Untitled Science & Technology Development, Vol 19, No T6 2016 Trang 62 Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp FliC của Salmonella enteritidis Trần Thị Bảo Châu Nguyễn Việt Anh Trần[.]
Science & Technology Development, Vol 19, No.T6-2016 Tạo dòng, biểu tinh protein tái tổ hợp FliC Salmonella enteritidis Trần Thị Bảo Châu Nguyễn Việt Anh Trần Văn Hiếu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG –HCM ( Bài nhận ngày 05 tháng 07 năm 2016, nhận đăng ngày 21 tháng 11 năm 2016) TÓM TẮT Protein flagellin FliC Salmonella cắt giới hạn hai enzyme NdeI XhoI Kết enteritidis từ lâu nhà nghiên cứu xác nhận biểu protein FliC tái tổ hợp giới quan tâm tá dược tiềm cho cảm ứng biểu IPTG xác hệ vaccine tái tổ hợp Tuy vậy, định thông qua phương pháp SDS-PAGE lai chứng thực nghiệm từ nghiên cứu nước miễn dịch Western blot với kháng thể kháng đuôi hiệu bổ trợ miễn dịch protein dung hợp 6xHis Với độ tinh 95 %, hạn chế Nhằm tạo nguồn nguyên liệu cho protein FliC tái tổ hợp tạo từ nghiên cứu nghiên cứu sâu tác dụng bổ trợ miễn dịch trở thành nguồn nguyên liệu cho FliC, chúng tơi tiến hành tạo dịng gene fliC nghiên cứu đánh giá hoạt tính bổ trợ miễn dịch chủng chủ Escherichia coli với vector mang sau FliC gen plasmid pET-28a phương pháp PCR Từ khóa: flagellin, FliC, protein tái tổ hợp, Salmonela enteritidis, tá dược MỞ ĐẦU Một quan tâm lớn việc phát triển vaccine tìm kiếm tá dược hiệu để bổ trợ cho hiệu lực vaccine, đặc biệt vaccine tái tổ hợp vaccine tiểu phần [1] Do đa số kháng nguyên mục tiêu loại vaccine có chất protein, chúng thường khơng có thụ thể nhận diện đặc trưng hệ thống miễn dịch vật chủ nên kháng nguyên có khả kích thích hệ miễn dịch khởi tạo đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, dẫn đến vaccine không đạt hiệu bảo vệ mong muốn Với khả kích thích mạnh hệ miễn dịch bẩm sinh thơng qua hỗ trợ hoạt động miễn dịch thích ứng nên tá dược miễn dịch trở thành giải pháp cho vấn đề [2] Protein flagellin FliC có nguồn gốc từ vi khuẩn Salmonella spp từ lâu ý đến tá dược tiềm đặc tính bổ trợ Trang 62 miễn dịch Flagellin FliC thành phần cấu tạo nên lông roi Salmonella spp., mã hóa gene fliC Salmonella spp với 505 amino acid trình tự Mặc dù có chất protein khác với kháng nguyên mục tiêu vaccine, FliC phối tử hệ thống thụ thể nhận diện kiểu mẫu tế bào miễn dịch Khi vi khuẩn Salmonella spp xâm nhập vào thể, FliC nhận diện gắn thụ thể Toll-like receptor số (TLR-5) có bề mặt tế bào miễn dịch bẩm sinh, từ kích hoạt đường truyền tín hiệu bên tế bào dẫn đến hoạt hóa nhân tố phiên mã NF-κB [3] Nhân tố phiên mã sau điều hịa việc phiên mã tạo cytokine tiền viêm (như IL-1, TNF-α, v.v.) có tác dụng hỗ trợ, hoạt hóa tế bào miễn dịch đáp ứng vật chủ tác nhân xâm nhiễm, từ TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T6- 2016 giúp vật chủ hình thành đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ chống lại tác nhân xâm nhiễm [4] Cho đến nay, khả hỗ trợ miễn dịch FliC nhiều cơng trình ngồi nước kiểm chứng [5, 6, 7, 8] Tuy vậy, nghiên cứu có liên quan đến khả FliC nước chưa tiến hành Nhằm tạo nguồn cung cấp chủ động FliC tái tổ hợp, hướng đến việc tạo sở thực nghiệm vững cho khả hỗ trợ miễn dịch FliC, phục vụ cho nghiên cứu phát triển hệ vaccine tái tổ hợp hiệu lực cao sau, tiến hành tạo dòng, biểu tinh FliC tái tổ hợp có nguồn gốc từ Salmonella enterica serovar enteritidis (S enteritidis) hệ thống chủng chủ Escherichia coli Chủng vi khuẩn S enteritidis dùng làm nguồn thu nhận đoạn gene fliC cơng trình nghiên cứu công bố cho thấy FliC từ chủng S Enteritidis có khả kích thích mạnh hệ miễn dịch bẩm sinh vật chủ thí nghiệm [9, 10] VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng chủ plasmid Chủng E coli DH5α sử dụng làm chủng chủ để nhân vector tái tổ hợp Chủng E coli BL21 (DE3) sử dụng làm chủng chủ biểu protein tái tổ hợp Chủng S enteritidis dùng làm nguồn thu nhận đoạn gene mục tiêu Plasmid pET28a có kích thước 5369bp, sử dụng làm vector dịng hóa gene fliC, đồng thời vector biểu protein tái tổ hợp nhờ vào promoter T7 có plasmid giúp kiểm sốt biểu gene thông qua chất cảm ứng IPTG Các chủng vi sinh vật plasmid cung cấp phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Phân tử, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Cấu trúc plasmid tái tổ hợp pET-fliC Gene fliC thu nhận từ gene S enteritidis kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu 5’-fliC-NdeI 3’-fliC-XhoI Gene fliC plasmid pET-28a nối với enzyme T4 DNA ligase sau xử lý tạo đầu dính với hai enzyme cắt hạn chế NdeI XhoI Dung dịch phản ứng nối sau hóa biến nạp vào chủng chủ E coli DH5α Các thể biến nạp thu môi trường LB chứa kháng sinh kanamycin nồng độ cuối 50 µg/mL tiếp tục sàng lọc kỹ thuật PCR với cặp mồi 5’-fliC-NdeI 3’-fliCXhoI Kết tạo dòng khẳng định phương pháp giải trình tự với mồi T7pro (mồi plasmid pET-28a) Tạo dòng E coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp pET-filC Vector tái tổ hợp pET filC có kết giải trình tự hóa biến nạp vào tế bào E coli BL21 (DE3) trải môi trường LB có kháng sinh kanamycin nồng độ cuối 50 µg/mL Các dòng E coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp pET filC sàng lọc thông qua kỹ thuật PCR khuẩn lạc với cặp mồi 5’-fliC-NdeI 3’-fliC-XhoI Cảm ứng biểu FliC tái tổ hợp Chủng E coli BL21 (DE3)/pET-fliC nuôi cấy lắc 37 oC mơi trường LB chứa kháng sinh kanamycin (50 µg/mL) Sau 16 nuôi cấy, vi khuẩn cấy chuyền với tỉ lệ 1:20 (v/v) tiếp tục nuôi cấy lắc 37 oC Đến OD600 dịch vi khuẩn đạt giá trị 0,8–1,0, chất cảm ứng IPTG bổ sung vào ống dịch vi khuẩn cho nồng độ cuối đạt 0,1 mM, tiếp tục lắc mẫu 37 oC Sau cảm ứng, tiến hành thu sinh khối tế bào phá màng tế bào sóng siêu âm để thu protein pha tổng, tan tủa Sự biểu protein tái tổ hợp xác nhận phương pháp SDS-PAGE lai miễn dịch Western blot với kháng thể kháng 6xHis Thực đồng thời với mẫu đối chứng âm mẫu dịch pha tổng E coli BL21 (DE3)/pET-28a có cảm ứng IPTG Tinh FliC phương pháp sắc ký lực Dịch protein tổng thu nhận sau chủng E coli BL21 (DE3)/pET-fliC cảm ứng biểu ly giải sóng siêu âm Dịch protein sử dụng làm nguồn nguyên liệu để tinh Trang 63 Science & Technology Development, Vol 19, No.T6-2016 FliC tái tổ hợp phương pháp tinh chế sắc ký lực với cột Hitrap HP (GE Healthcare) Các bước tinh chế tiến hành theo hướng dẫn nhà sản xuất cột tinh chế Kết tinh chế FliC tái tổ hợp phân tích thơng qua phương pháp SDS-PAGE KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tạo dòng E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET-fliC Để cấu trúc vector tái tổ hợp pET-fliC, tiến hành thu nhận gene fliC từ gene S enteritidis kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu 5’-fliC-NdeI 3’-fliC-XhoI Gene thu nhận từ phản ứng PCR kiểm tra kích thước điện di gel agarose % Kết phân tích cho thấy thu nhận đoạn gene có kích thước 1515 bp (Hình 1, giếng 3), với kích thước gene fliC Bên cạnh đó, chứng âm phản ứng PCR thiết lập với đầy đủ thành phần phản ứng thu gene ngoại trừ khuôn gene S enteritidis nhằm kiểm soát ngoại nhiễm phản ứng PCR Khi điện di chứng âm này, không ghi nhận vạch DNA gel (Hình 1, giếng 2), điều chứng tỏ phản ứng PCR thu gene fliC không bị ngoại nhiễm, đoạn gene thu có nguồn gốc từ gene S enteritidis Hình Thu nhận gene fliC Thang DNA kb; Chứng âm; Sản phẩm PCR thu gen fliC Gene fliC plasmid pET-28a nối lại với sau xử lý tạo đầu dính tương ứng cặp enzyme NdeI XhoI Sản phẩm nối biến nạp vào vi khuẩn E coli DH5α Do gene kháng kháng sinh kanamycin thiết kế plasmid pET-28a nên thể biến nạp mang vector tái tổ hợp pET-fliC sàng lọc bước đầu môi trường nuôi cấy chứa kháng sinh kanamycin Các khuẩn lạc dự tuyển tiếp tục sàng lọc Trang 64 để xác nhận diện gene fliC kỹ thuật PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu cho gene Các dòng cho kết dương tính tiếp tục ni cấy tách chiết plasmid Các plasmid tách chiết sau kiểm tra lại diện gene fliC (do phản ứng PCR khuẩn lạc cho kết dương tính giả) kiểm tra cấu trúc vector tái tổ hợp thu so với thiết kế ban đầu TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T6- 2016 Hình Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-fliC Thang DNA kb; 2: Gene fliC; Sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pET-fliC với cặp mồi đặc hiệu 5’-fliC-NdeI 3’-fliC-XhoI; Plasmid tái tổ hợp pET-fliC; Plasmid tái tổ hợp pET-fliC xử lý với hai enzyme NdeI XhoI; Plasmid pET-28a xử lý với hai enzyme NdeI XhoI Sự diện gene fliC plasmid thu kiểm tra kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene Kết thể Hình 2, giếng cho thấy sản phẩm PCR chứa vạch DNA có kích thước với kích thước 1515 bp gene fliC giếng Bên cạnh đó, chúng tơi tiến hành cắt plasmid thu với cặp enzyme NdeI XhoI dùng để cấu trúc vector tái tổ hợp Kết thể giếng sản phẩm cắt plasmid dự tuyển chứa hai đoạn DNA, đoạn kích thước với sản phẩm cắt plasmid pET28a NdeI XhoI (giếng 6), đoạn cịn lại có kích thước với gene fliC (giếng 2) Như vậy, chèn thành công đoạn gene fliC vào plasmid pET-28a vị trí trình tự nhận biết enzyme NdeI XhoI plasmid theo với thiết kế ban đầu Kết giải trình tự đoạn gene fliC plasmid tái tổ hợp pET-fliC mồi T7pro (kết khơng thể hiện) cho thấy đoạn gene có độ tương đồng 100 % so với trình tự gene fliC S enteritidis công bố đồng khung dịch mã Tạo dòng E coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp pET-fliC Vector tái tổ hợp pET-fliC, sau cấu trúc thành công, biến vào vi khuẩn E coli BL21 (DE3) Hỗn hợp biến nạp trải mơi trường thạch LB có bổ sung kanamycin Những khuẩn lạc mọc môi trường sàng lọc lựa chọn ngẫu nhiên để tiến hành PCR kiểm tra diện vector tái tổ hợp cặp mồi đặc hiệu cho gene fliC Kết Hình cho thấy giếng 4, 5, xuất vạch DNA tương ứng với kích thước1515 bp gene fliC giếng Như vậy, chúng tơi tạo dịng thành cơng chủng E coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp pET-fliC Trang 65 Science & Technology Development, Vol 19, No.T6-2016 Hình Kết PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu 1: Thang DNA kb; Chứng âm; 3: Gene fliC; 4–7: PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu Kiểm tra biểu protein FliC tái tổ hợp Protein FliC tái tổ hợp cảm ứng biểu từ chủng E coli BL21 (DE3)/pET-fliC mô tả phần phương pháp Các mẫu protein pha tổng, tan tủa thu nhận phân tích biểu FliC tái tổ hợp phương pháp SDS-PAGE Western blot Kết phân tích Hình cho thấy có vạch protein biểu vượt mức giếng với kích thước khoảng 53 kDa với kích thước protein FliC tự nhiên khơng thấy có xuất vạch chứng âm chủng E coli BL21 (DE3)/pET-28a có cảm ứng IPTG giếng Thêm vào đó, protein FliC tái tổ hợp biểu dạng dung hợp với 6xHis mã hóa sáu codon có sẵn vector pET-28a nên diện FliC tái tổ hợp xác nhận gián tiếp thơng qua đuôi 6xHis Kết xác nhận diện FliC tái tổ hợp phương pháp Western blot với kháng thể kháng 6xHis Hình cho thấy vạch protein biểu vượt mức điện di SDS-PAGE protein FliC tái tổ hợp protein biểu hầu hết pha tan (Hình 4, giếng 4) Như vậy, FliC tái tổ hợp biểu thành công chủng E coli BL21 (DE3)/pET-fliC dạng dung hợp với đuôi 6xHis Hình Kết phân tích biểu protein FliC tái tổ hợp E coli BL21 (DE3)/pET-fliC 1: Thang protein phân tử lượng thấp; 2: E coli BL21 (DE3)/pET-28a (+)IPTG; 3: E coli BL21 (DE3)/pET-fliC (+)IPTG, pha tổng; 4: E Trang 66 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T6- 2016 coli BL21 (DE3)/pET-fliC (+)IPTG, pha tan; 5: E coli BL21 (DE3)/pET-fliC (+)IPTG, pha tủa Gel nhuộm với thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 Hình Kết nhuộm bạc phân đoạn tinh chế protein FliC tái tổ hợp 1: Thang protein phân tử lượng thấp; 2: Dịch protein tổng từ E coli BL21 (DE3)/pET-fliC (+)IPTG; 3: Phân đoạn dịch protein sau qua cột; 4: Phân đoạn dịch rửa cột; 5, 6: Phân đoạn dung ly protein mục tiêu Tinh protein FliC tái tổ hợp Thông qua việc gắn đuôi dung hợp 6xHis, FliC tái tổ hợp dễ dàng tinh phương pháp tinh chế sắc ký lực Khi dịch protein tổng số cho chảy qua cột tinh chế, protein có mang histidine giữ lại cột thông qua lực histidine với ion Ni2+ có cột Protein mục tiêu sau dung ly khỏi cột phân tích độ tinh gel polyacrylamide Kết phân tích phân đoạn tinh chế Hình cho thấy phân đoạn dung ly giếng cho vạch protein mục tiêu với kích thước với kích thước FliC với độ tinh 95 %; phân đoạn dung ly giếng thu protein mục tiêu với độ tinh 80 % Các kết phân tích độ tinh thực phần mềm Quantity One (Bio-rad) Như vậy, bước đầu tinh thu nhận thành công protein FliC tái tổ hợp với độ tinh 95 % Tuy nhiên, để thu FliC tái tổ hợp tinh với lượng lớn, khảo sát thêm trình tinh chế cần thiết KẾT LUẬN Chúng cấu trúc thành công vector tái tổ hợp mang gene fliC (pET-fliC) mã hóa cho protein FliC có nguồn gốc từ S enteritidis; tạo thành cơng dịng tế bào E coli BL21 (DE3) mang vector pETfliC có khả biểu protein FliC tái tổ hợp pha tan thu nhận FliC tái tổ hợp với độ tinh 95 % Nghiên cứu tạo nguồn cung cấp FliC tái tổ hợp để phục vụ cho nghiên cứu nhằm đánh giá hoạt tính hỗ trợ miễn dịch FliC hướng tới việc phát triển hệ vaccine tái tổ hợp hiệu lực cao Lời cảm ơn: Nghiên cứu tài trợ phần Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-TPHCM khuôn khổ đề tài mã số T2015-14 Trang 67 Science & Technology Development, Vol 19, No.T6-2016 Cloning, expression and purification of the recombinant FliC from Salmonella enteritidis Tran Thi Bao Chau Nguyen Viet Anh Tran Van Hieu University of Science, VNU-HCM ABSTRACT FliC protein from Salmonella enteritidis is digested pET vectors The results of expression of currently interested due to its immunologic recombinant FliC, which was induced by IPTG, adjuvant property for the novel generation of were confirmed by SDS-PAGE and Western blot recombinant vaccines To produce a source for probed with anti-6xHis tag With the purity above further researches on the immune effects of FliC, 95 %, this recombinant FliC can be used as a we generated an Escherichia coli based on material source for next studies on evaluating the recombinant vector called pET-fliC which is adjuvant property of FliC ligated from fliC gene with NdeI and XhoI double Key words: adjuvant, flagellin, FliC, recombinant protein, Salmonella enteritidis TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] N Petrovsky, J.C Aguilar, Vaccine adjuvants: Current state and future trends, Immunology and Cell Biology, 82, 488–496 (2004) [2] F.R Vogel, Improving Vaccine Performance with Adjuvants, Clin Infect Dis., 30 (Supplement 3): S266–S270 (2000) [3] T Kaisho, S Akira, Toll-like receptors as adjuvant receptors, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, 1589, 1– 13 (2002) [4] M.R.A Karam, M Oloomi, M Mahdavi, M Habibi, S Bouzari, Vaccination with recombinant FimH fused with flagellin enhances cellular and humoral immunity against urinary tract infection in mice, Vaccine, 31, 1210–1216 (2013) [5] T Gewirtz, P.O Simon, Jr., C.K Schmitt, L.J Taylor, C.H Hagedorn, A.D O'Brien, et al., Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a Trang 68 [6] [7] [8] [9] proinflammatory response, J Clin Invest, 107, 99–109 ( 2001) J Braga, L.M Massis, B.C Alencar, M.M Rodrigues, M.E Sbrogio-Almeida, L.C Ferreira, Cytotoxic T cell adjuvant effects of three Salmonella enterica flagellins, Braz J Microbiol, 39, 44–9 (2008) J Kremer , K.M O’Meara , S.L Layton , B.M Hargis , K Cole, Evaluation of recombinant Salmonella expressing the flagellar protein fliC for persistence and enhanced antibody response in commercial turkeys, Poultry Science, 90, 752–758 (2010) P.F McDermott, F Ciacci-Woolwine, J.A Snipes, S.B Mizel, High-affinity interaction between gram-negative flagellin and a cell surface polypeptide results in human monocyte activation, Infect Immun, 68, 5525–9 (2000) F Liu, J Yang, Y Zhang, D Zhou, Y Chen, W Gai, et al., Recombinant flagellins with TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T6- 2016 partial deletions of the hypervariable domain lose antigenicity but not mucosal adjuvancy, Biochem Biophys Res Commun, 392,582–7, (2010) [10] S.K Gupta, P Bajwa, R Deb, M.M Chellappa, S Dey, Flagellin A Toll-Like Receptor agonist as an adjuvant in Chicken Vaccines, Clinical and Vaccine Immunology : CVI, 21, 3, 261–270 (2014) Trang 69 ... coli BL21 (DE3) mang vector pETfliC có khả biểu protein FliC tái tổ hợp pha tan thu nhận FliC tái tổ hợp với độ tinh 95 % Nghiên cứu tạo nguồn cung cấp FliC tái tổ hợp để phục vụ cho nghiên cứu... protein FliC tái tổ hợp protein biểu hầu hết pha tan (Hình 4, giếng 4) Như vậy, FliC tái tổ hợp biểu thành công chủng E coli BL21 (DE3)/pET -fliC dạng dung hợp với 6xHis Hình Kết phân tích biểu protein... kb; Chứng âm; 3: Gene fliC; 4–7: PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu Kiểm tra biểu protein FliC tái tổ hợp Protein FliC tái tổ hợp cảm ứng biểu từ chủng E coli BL21 (DE3)/pET -fliC mô tả phần phương