụng nước dự trữ trong thùng, bể chum,
vại cịn nhiều, nhất là nơng thơn; nhiều hộ ở thành phố mặc dù cĩ ống dẫn
nước tới nhà nhưng bơm cĩ giờ nên vẫn phải cĩ bể chứa trong nhà, ngồi sân Tình hình này buộc cơng cuộc phịng chống bệnh dengue ở nước ta phải phát huy tối ưu mọi biện pháp cĩ hiệu lực- như các biện pháp diệt muỗi chống đốt,
cải thiện vệ sinh hồn cảnh mơi trường, phát hiện và điều trị sớm bệnh nhân, mặt khác về lâu đài và cơ bản, phải cải tạo hệ thống cấp thốt nước ở các
thành phố, thị trấn, việc này đi liền với sự phát triển đời sống kinh tế xã hội và
Trang 24EE am Dolo luận tấn cao học Nguyễn THị Hữi Mà 1.2 Virus Dengue 1.2.1 Cấu trúc và thành phần
Virus dengue hình khối cầu cĩ đường kính khoảng 40-50nm, chứa một sợi
(+) ARN cĩ trọng lượng phân tử là 3,8.10É, vỏ là lipoprotein được hình thành bởi 32 capsome Trọng lượng phân tử 14 4,2.10° Hat virus cĩ hệ số lắng khoảng 175S
đến 215S Tỷ trọng xác định bằng ly tâm gradient sacarosa khoảng 1,19g/cm' Tỉ
lệ ARN/ Protein/ Lipit/Gluxit =6/66/17/9, tỉ lệ này cĩ thể thay đổi đơi chút do kỹ
thuật tinh chế và loại tế bào mà virus đã xâm nhiễm [8, 54]
Nucleotit của virus cĩ thành phần như sau: Adenin 31%, Guanin 26,5%, Cytidin 21% và Uracin 21,5% [2, 8]
Các kháng nguyên ngưng kết hồng cầu của các typ virus dengue cĩ nhiều yếu tố chung nhau do đĩ hay cĩ hiện tượng ngưng kết chéo giữa các typ
do đĩ trong phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu để định typ thường hay bị
chéo, khơng đặc hiệu Khi nhiễm dengue sơ cấp hiệu giá kháng thể của typ đang gây bệnh thường cao hơn nhiều so với các typ khác pH 6.4 là pH thích
hợp cho virus ngưng kết hồng cầu
Khi bị nhiễm virus các tế bào cịn sản sinh ra một loại protein khơng cấu trúc, TLPT là 39.000 Dal, protein này mang những quyết định kháng nguyên đặc hiệu nhĩm và đặc hiệu typ
Khi virus xâm nhiễm vào cơ thể, các kháng nguyên virus kích thích cơ
thể hình thành kháng thể đặc hiệu tương ứng, kháng nguyên và kháng thể đặc
hiệu typ cĩ tác dụng trung hồ lẫn nhau, cịn kháng thể đặc hiệu nhĩm và thứ nhĩm thì khơng cĩ tác dụng trung hoa [8]
- Virus dengue thuộc nhĩm Favivirus (họ Flaviviridae) genome cĩ 3
gen protein cĩ cấu trúc (protein lõi- C, protein màng M và protein vỏ E) và 7
gen protein khơng cấu trúc Protein E cĩ chức năng trung hịa và tương tác với các thụ thể Hiện nay phân biệt được 4 typ huyết thanh virus dengue đã gây
bénh: DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4 W.M, Hammon, 1966 da phan lập từ
Trang 25
Luan van cao hoe Neuyn hi Hii He
bệnh nhân sốt xuất huyết ở Thái Lan thêm 2 typ (TH36, TH Sman) đề nghị coi là typ 5 và 6, tuy rằng chúng gần tương tự với 1 và 2; nhưng Succhinda Udomsakdi và S.B Halstead (1966) bằng phản ứng kết hợp bổ thể nhận thấy
giống nhau về kháng nguyên giữa virus dengue typ 1 với TH Sman, giữa typ 2 với TH36 [36, 50]
1.2.2 Genome của virus dengue
A) ARN Flavivirus
5 NTf khung doc mg 3UNTR
Cap Se evi ARN don (+) ~ 1lkb | B) Polyprowin Flavivirus: c4c chite năng của prorein cấu trúc Sự sao chép, khả đồng nhân Ị Nhan + — i j
Cac protein vo nang sink beady sre Rhine TEN) RdRp
Kháng IFN- (?) Protease Methyl-transferase Helicase Guanylyl-transferase ARN-ưiphosphauase C)Polyprowin Flavivirus tế bào chất 5Œ = Lee Ligee tsar ce oem peur ER lumen > = protease cia virus (NS2B-3) 2 = Protease cila vat chi > "“fRuria 3< = Cáctnhiệucätcủa vậtchủ
Hình 5 Cấu tạo genome của dengue virus, polyprotein và hình học màng của các protein của virus; (a): sơ đồ genome ARN sợi đơn với các nhân tố ARN cấu trúc ở đầu 5 và đầu 3 NTRs; (b): cấu trúc penome của dengue virus và các chức năng của các protein virus, một vài protein mà chức năng của chúng trong chu trình sống của virus cịn chưa rõ, kí hiệu là “?”; (c): các protein của dengue ở khu vực màng và proteinase tạo thành polyprotein cắt [26, 58]
Virus dengue cĩ hệ gen của Ƒ‡2zvivừus điển hình Genome là một sợi RNA don, dương cĩ chiều dài xấp xỉ 10.200 ribonucleotit Hệ gen chứa một khung đọc mở mã hố thành một chuỗi polyprotein duy nhất Chuỗi này sau đĩ sẽ được phân cắt bởi các enzym của tế bào vật chủ và các enzym của virus thành 10 phân tử protein chức năng, bao gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein phi cấu
Trang 26
Luận uăn cao học NguyEn hi Het Ha
tric Genome cla virus dengue c6 cau trúc phân bố của các gen theo thứ tự như sau: 5’-C-preM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NSS5-3’ (hinh 5) [26]
- Dau 5’ khơng mã hố dài khoảng 100 nucleotit, được methyl hoa dam bảo sự bền vững cho vật liệu di truyền Đầu 3' (khơng được polyadenin hố) khơng mã hố dài khoảng 400 nucleotit
- Khoảng một phần tư chiều dài của genome tính từ đầu 5” mã cho các
protein cấu trúc: protein lõi (C), protein màng (M), protein vo (E) Doan gen này đã được hiểu rõ và đã được giải trình tự Đoạn này chứa nhiều vùng đặc hiệu lồi và đặc hiệu typ Người ta dựa vào các vùng đặc biệt này để phân biệt cấu trúc gen của các virus trong nhĩm và các typ virus trong lồi
lÏ - Phần cịn lại của
229 ⁄7?— c genome ma hoa cho 7 protein phi cấu trúc thực hiện các chức oD eee 3 skp _ as =—= năng sinh học xác định vịng đời OnE fe oe Ow của virus Chức năng của các ` : :
" protein này đến nay vân chưa
SS được biết đây đủ
cản nàn Khoảng 1/4 chiều đài của
Hình 6 Các thành phần cấu tạo của virus genome tính từ đầu 5° (khoảng
hơn 2.000 nucleotide) mã hố cho các protein cấu trúc Đoạn gen này chứa nhiều vùng quyết định kháng nguyên quan trọng gĩp phần đánh giá đặc hiệu
typ Tính chất đặc trưng của vùng này cho phép phân biệt cấu trúc gen của các
virus trong nhĩm và trong cùng typ huyết thanh [25] Protein cấu trúc
Bao gồm protein lõi (C), protein vỏ (E), protein màng (M)
+ Protein lõi (C): là protein cĩ kích thước nhỏ và là thành phần cơ bản tạo nên lõi nucleocapsit của virus
Trang 27
Luan van cao hoc Nguyễn Thị Hải Ha
+ Protein vỏ (E): cĩ nguồn gốc từ màng tế bào chủ, được glycosyl hố ở pH thấp, mang các kháng nguyên trung hồ, kháng nguyên gây ngưng kết
hồng cầu và tương tác với các thụ thể gây ra các triệu chứng của SD/SXHD
+ Protein mang (M): Co hai dang phụ thuộc vào độ sinh trưởng của
virus bao gồm M cĩ khối lượng phân tử 8 kDa và preM cĩ khối lượng phân tử 19 - 23 kDa
Protein phi cấu trúc
Chức năng của nhĩm protein này chưa được biết một cách đầy đủ Các chức năng sinh học này xác định vịng đời của virus Cấu trúc đoạn sen này khá giống nhau ở các typ virus dengue khác nhau, đây chính là nguyên nhân gây nên các phản ứng chéo nhau trong chẩn đốn huyết thanh học
+ NSI là một glycoprotein, khoảng 46- 50kDal, là glycoprotein được
biểu hiện ở dạng chất tiết (sĐS1) hoặc khơng tiết (mNSI), cĩ thể liên quan
đến vai trị trong quá trình sao chép [59]
+ NS2 cĩ thành phần là các enzym quan trong trong việc sao chép RNA, helicase và RNA triphotphatase tạo thành cấu trúc đầu 5”, protease dé
phân cắt polyprotein và liên kết với màng
+ NS5 thành phân là các enzym polymerase phụ thuộc RNA cĩ chức năng phiên mã ADN và enzym methyltransferase metyl hố đầu 5"
+ Ngồi ra cịn cĩ các vị trí của NS2A, NS2B, NS1A, NS4H Các
protein này cùng phối hợp thực hiện các chức năng sinh học trong vịng đời cua virus
1.2.3 Chu trình nhân lên và cơ chế gây bệnh của virus dengue
Lúc đầu virus gắn vào bề mặt tế bào nhờ một thụ thể đặc hiệu của màng
tế bào Sau đĩ dưới tác động giữa protein vỏ capsit của virus và enzym của tế bào sẽ phá huỷ vỏ capsit, phân tử ARN của virus được thâm nhập vào bào tương tế bào vật chủ Tiếp theo là quá trình nhân lên của virus với tế bào Giai đoạn đầu này được gọi là giai đoạn hấp thụ và giải phĩng vật liệu di truyền
Trang 28—
Hine
luận van cao hoc Nguy&n Thi Het Ha
virus vào tế bào chủ Sau đĩ ARN của virus và các protein vỏ capsit dần xuất
hiện, rồi đến các virion hồn chỉnh đĩ là các giai đoạn tổng hợp ARN, vỏ capsit virus và hình thành virus mới Cuối cùng là giai đoạn hồn chỉnh virus
mới trong tồn bộ chu kì nhân lên của virus dengue [29, 30]
1 Nối 2 Thực ẩm bào nhờ thụ quan trung gian > - @) 3 Dung hợp ở pH thấp ` — Ciic protein cia virus C} 35RENA —~ Sự hình thành | các phức hợp 16) SSAA Sw tao hinh cia virion \ 6 Su tao hinh
© 7 Giải phĩng virus Sự thay đổi màng ở các tế bào Huh7 được
kích thích trong suốt quá trình nhiễm DV
Molecular Virology University cf Haideiderg
Hình 7 Quá trình nhân lên của virus dengue
Chu trình nhân lên của virus trong tế bào gồm các bước sau:
1 Sự hấp thụ (hút bám)
Trang 29Luan van cao hoc Nguyén Thi Hai Ha
virus vào tế bào chủ Sau đĩ ARN của virus và các protein vỏ capsit dần xuất hiện, rồi đến các virion hồn chỉnh đĩ là các giai đoạn tổng hợp ARN, vỏ
capsit virus và hình thành virus mới Cuối cùng là giai đoạn hồn chỉnh virus mới trong tồn bộ chu kì nhân lên của virus dengue [29, 30]
(*)ssRNA ———————®—~=
(Cie protein cha virus
1 N6i 2 Thực ẩm bào nhờ thụ quan trung gian @ > © 3 Dung hợp ở pH thấp ; ng) ng —_ Syhình thành > | các phức hợp Ỷ (*) ssRNA Sự tạo hình của virion rER A
6 Sự tạo hình ua (@) Sự thay đổi màng ở các tế bào Huh7 được is Tee: AB SY
kích thích trong suốt quá trình nhiễm DV
@ 7 Giai phéng virus Molecular Virology University of Hoidelberg
Hình 7 Quá trình nhân lên của virus dengue
Chu trình nhân lên của virus trong tế bào gồm các bước sau: 1 Sự hấp thụ (hút bám)
Trang 30Luan van cao học NguyEn Thi Hei Ha
Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus dengue tăng sinh trong các đại thực
bào Khi cơ thể bị nhiễm virus dengue typ khác thì những kháng thể cĩ sẵn
trong cơ thể khơng cĩ khả năng phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên nên khơng trung hồ được kháng nguyên của virus Virus xâm nhập vào bạch cầu đơn nhân, số lượng bạch cầu đơn nhân to tăng lên Hoạt hố các CD4, CD8, lympho déc té bao Cac lympho T hoat hod giải phĩng ra nhiều cytokinin, các bạch cầu don nhân to nhiễm virus bị phân giải qua trung gian tế bào Xuất hiện thốt huyết tương và xuất huyết
1.2.4 Đặc điểm kháng nguyên
Virus dengue mang các kháng nguyên trung hồ, kháng nguyên gây
ngưng kết hồng cầu, kháng nguyên kết hợp bổ thể trên protein màng (E) [6,
21] Virus dengue cĩ nhiều kháng nguyên, trong đĩ cĩ kháng nguyên đặc hiệu typ, kháng nguyên chung của phân nhĩm và của nhĩm, dựa vào sự khác biệt giữa các đặc điểm quyết định kháng nguyên người ta phân chia virus dengue thành 4 typ khác nhau Khi xâm nhập vào cơ thể các kháng nguyên của virus
là kháng nguyên trung hồ, kháng nguyên ngưng kết hồng cầu và kháng nguyên kết hợp bổ thể sẽ kích thích cơ thể hình thành các kháng thể đặc hiệu
tương ứng [2, 9, 25]
1.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.coli 1.3.1 Chủng E.col biểu hiện protein tái tổ hợp
E.coli dễ biến nạp, sinh trưởng nhanh trong mơi trường đơn giản và các thiết bị nuơi cấy, giữ chủng khơng đắt tiền Ngồi ra, tế bao E.coli dé dang bi phá vỡ để thu sản phẩm protein tạo ra trong té bao Nhung E.coli lai khơng cắt
trình tự khơng mã hố (intron) và khơng cĩ các biến đổi sau dịch mã ở tế bào sinh vật nhân chuẩn như glycosyl hố, phosphorin hố hoặc hình thành cầu disulfua [21]
Trang 31
Luận văn cao họe Nguyễn Thị lái Hà
Sau khi các plasmid đã được đưa vào trong một vật chủ khơng biểu hiện
hầu hết chúng thường được chuyển vào một vật chủ mang gen T7 ARN
polymerase (thể tiềm tan ADE3) cho sự biểu hiện của các protein đích Hình 8 mơ tả ở dạng sơ đồ vật chủ và các yếu tố vector cĩ thể dùng để điểu khiển các
mức T7 ARN polymerase và sự phiên mã tiếp theo của một gen đích trong một vector pET Và để điều khiển nghiêm ngặt hơn nếu cĩ các tế bào vật chủ mang pLysS hoặc pLysE Các plasmid pLys mã hố lysozym 'T7 là một chat ức chế tự nhiên T7 ARN polymerase và vì vậy làm giảm khả năng phiên mã gen đích trong các tế bào khơng cảm ứng Các vật chủ pLysS tạo ra lượng T7
lysozyme thấp trong khi các vật chủ pLysE sản xuất ra enzym nhiều hơn và vì
vậy hay được dùng hơn [35] “ IPra Inducton & coi ANA polymerase Vy i
le E coli genome HOST CELL s)
Hinh 8 Hé théng T7 biéu hién protein 6 E.coli
Cảm ứng bằng IPTG dẫn đến:
e©_ Giải ức chế của gen T7 ARN polymerase ở NŠT vật chủ e_ Giải ức chế gen đích dưới sự điều hồ của lac O
e Gen dich phién ma nho T7 ARN pol
Hình 9 Giải ức chế cia gen T7 ARN polymerase bang IPTG
Trang 32Luan van cao hoe Nguyễn Thị Hai Ha
1.3.2 Hệ thống pET vector
Hệ thống pET là hệ thống mạnh nhất dùng cho nhân dịng và biểu hiện
các protein tái tổ hợp trong E.coli Gen dich dugc nhan dịng trong các plasmid pET dưới sự điều khiển của các tín hiệu phiên mã và dịch mã của T7
bacteriophage T7 ARN polymerase cé tinh chon loc va linh hoat dén néi hau hết tất cả các nguồn tế bào được chuyển vào gen đích đều được biểu hiện
Các vector pET được xây dựng ban đầu bởi Studier và cộng sự (Sfudier & Moffatt 1986; Rosenberg et al., 1987; Studier et al 1990) Cac vector pET mới hiện nay do Novagen cải tiến cĩ vị trí gan ribosome hiệu quả cao từ
protein capsit chính của thực khuẩn thể T7, được dùng để biểu hiện gen đích mà khơng cần vị trí gắn ribosome của gen đĩ, cùng với đặc điểm mạnh để
tách dịng, phát hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp dễ dàng hơn Hệ thống pET cĩ những nhân tố quan trọng sau:
° Dấu chuẩn chọn lọc (kháng
kháng sinh)
Vùng khởi đầu sao chép ColEl ° Vùng khởi đầu sao chép f1 pLink ⁄ lacO ƒ ort amp ° Gen lacl (protein tic ché lac)
P Et e Promoter phiên mã T7 (đặc hiệu
hạ š cho phage T7 ARN polymerase)
e — Vùng 3 điều khiển lac của T7 promoter
° Vị trí đa tách dịng (vùng nối) liền
Trang 33luận văn cao học Nguyễn Thị Hải Hà
Dé tinh sạch protein tái tổ hợp dùng S- tag, T7- tag hoặc HSV- tag để đễ
dàng xác định trên Western blot Những peptide này (các đoạn dung hợp) cĩ kích thước nhỏ và các thuốc thử xác định chúng là cĩ tính đặc hiệu và độ nhạy cao Các đoạn S- fag và T7- tag cũng được sử dụng cho quá trình tinh sạch ái lực nhờ các gốc tương ứng và các kit buffer Trình tự His- tag là rất cĩ ích như một phần cua protein dung hop Gen quan tâm đã được nhân dịng như một protein dung hợp với 6- 10 géc histidine liên tiếp được gọi là một “đuơi” và vị trí của tag thường là đầu tận cùng amino hoặc carboxyl của protein để tránh phá vỡ chức năng protein, nhưng cĩ thể nằm giữa protein nếu vùng đĩ khơng cần thiết cho chức năng protein Tỉnh sạch protein dễ dàng dựa vào các gốc histidine liên tiếp cĩ khả năng liên kết mạnh với những cation cĩ hố trị 2 như nickel
Hệ thống này là phổ biến vì nĩ cĩ thể được thực hiện dưới những điều kiện khác nhau Ta cĩ thể gắn hoặc giải phĩng một protein từ cột dưới những điều kiện nhẹ nhàng mà vẫn duy trì được cấu trúc và chức năng của protein hoặc ta chọn lọc dưới những điều kiện biến tính và hơn nữa sử dụng tag khơng cần trở chức năng thơng thường của protein tái tổ hợp [18, 34, 35]
Trang 34
luận văn cao học Nguyễn Thị Mái He Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu là gen mã hĩa kháng nguyên vỏ của virus dengue typl đã được Phịng VỊ sinh Vật hoc Phân tử tạo dịng và đăng ký trong ngân hàng Gen quốc tế
2.2 Vật liệu
2.2.1 Sinh phẩm
Trong quá trình thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện chúng tơi đã sử dụng một số sinh phẩm của các hãng nổi tiếng trên thế giới như: Kit tách
địng- TA cloning của hãng Invitrogen, Kit xác định trình tự- BigDye Terminator v3.1 của hãng Applied Biosystem, Vector biểu hiện pET-TRX- FUS do hãng Novagen cung cấp, Kit tinh sach plasmid - S.N.A.P.TM của hang Invitrogen, Kit thơi gen - S.N.A.P free UV của hãng Invitrogen
2.2.2 Hố chất
Các hĩa chất tinh khiết được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử của hãng Sigma, Merk, Invitrogen, Bio-Rad bao gồm IPTG, ethanol, acetat natri, cao nấm men, trypton, chloroform, EDTA, agarose, natriclorua, agar-
bacter, tris-HCI, SDS, MgCl;, acrylamide, bis-acrylamide
2.2.3 Trang thiết bị
Trong quá trình thực hiện đề tài này chúng tơi đã sử dụng các trang thiết bị, máy mĩc của phịng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Cơng nghệ Gen thuộc Viện Cơng nghệ Sinh học như:
Máy lắc ổn nhiệt 37°C
Máy khuấy từ (RotoLab, OSD
Máy ly tâm (Sorvall)
Trang 35
luận văn cao học Neguyén Thi Har He
Máy khuấy trộn Vortex (RotoLab, OSI)
Máy hút chân khong (Speed VAC Se 110A-Savant)
Máy quang phổ (Hewlett Packard, M¥)
May soi chup anh gel (Pharmacia) Máy ly tam lanh (Sorvall)
May khuéch dai gen 9700 (Applied Biosystem)
Máy xác định trình tự ADN tu dong (ABI 3100) Cân phan tich 10“g (Mettler Toledo)
Cân điện 101g (Ohaus)
Nồi khử trùng (Nhật Bản)
Ta lanh sau - 20°C, va - 80°C (Sanyo, Nhat Ban) Tu cay vơ tring (Sanyo)
Trang 36ludn vn cao hoe Nguyễn Thị Hai Hà -_ Mơi trường nuơi cấy vi khuẩn (LB): 1% Yeast extract 1% Trypton 1% NaCl pH = 7.4 (chỉnh bằng NaOH 5N) Đối với mơi trường thạch, cần bổ sung 2% agar bacter 2.2.4.2 Các loại dung dịch
- _ Dung dịch dùng trong tách chiết ADN plasmit từ vi khuẩn: Dung dich Sol I: Tris-HCl 50mM, EDTA 10mM Dung dich Sol II: NaOH 200mM, SDS 1%
Dung dich Sol I: CH,COOK 3M, pH 5.5
Dung dich chloroform: isomylalcohol (24:1) Dung dich CH,COONa (Natri acetat) 3M, pH 5.2
Dung dich TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0; 1 mM EDTA pH 8.0) Dung dich TE-RNase: 100 yl RNase 10mg/ml trong 10 ml dung dich TE - Dém tra mẫu (Loading buffer) 10X: Tris-HCl 1M, pH8.0 :2ml EDTA 0.5 M; pH 8.0 :0,4 ml Glycerol :4 ml Bromephenol Blue 1% :5ml
H/O khử ion vừa đủ : 20 ml
Trang 37Ludn vén cao hoe Nguyén thi Hei He + Dung dich dém tra mau (SDS-PAGE sample) 2X: Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8 : 1 ml Glycerol : 0,8 ml SDS 20% : 0,8 ml 2-Mercaptoethanol : 0,4 ml Bromphenol Blue 1% : 0,2 ml H;O khử ion vừa đủ : 4 ml + Dung dịch acrylamide-bisacrylamide 30%: Acrylamide :29g Biacrylamide :lg
H;O khử ion vừa đủ : 100 ml + Dung dịch tẩy màu:
500 ml metanol 100 ml axit axétic 400 ml H;O khử ion Bảo quản ở nhiệt độ phịng
+ Dung dịch nhuộm Coomassie brilliant blue (CBB) 0.25%: Can 0.25 g CBB (Merck) hoa tan trong 100 ml dung dich tay mau
- Dung dich ding cho Western blot:
+ Dém chuyén protein sang mang bloting buffer 10X:
Tris : 30g
Glycine : 144.13 g
H,O khitr ion : 1000 ml + Đệm chuyển protein sang màng | lần:
Trang 38——————————==7V'~_~™~ luận văn cao học Nguyễn Thị đái Hà + Dung dich dém TTBS 1X: 250 ml TBS 2X 250 mI H;O khử ion 250 hl Tween 20
+ Dung dịch Ponceau: 50 mg Ponceau (Merck) hoa trong 50 ml dung dịch axit axêtic 2%
- Dung dich hién mau:
5 ml metanol để trên đá + 15 mg chất hiện màu (4-chloronaphtol)
25 ml TBS 1X + 15 pl H,O, 30%
Trang 39Luận văn cao hoc Neguyén Thi Hei He - Dung dich mau ding cho dinh luong protein bang phương pháp Bradford: Coomassi-Brillian-BlueSER VAN-35050(G250) : 40mg Ethanol.95% : 20ml H,PO,.85% : 40ml H,O : 40ml Dung địch này được bảo quản ở 4°C và cĩ thể dùng trong nhiều năm 2.3 Phương pháp
2.3.1 Phương pháp khuyếch đại gen bằng PCR
PCR hay là kỹ thuật nhân ADN đặc hiệu được Kary Mullis hồn thiện vào giữa những năm 80 và đã đưa lại một cuộc cách mạng trong đi truyền học phân tử Thực chất đây là một phương pháp tạo dong in vitro, khong can su hiện diện của tế bào
Các giai đoạn cơ bản trong một chu kỳ của phản ứng PCR gồm:
+ Biến tính ADN: Giai đoạn hình thành đoạn ADN sợi đơn đĩng vai trị làm khuơn, giai đoạn này cần nhiệt độ từ 94°C đến 95°C, thời gian kéo dài từ 30 giây đến 1 phút
+ Bắt cặp: Giai đoạn để mồi bắt cặp với khuơn, cần nhiệt độ từ 40-70°C,
phụ thuộc vào độ dài và tỷ lệ G+C của mỗi mồi, thời gian kéo dài từ 30 giây
đến vài phút
+ Tổng hợp: Giai đoạn ADN polymerase (Taq polymerase) tổng hợp sợi
ADN mới trên khuơn, thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau (thường từ 25 - 45 chu kỳ) để tạo được lượng sản phẩm cần thiết [1, 4]
2.3.2 Phương pháp tao dong
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dịng TA Topo trong
bộ Kit TA cloning, sau đĩ được biến nap vao té bao E.coli ching DHSaT’
Trang 40
luén vén cao hoc Nguyen Thi Hai He
Các khuẩn lạc E.col¿ chứa vector tái tổ hợp được chon lọc trên mơi trường LB
chứa Ampicillin và X-gal
2.3.2.1 Gắn sản phẩm PCR vào vector tạo dịng pCR 2
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tạo địng nhờ enzym nối T,-ADN ligase ở 14C trong 16 giờ Sản phẩm lai sau khi sử dụng được bảo quản ở 4°C Bảng 3: Thành phần phản ứng sản phẩm PCR vào vector pCR 2.1 Thành phần Thể tích (ul) Đệm cho phản ứng gắn 1 San phim PCR 3 T,-ADN ligase 1 HO Bổ sung đến tổng thể tích 10ul
2.3.2.2 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli + Tạo tế bào khả biến:
- Tế bào E.coli được nuơi qua đêm trong 5 ml mơi trường LB lỏng, cĩ
thành phần như sau:
- Pha lỗng huyền dịch tế bào đã nuơi cấy theo tỷ lệ 1/100 trong 5 ml mơi trường LB
Nuơi lắc ở 37°C, 200 vịng/phút Sau 2 giờ tiến hành kiểm mật độ tế bào ở bước sĩng 600 nm OD,oo đạt giá trị từ 0.6 đến 1 là đạt yêu cầu
- Chuyển 1 ml dịch tế bào sang ống Eppendorf sạch - Để trên đá 10 phút
- Ly tâm tốc độ 5000 vịng/phút trong 10 phút ở 4°C để thu cặn tế bào - Hịa lại cặn tế bào thanh huyén dich trong 1 ml CaCl, 100 mM ở 4°C - Ly tâm thu tế bào, loại bỏ dịch nổi
- Hồ cặn tế bào thành huyền dịch trong 50ul CaCl; 100 mM Để huyền dịch tế bào trên đá 1 giờ trước khi tiến hành biến nạp