Biểu hiện, tinh sạch và xác định tính chất của enzym cytochrom p450 từ vi khuẩn streptomyces cavourensis ybq59 tái tổ hợp trong escherichia coli

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THÙY DƯƠNG BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA ENZYM CYTOCHROM P450 TỪ VI KHUẨN STREPTOMYCES CAVOURENSIS YBQ59 TÁI TỔ HỢP TRONG ESCHERICHIA COLI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THÙY DƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1701114 BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA ENZYM CYTOCHROM P450 TỪ VI KHUẨN STREPTOMYCES CAVOURENSIS YBQ59 TÁI TỔ HỢP TRONG ESCHERICHIA COLI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Lý Thị Bích Thủy TS Đào Thị Mai Anh Nơi thực hiện: Viện Công nghệ sinh học Bộ mơn Hóa Sinh HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội Trong suốt thời gian em học tập rèn luyện trường, thầy cô người dạy dỗ truyền đạt cho em nhiều tri thức quý báu, nhân cách đạo đức để trở thành người dược sỹ tốt Em xin gửi lời cảm ơn thầy cơ, cán phịng Hóa sinh Thực vật – Viện Cơng nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi, tận tình hướng dẫn hỗ trợ em trình thực tập, nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lý Thị Bích Thủy, người định hướng ý tưởng nghiên cứu, nhiệt tình hướng dẫn em thí nghiệm dạy kiến thức chuyên môn giúp em hồn thành tốt khóa luận Sự động viên khích lệ giúp em có thêm động lực tìm tịi, khám phá, tự tin sáng tạo kiên trì với ý tưởng Đó điều may mắn lớn mà em có bước đầu đường nghiên cứu khoa học Đặc biệt, em muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đào Thị Mai Anh, người thầy người bạn chia sẻ, truyền cảm hứng sống làm việc cho em hệ sinh viên Trường Đại học Dược Hà Nội Em cảm ơn cô tin tưởng giúp đỡ em có hội thực nghiên cứu lĩnh vực u thích Những lời khuyên học cô đã, hành trang em mang theo, điểm tựa tinh thần giúp em vượt qua giây phút khó khăn niềm tin vào đường phía trước Em mong muốn bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Ơn, ThS Phạm Thị Linh Giang thầy cô Bộ môn Thực vật – Đại học Dược Hà Nội, người thầy đưa em đến với nghiên cứu khoa học, cho em niềm yêu thích cỏ dược liệu Việt Nam Những kiến thức, kỹ em học hỏi trình nghiên cứu mơn giúp em có tư ban đầu nghiên cứu khoa học, giúp em thực khóa luận cách tốt Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Vũ Mạnh Cường – cán Phịng Hóa sinh Thực vật – Viện Cơng nghệ sinh học, giúp đỡ em nhiều q trình em thực tập nghiên cứu phịng Cảm ơn anh Phạm Bá Hạnh, bạn Trần Mạnh Cường, Lê Thị Minh Hải, Nguyễn Thị Ngọc Ánh thành viên tổ – lớp NK72, bên cạnh động viên, khích lệ mình, nhờ có người mà xuân trường Dược trở nên rực rỡ thật đáng nhớ Cuối cùng, xin cảm ơn bố mẹ, anh chị, hai cháu Tôm Ben bên cạnh con, tin tưởng, động viên ủng hộ thực mơ ước Đối với con, gia đình điểm tựa vững nhất, động lực để cố gắng phấn đấu đường học tập nghiên cứu phía trước Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 26 tháng năm 2022 Sinh viên Đinh Thùy Dương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Cytochrom P450 (EC 1.14.14.1) 1.1.1 Định nghĩa danh pháp 1.1.2 Vai trò phân bố tự nhiên 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Cấu trúc 1.1.5 Đặc điểm xúc tác 1.1.6 Tương tác với chất .7 1.2 Giới thiệu chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 1.3 Tình hình nghiên cứu cytochrom P450 từ vi khuẩn Streptomyces 1.3.1 Nghiên cứu vai trò ứng dụng cytochrom P450 từ Streptomyces 1.3.2 Tình hình nghiên cứu biểu cytochrom P450 từ Streptomyces tái tổ hợp E coli 12 1.3.3 Tình hình nghiên cứu cytochrom P450 Việt Nam 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị .14 2.1.1 Vật liệu 14 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 14 2.1.3 Hóa chất 15 2.1.4 Môi trường 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Nuôi cấy E.coli .17 2.3.2 Phương pháp điện di SDS - PAGE .18 2.3.3 Tinh cytochrom P450 19 2.3.4 Phương pháp Bradford 20 2.3.5 Xác định hàm lượng cytochrom P450 21 2.3.6 Xác định khả tương tác enzym – chất .23 2.3.7 Xác định số phân ly enzym – chất 23 2.3.8 Xác định độ bền pH 24 2.3.9 Xác định độ bền nhiệt độ 24 2.3.10 Xác định độ bền theo thời gian bảo quản 24 2.3.11 Xử lý số liệu 24 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .25 3.1 Kết 25 3.1.1 Biểu tinh enzym cytochrom P450 25 3.1.2 Xác định khả tương tác enzym với chất dự đoán .30 3.1.3 Xác định ảnh hưởng số yếu tố đến khả hoạt động enzym 32 3.2 Bàn luận 37 3.2.1 Về kết biểu tinh cytochrom P450 tái tổ hợp từ Streptomyces cavourensis YBQ59 E.coli .38 3.2.2 Về kết nghiên cứu tương tác enzym – chất .40 3.2.3 Về kết xác định ảnh hưởng số yếu tố đến nồng độ dạng hoạt động cytochrom P450 tái tổ hợp 41 KẾT LUẬN 42 ĐỀ XUẤT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt µL Microlit µM Micromol DMSO Dimethyl sulfoxide ER Eukaryote FAD Flavin adenin dinucleotid FdR Ferredoxin reductase Fdx Ferredoxin Fldx Flavodoxin FMN Flavin mononucleotid kDa Kilo dalton KPP Potassium phosphate buffer LB Lysogeny broth MIC Minimum inhibitory concentration mM Milimol NA Nutrient agar NADH Nicotinamide adenine dinucleotide NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NB Nutrient broth nM Nanomol NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction SDS - PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TB Terrific broth Đệm kali phosphat Nồng độ ức chế tối thiểu DANH MỤC CÁC BẢNG Thứ tự Tên bảng Trang Bảng 1.1 Phân loại cytochrom P450 dựa protein thành phần tham gia vào chuỗi truyền điện tử Bảng 1.2 Vai trò CYP từ Streptomyces phản ứng 11 Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng 14 Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng 15 Bảng 2.3 Môi trường sử dụng 15 Bảng 2.4 Thành phần loại đệm dung dịch 16 Bảng 2.5 Thành phần gel cô gel tách 19 Bảng 3.1 Kết xác định hàm lượng protein tổng số protein tinh theo phương pháp Bradford 29 Bảng 3.2 Nồng độ CYP tái tổ hợp 100ml môi trường nuôi cấy 29 Bảng 3.3 Giá trị cực đại cực tiểu hấp thụ dung dịch enzym CYP154C tái tổ hợp thêm chất nồng độ khác 32 Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH đến khả hoạt động CYP154C 33 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả hoạt động CYP154C 34 Bảng 3.6 Ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến khả hoạt động theo thời gian CYP154C 35 Bảng 3.7 Ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến khả hoạt động theo thời gian CYP154C 36 DANH MỤC CÁC HÌNH Thứ tự Tên hình Trang Hình 1.1 Mơ hình hệ thống cytochrom P450 ty thể Hình 1.2 Nhân hem dạng Fe protoporfirin IX cytochrom P450 Hình 1.3 Những vùng cấu trúc bảo tồn cấu trúc bậc ba CYP Hình 1.4 Cơ chế hoạt động cytochrom P450 Hình 1.5 Phổ hấp thụ UV enzym cytochrom P450 tương tác với chất/ chất ức chế Hình 1.6 Sự đa dạng chức cytochrom P450 từ Streptomyces, enzym tham gia xúc tác cho nhiều phản ứng sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên phân giải xenobiotic 10 Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 17 Hình 2.2 Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn 21 Hình 3.1 Điện di đồ SDS – PAGE tế bào E.coli C43(DE3) 25 Hình 3.2 Điện di đồ SDS – PAGE hai dòng tế bào E.coli BL21(DE3) C43(DE3) 26 Hình 3.3 Enzym CYP tái tổ hợp tách chiết từ E.coli, bám cột tạo thành dải màu đỏ 27 Hình 3.4 Điện di đồ SDS – PAGE CYP tái tổ hợp qua cột HisPur Ni – NTA 28 Hình 3.5 Phổ hấp thụ CYP tái tổ hợp tinh dải bước sóng 400-500 nm 28 Hình 3.6 Phổ hấp thụ gắn với chất progesteron CYP154C 30 Hình 3.7 Sự thay đổi phổ hấp thụ enzym CYP154C tái tổ hợp thêm chất nồng độ khác vào dung dịch enzym 31 Hình 3.8 Sự phụ thuộc chênh lệch độ hấp thụ cực đại cực tiểu với nồng độ chất dung dịch enzym CYP154C 31 Hình 3.9 Ảnh hưởng pH đến khả hoạt động CYP154C 33 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả hoạt động CYP154C 34 Hình 3.11 Ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến khả hoạt động theo thời gian CYP154C 36 Hình 3.12 Sự gắn vịng imidazol với nguyên tử sắt hem cytochrom P450 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Cytochrom P450 (EC 1.14.14.1) (viết tắt P450 CYP) biết đến chất xúc tác linh hoạt nhất, phân bố rộng khắp tự nhiên, gồm nhiều isozym tham gia vào đường chuyển hóa nhiều chất Các CYP xúc tác cho nhiều phản ứng hóa học khác nhau, oxy hóa chọn lọc phản ứng thường gặp nhất, có vai trị quan trọng q trình sinh tổng hợp nhiều hợp chất nội sinh ngoại sinh [39] Vì vậy, CYP có tiềm lớn trở thành chất xúc tác sinh học ứng dụng nhiều lĩnh vực, đặc biệt lĩnh vực y dược Từ lâu, nhà khoa học giành ý tới CYP từ Streptomyces – lồi vi khuẩn có khả tạo nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học đóng vai trị quan trọng lâm sàng thuốc kháng sinh, kháng nấm, ức chế miễn dịch, ức chế khối u, kháng virus, Việc giải trình tự gen nhiều loài Streptomyces cho thấy số lượng lớn bất thường gen mã hóa cho CYP, có liên quan đến q trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp Đến năm 2017, có 8500 trình tự gen mã hóa cho cytochrom P450 tìm thấy gen Streptomyces, nhiên có khoảng 2,4% số xác định chức 0,4% xác định cấu trúc [53] Vì việc tiếp tục nghiên cứu enzym cytochrom P450 từ Streptomyces cần thiết để khai thác hiệu tiềm enzym cho ứng dụng sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên Streptomyces cavourensis YBQ59 chủng xạ khuẩn phân lập từ rễ Quế - Cinnamomum cassia Tỉnh Yên Bái, Việt Nam Từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn phát nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus, chống nấm, tiêu diệt tế bào ung thư [62] Đặc biệt, kết giải trình tự gen chủng S cavourensis YBQ59 vào năm 2017 cho thấy có 21 gen mã hóa cho cytochrom P450 Vì enzym thường đóng vai trò quan trọng phản ứng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp, để góp phần tìm hiểu khai thác tiềm nguồn enzym CYP từ vi khuẩn S cavourensis YBQ59, tiến hành đề tài: “Biểu hiện, tinh xác định tính chất enzym cytochrom P450 từ vi khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59 tái tổ hợp Escherichia coli” với mục tiêu sau: Biểu số 21 gen mã hóa cho cytochrom P450 từ vi khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59 E.coli Tách chiết tinh cytochrom P450 tái tổ hợp biểu E.coli Xác định số tính chất hóa lý cytochrom P450 tái tổ hợp tinh - Tại thời điểm đo, nồng độ dạng hoạt động CYP154C bảo quản điều kiện cho kết lớn bảo quản điều kiện 3.2 Bàn luận Tìm kiếm chất xúc tác sinh học lĩnh vực nhà khoa học quan tâm vài thập kỷ gần đây, đặc tính vượt trội chúng so với chất xúc tác hóa học truyền thống, với mục đích cuối nhằm tối ưu nâng cao hiệu trình sản xuất, tạo sản phẩm với chất lượng tốt hơn, quy trình cơng nghệ thân thiện với môi trường Enzym cytochrom P450 từ sinh vật nói chung từ vi khuẩn Streptomyces nói riêng, trình bày nguồn enzym phong phú, có vai trị nhiều phản ứng tổng hợp hợp chất tự nhiên phân giải chất độc Mặc dù tiềm CYP ứng dụng lĩnh vực y dược, nông nghiệp môi trường chứng minh nhiều nghiên cứu giới, số lượng CYP xác định cấu trúc, chức năng, đưa vào ứng dụng chiếm phần nhỏ tổng số cytochrom P450 lồi sinh vật có mặt trái đất Với mục đích ứng dụng cytochrom P450 vào lĩnh vực sản xuất đời sống, đề tài lựa chọn đối tượng nghiên cứu enzym cytochrom P450 từ Streptomyces YBQ59 nhiều lý Thứ nhất, chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ thuốc thường có khả tạo nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học, khơng cần thiết cho phát triển vi khuẩn mà cịn đóng vai trò sinh thái quan trọng giúp chúng tương tác với nhau, với vật chủ bảo vệ vật chủ khỏi công vi sinh vật gây bệnh Các kháng sinh tìm thấy từ Streptomyces nội sinh bao gồm: munumbicin, kakadumycin, – arylcoumarin analogs, anthracycline, coronamycin, cedarmycin, naphthomycin K, brartemianin sử dụng điều trị nhiều nhiễm khuẩn nặng người [18], [42] Streptomyces cavourensis YBQ59 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ rễ Quế - loài thảo dược truyền thống, sử dụng rộng rãi Việt Nam để làm gia vị, chiết xuất tinh dầu, vị dược liệu có nhiều tác dụng kích thích tiêu hóa, hỗ trợ tuần hồn, chống oxy hóa,… Đặc biệt, từ gen chủng vi khuẩn xác định 21 gen mã hóa cho cytochrom P450 Vì vậy, lựa chọn nghiên cứu enzym CYP từ S cavourensis YBQ59 hứa hẹn phát enzym có tiềm ứng dụng cao Trong trình tiến hành nghiên cứu enzym cytochrom P450 từ Streptomyces cavourensis YBQ59 tái tổ hợp E.coli, thu số kết đáng lưu ý có số vấn đề cần bàn luận sau 37 3.2.1 Về kết biểu tinh cytochrom P450 tái tổ hợp từ Streptomyces cavourensis YBQ59 E.coli a Về kết biểu CYP tái tổ hợp Để tạo số lượng lớn chọn lọc enzym, cần biểu gen mã hóa cho CYP từ Streptomyces cavourensis sinh vật khác nuôi cấy để sinh vật sản xuất CYP hàng loạt Có nhiều hệ biểu sử dụng để biểu cytochrom P450 tái tổ hợp, vi khuẩn Escherichia coli, nấm men Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Trong khuôn khổ đề tài, lựa chọn E.coli để biểu CYP tái tổ hợp, số vi sinh vật thường sử dụng công nghiệp, E.coli hệ biểu lựa chọn nhiều chúng có thời gian sinh trưởng ngắn, suất biểu cao, chi phí cho sản xuất thấp dễ dàng thao tác điều khiển [3] Bên cạnh đó, hệ gen E.coli nghiên cứu kỹ lưỡng với đặc tính hệ gen xác định rõ, khơng chứa gen mã hóa cho cytochrom P450, E.coli vật chủ thích hợp cho việc xác định đặc tính ứng dụng enzym [2] Kết biểu enzym CYP khác cho thấy tế bào biểu CYP154C tế bào biểu CYP154A xuất band đậm, có kích thước 46 – 48 kDa, kích thước dự đốn từ trình tự acid amin (giếng 1, – hình 3.1) Band không thấy xuất mẫu đối chứng, mẫu mang plasmid chứa gen tái tổ hợp, không cảm ứng biểu (giếng – hình 3.1) Kết enzym CYP154C biểu tốt CYP154A Theo Francis Page, khả biểu protein E.coli phụ thuộc vào bốn yếu tố chủ yếu: (1) protein cần biểu hiện, (2) véc tơ biểu hiện, (3) dòng tế bào biểu (4) thiết bị, vật liệu nuôi cấy tế bào vi khuẩn [17] Mức độ biểu protein khác không giống nhau, biểu điều kiện, khác biệt đặc tính nội protein (ví dụ: nhóm kỵ nước, vùng cấu trúc phức tạp liên kết disulfur) Khi CYP biểu vật chủ khác, có mơi trường nội bào khác với S cavourensis YBQ59 (ví dụ pH, độ thẩm thấu), tương tác protein với mơi trường làm thay đổi chế gấp cuộn dẫn đến khác biệt mức độ biểu b Về kết tinh Ảnh hưởng imidazol đến khả hoạt động enzym Sau trình tinh sạch, dung dịch tinh có chứa CYP imidazol đệm KPP 100 mM mang đo nồng độ CYP dạng hoạt động theo phương pháp Omura Sato Kết cho thấy xuất đỉnh hấp thụ cực đại 420 nm, thay đỉnh hấp thụ đặc trưng 450 nm, chúng tơi nghi ngờ enzym bị hoạt tính sau q trình tinh Tuy nhiên tiến hành cô đặc dung dịch tinh loại phân 38 tử nhỏ, cách ly tâm dịch ống milipore có màng lọc giữ lại phân tử lớn 30kDa, pha loãng dịch cô đặc đo nồng độ CYP dạng hoạt động, phổ thu có đỉnh hấp thụ cực đại 450 nm hình ảnh phổ hấp thụ đặc trưng enzym Hình 12 Sự gắn vòng imidazol với nguyên tử sắt hem cytochrom P450 Nghiên cứu từ tài liệu cho thấy chất có chứa vịng imidazol triazol thuốc kháng nấm nhóm azol, có khả ức chế hoạt động cytochrom P450 cách gắn vào trung tâm hoạt động liên kết với nguyên tử sắt hem thông qua ngun tử nito (Hình 3.12) [49], [61] Từ rút kết luận rằng, có mặt imidazol dung dịch ảnh hưởng đến khả hoạt động cytochrom P450, imidazol có khả gắn vào trung tâm hoạt động cạnh tranh vị trí gắn với CO chất Vì vậy, tiến hành tinh CYP tái tổ hợp có sử dụng dung dịch đệm chứa imidazol, cần loại imidazol khỏi dung dịch enzym tinh để không ảnh hưởng tới độ xác thí nghiệm Mức độ tinh enzym qua cột HisPur Ni – NTA Theo kết điện di đồ SDS – PAGE (Hình 3.4), mẫu protein tinh (giếng giếng – Hình 3.4) ngồi băng enzym CYP cịn nhiều băng mờ vị trí khác, cho thấy enzym chưa tinh hoàn toàn Có số nguyên nguyên nhân dẫn tới gắn không đặc hiệu protein his – tag với cột Ni – NTA Theo Hochuli (1987), lực protein his – tag với Ni – NTA phụ thuộc vào cấu trúc bậc I protein, nên protein tinh trạng thái cịn hoạt tính Nhìn chung, bị biến tính, khả gắn protein his – tag với Ni – NTA tốt hơn, lúc đuôi histidin bộc lộ hoàn toàn, đồng thời khả gắn protein không đặc hiệu dung dịch tinh với cột giảm xuống Mức độ tinh protein his – tag từ hệ biểu sinh vật nhân thực thường thấp so với hệ biểu khác, có mặt nhiều protein nội sinh mà cấu trúc có chứa phân tử histidin vị trí liên tiếp, có chứa vùng gắn ion kim loại Ngoài ra, tỷ lệ hạt Ni – NTA nhồi cột protein đưa lên cột, mức độ tạp nhiễm cột sau sử dụng nhiều lần, thời gian lưu mẫu cột, 39 ảnh hưởng tới mức độ tinh protein, yếu tố cần lưu ý để khảo sát, điều chỉnh tối ưu trình tinh [57] So với số nghiên cứu khác biểu tinh cytochrom P450 tái tổ hợp E.coli, kết đề tài cho thấy enzym CYP154C CYP154A có mức độ biểu 349,45 ± 0,00 nmol/L 336,26 ± 9,93 nmol/L, mức biểu trung bình, đủ dùng cho thí nghiệm xác định đặc tính enzym tiếp sau [22], [34], [37] Vì vậy, với mục tiêu tinh để bước đầu nghiên cứu CYP từ S cavourensis YBQ59, thực tinh bước qua cột HisPur Ni – NTA đảm bảo tính chọn lọc, mức độ tinh hiệu phù hợp Để có kết biểu tinh tốt hơn, cần nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy biểu gen, phương pháp điều kiện phá tế bào, điều kiện tinh để thu lượng enzym CYP lớn với mức độ tinh cao 3.2.2 Về kết nghiên cứu tương tác enzym – chất Kết nghiên cứu cho thấy progesteron có khả gắn với trung tâm hoạt động CYP154C làm xuất thay đổi đặc trưng phổ hấp thụ enzym Phức hợp CYP – progesteron có số phân ly Kd = 1,51 ± 0,22 µM, chứng tỏ progesteron có khả gắn chặt với CYP154C chất tiềm chuyển hóa enzym Vì vậy, CYP154C steroid hydroxylase Nhiều nghiên cứu enzym steroid hydroxylase thực giới, khẳng định enzym có khả xúc tác cho trình hydroxyl hóa chọn lọc steroid, ứng dụng sinh tổng hợp dẫn xuất từ steroid cách dễ dàng hiệu so với phản ứng tổng hợp hóa học truyền thống [59] Một số CYP tham gia vào phản ứng hydroxyl hóa chọn lọc steroid coi steroid hydroxylase, nghiên cứu ứng dụng CYP125A13 từ Streptomyces peucetius xúc tác cho phản ứng hydroxyl hóa C – 27 phân tử cholesterol [52], CYP450 từ Streptomyces roseochromogenes có khả chuyển hóa progesteron thành 16α – hydroxyprogesteron [6], hay CYP154C3 từ Streptomyces griseus với khả xúc tác cho phản ứng chuyển hóa nhiều hợp chất steroid (testosteron, progesteron, adrenosteron,…) để tạo dẫn xuất 16α – hydroxyl hóa [38] Để khẳng định chắn khả chuyển hóa steroid CYP154C từ S cavourensis YBQ59 tái tổ hợp E.coli, cần tiếp tục khảo sát khả tương tác CYP với chất tiềm khác, nghiên cứu phản ứng chuyển hóa chất CYP có mặt protein vận chuyển điện tử 40 3.2.3 Về kết xác định ảnh hưởng số yếu tố đến nồng độ dạng hoạt động cytochrom P450 tái tổ hợp Để ứng dụng cytochrom P450 từ Streptomyces cavourensis YBQ59 chuyển hóa chất sau này, trước tiên cần nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym nhằm tìm điều kiện mà enzym chuyển hóa chất tốt Tuy nhiên, đề tài nghiên cứu bước đầu enzym chưa rõ chuyển hóa cho chất nào, nên thực thí nghiệm nghiên cứu hoạt tính enzym khơng khả thi Do đó, với mục tiêu khảo sát sơ ảnh hưởng số yếu tố để tìm điều kiện bảo quản enzym điều kiện tiến hành thích hợp cho thí nghiệm CYP từ S cavourensis YBQ59 tái tổ hợp E.coli, phạm vi đề tài khảo sát ảnh hưởng số yếu tố tới nồng độ dạng hoạt động CYP tái tổ hợp từ E.coli thay hoạt tính enzym, thông số liên quan tới khả hoạt động enzym, xác định độc lập mà khơng cần có mặt chất Các điều kiện lựa chọn để khảo sát điều kiện thường gặp áp dụng trình xử lý, bảo quản, phản ứng enzym Từ kết nghiên cứu, cho thấy pH lý tưởng cho hoạt động enzym 7,4, nhiệt độ 30oC 37oC vòng enzym giữ khả hoạt động tương đối ổn định, enzym bảo quản tốt để giữ khả hoạt động gần ban đầu điều kiện 4oC dung dịch đệm có chứa glycerol 50% vịng ngày Phương pháp áp dụng nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng cytochrom P450 thông qua phổ hấp thụ CO Omura Sato Ở quy mơ phịng thí nghiệm, chúng tơi tiến hành tạo khí CO cách cho acid formic (HCOOH) phản ứng với acid sulfuric đặc (H2SO4) bình nón thủy tinh có nút nhánh để cắm ống dẫn khí Khí CO tạo dẫn qua hệ thống ống dẫn có khóa tương tự dây truyền dịch y tế, vào cuvet có chứa enzym Khóa sử dụng để điều chỉnh tốc độ sục khí để lưu giữ khí bình chưa sử dụng tới Bộ dụng cụ tạo khí CO tương đối nhỏ gọn, tiết kiệm phù hợp với quy mơ nhỏ nghiên cứu phịng thí nghiệm Tuy nhiên tạo sục khí CO dụng cụ chưa thực tối ưu, nguyên nhân việc điều chỉnh tốc độ sục khí cách đóng mở khóa tay, nên khó có đồng lần thí nghiệm khác nhau, dẫn đến kết nồng độ CYP dạng hoạt động có độ lặp mẫu tương tự nhau, không loại trừ sai số sục khí mẫu khác Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu cải tiến dụng cụ tạo khí CO để khơng thuận tiện, tiết kiệm mà cịn giúp q trình định lượng xác tạo kết nhiều ý nghĩa 41 KẾT LUẬN Sau tiến hành biểu hiện, tinh xác định số tính chất cytochrom P450 tái tổ hợp từ vi khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59 tái tổ hợp E.coli, rút số kết luận sau: Đã biểu gen Orf_5310 Orf_6202 mã hóa cho CYP154C CYP154A từ vi khuẩn S cavourensis YBQ59 E.coli, thu enzym tái tổ hợp có kích thước khoảng 46 48 kDa kết điện di đồ SDS – PAGE Đã tinh CYP154C CYP154A tái tổ hợp cột HisPur Ni – NTA có khả gắn chọn lọc với his – tag protein Hai enzym có mức độ biểu môi trường nuôi cấy 349,45 336,26 nM/L Đã xác định progesteron chất tiềm enzym CYP154C, với số phân ly enzym – chất Kd = 1,51 ± 0,22 ĐỀ XUẤT Tối ưu quy trình biểu hiện, tinh enzym CYP154C CYP154A từ Streptomyces cavourensis YBQ59 tái tổ hợp E.coli Xác định redox partner enzym CYP154C CYP154A tái tổ hợp Đánh giá khả chuyển hóa progesteron CYP154C Sàng lọc chất tiềm khác CYP154C CYP154A 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Anh Đào Thị Mai (2003), "Nghiên cứu ảnh hưởng Aslem hệ thống enzym Cyt-P450 gan động vật thí nghiệm", Luận văn Thạc sỹ Dược học, Đại học Dược Hà Nội Tiếng anh Agematu H., Matsumoto N., et al (2006), "Hydroxylation of testosterone by bacterial cytochromes P450 using the Escherichia coli expression system", Biosci Biotechnol Biochem, 70(1), pp 307-11 Baneyx F (1999), "Recombinant protein expression in Escherichia coli", Curr Opin Biotechnol, 10(5), pp 411-21 Bérdy J (2005), "Bioactive microbial metabolites", J Antibiot (Tokyo), 58(1), pp 1-26 Bernhardt R (2006), "Cytochromes P450 as versatile biocatalysts", J Biotechnol, 124(1), pp 128-45 Berrie J R., Williams R A., et al (1999), "Microbial transformations of steroids-XI Progesterone transformation by Streptomyces roseochromogenespurification and characterisation of the 16alpha-hydroxylase system", J Steroid Biochem Mol Biol, 71(3-4), pp 153-65 Block H., Maertens B., et al (2009), "Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review", Methods Enzymol, 463, pp 439-73 Brannon D R., Horton D R., et al (1974), "Microbial hydroxylation of 10 11 12 acronycine", J Med Chem, 17(6), pp 653-4 Bui V N., Nguyen T T., et al (2016), "Procarcinogens - Determination and Evaluation by Yeast-Based Biosensor Transformed with Plasmids Incorporating RAD54 Reporter Construct and Cytochrome P450 Genes", PLoS One, 11(12), pp e0168721 Cho M A., Han S., et al (2019), "Streptomyces Cytochrome P450 Enzymes and Their Roles in the Biosynthesis of Macrolide Therapeutic Agents", Biomol Ther (Seoul), 27(2), pp 127-133 Chung L., Liu L., et al (2001), "Deletion of rapQONML from the rapamycin gene cluster of Streptomyces hygroscopicus gives production of the 16-Odesmethyl-27-desmethoxy analog", J Antibiot (Tokyo), 54(3), pp 250-6 Conner K P., Woods C M., et al (2011), "Interactions of cytochrome P450s with their ligands", Arch Biochem Biophys, 507(1), pp 56-65 13 Dangi B., Lee C W., et al (2019), "Characterization of two steroid hydroxylases from different Streptomyces spp and their ligand-bound and - 14 unbound crystal structures", Febs j, 286(9), pp 1683-1699 Denisov I G., Makris T M., et al (2005), "Structure and chemistry of cytochrome P450", Chem Rev, 105(6), pp 2253-77 15 Do T T., Dao T M A., et al (2004), "Effect of silymarin on the activity of rabbit liver microsomal cytochrome P450", Vietn J Biotechnol 2, pp 57 - 64 16 Do T T., Le T T D., et al (2007), "Identification of drug - metabolizing enzymes on rabbit liver silymarin - induced microsomal P450 by application of two - dimensional nano liquid chromatography coupled online with tandem mass spectrometry", Vietn J Med Mater., 12, pp 127 - 132 17 18 Francis D M., Page R (2010), "Strategies to optimize protein expression in E coli", Curr Protoc Protein Sci, Chapter 5(1), pp Unit 5.24.1-29 Golinska P., Wypij M., et al (2015), "Endophytic actinobacteria of medicinal 20 plants: diversity and bioactivity", Antonie Van Leeuwenhoek, 108(2), pp 26789 Gomes T A., Zanette C M., et al (2020), "An overview of cell disruption methods for intracellular biomolecules recovery", Prep Biochem Biotechnol, 50(7), pp 635-654 Graziani E I (2009), "Recent advances in the chemistry, biosynthesis and 21 pharmacology of rapamycin analogs", Nat Prod Rep, 26(5), pp 602-9 Guengerich F P., Waterman M R., et al (2016), "Recent Structural Insights 19 22 23 24 25 26 into Cytochrome P450 Function", Trends Pharmacol Sci, 37(8), pp 625-640 Halkier B A., Nielsen H L., et al (1995), "Purification and characterization of recombinant cytochrome P450TYR expressed at high levels in Escherichia coli", Arch Biochem Biophys, 322(2), pp 369-77 Hannemann F., Bichet A., et al (2007), "Cytochrome P450 systems biological variations of electron transport chains", Biochim Biophys Acta, 1770(3), pp 330-44 Haque S., Gong Y., et al (2019), Pharmaceutical Biocatalysis: Fundamentals, Enzyme inhibitors, and Enzyme in Health and Diseases, Jenny Stanford Publishing, pp 534 - 538 Hilberath T., Raffaele A., et al (2021), "Evaluation of P450 monooxygenase activity in lyophilized recombinant E coli cells compared to resting cells", AMB Express, 11(1), pp 162 Ikeda H., Omura S (1997), "Avermectin Biosynthesis", Chem Rev, 97(7), pp 2591-2610 27 Isin E M., Guengerich F P (2008), "Substrate binding to cytochromes P450", Anal Bioanal Chem, 392(6), pp 1019-30 28 Janocha S., Zapp J., et al (2013), "Resin acid conversion with CYP105A1: an enzyme with potential for the production of pharmaceutically relevant diterpenoids", Chembiochem, 14(4), pp 467-73 29 30 Jefcoate C R (1978), "Measurement of substrate and inhibitor binding to microsomal cytochrome P-450 by optical-difference spectroscopy", Methods Enzymol, 52, pp 258-79 Kerr B M., Thummel K E., et al (1994), "Human liver carbamazepine metabolism Role of CYP3A4 and CYP2C8 in 10,11-epoxide formation", Biochem Pharmacol, 47(11), pp 1969-79 31 32 33 34 Kittelmann Matthias, Lattmann Rene, et al (1993), "Preparation of 10,11Epoxy-carbamazepine and 10,11-Dihydro-10-hydroxy-carbamazepine by Microbial Epoxidation and Hydroxylation", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 57(9), pp 1589-1590 Kruger N J (1994), "The Bradford method for protein quantitation", Methods Mol Biol, 32, pp 9-15 Laemmli U K (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227(5259), pp 680-5 Li P., Guan H., et al (2009), "Heterologous expression, purification, and characterization of cytochrome P450sca-2 and mutants with improved solubility in Escherichia coli", Protein Expr Purif, 65(2), pp 196-203 35 36 37 38 Lim Y R., Hong M K., et al (2012), "Crystal structure of cytochrome P450 CYP105N1 from Streptomyces coelicolor, an oxidase in the coelibactin siderophore biosynthetic pathway", Arch Biochem Biophys, 528(2), pp 111-7 Ly T T B., Schifrin A., et al (2017), "Improvement of a P450-Based Recombinant Escherichia coli Whole-Cell System for the Production of Oxygenated Sesquiterpene Derivatives", J Agric Food Chem, 65(19), pp 38913899 Ly T T., Khatri Y., et al (2012), "CYP264B1 from Sorangium cellulosum So ce56: a fascinating norisoprenoid and sesquiterpene hydroxylase", Appl Microbiol Biotechnol, 95(1), pp 123-33 Makino T., Katsuyama Y., et al (2014), "Regio- and stereospecific hydroxylation of various steroids at the 16α position of the D ring by the Streptomyces griseus cytochrome P450 CYP154C3", Appl Environ Microbiol, 80(4), pp 1371-9 39 Manikandan P., Nagini S (2018), "Cytochrome P450 Structure, Function and Clinical Significance: A Review", Curr Drug Targets, 19(1), pp 38-54 40 Matsuoka T., Miyakoshi S., et al (1989), "Purification and characterization of cytochrome P-450sca from Streptomyces carbophilus ML-236B (compactin) induces a cytochrome P-450sca in Streptomyces carbophilus that hydroxylates ML-236B to pravastatin sodium (CS-514), a tissue-selective inhibitor of 3hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase", Eur J Biochem, 184(3), pp 41 707-13 McLean K J., Sabri M., et al (2005), "Biodiversity of cytochrome P450 redox systems", Biochem Soc Trans, 33(Pt 4), pp 796-801 42 Nalini M S., Prakash H S (2017), "Diversity and bioprospecting of 43 actinomycete endophytes from the medicinal plants", Lett Appl Microbiol, 64(4), pp 261-270 Nguyen H H., Nguyen T H., et al (2012), "Novel homozygous p.Y395X 44 45 46 47 48 49 50 mutation in the CYP11B1 gene found in a Vietnamese patient with 11βhydroxylase deficiency", Gene, 509(2), pp 295-7 Nguyen H Q., Vu N T., et al (2018), "Draft Genome Sequence of Streptomyces cavourensis YBQ59, an Endophytic Producer of Antibiotics Bafilomycin D, Nonactic Acid, Prelactone B, and 5,11-Epoxy-10-Cadinanol", Microbiol Resour Announc, 7(11), pp Nguyen K T., Nguyen N L., et al (2021), "Characterization of a thermophilic cytochrome P450 of the CYP203A subfamily from Binh Chau hot spring in Vietnam", FEBS Open Bio, 11(1), pp 124-132 O'Keefe D P., Tepperman J M., et al (1994), "Plant Expression of a Bacterial Cytochrome P450 That Catalyzes Activation of a Sulfonylurea Pro-Herbicide", Plant Physiol, 105(2), pp 473-482 Omura T., Gotoh O (2017), "Evolutionary origin of mitochondrial cytochrome P450", J Biochem, 161(5), pp 399-407 Omura T., Sato R (1964), "THE CARBON MONOXIDE-BINDING PIGMENT OF LIVER MICROSOMES I EVIDENCE FOR ITS HEMOPROTEIN NATURE", J Biol Chem, 239, pp 2370-8 Peyton L R., Gallagher S., et al (2015), "Triazole antifungals: a review", Drugs Today (Barc), 51(12), pp 705-18 Porter T D., Coon M J (1991), "Cytochrome P-450 Multiplicity of isoforms, substrates, and catalytic and regulatory mechanisms", J Biol Chem, 266(21), pp 13469-72 51 Quaderer R., Omura S., et al (2006), "Pentalenolactone biosynthesis Molecular cloning and assignment of biochemical function to PtlI, a cytochrome P450 of Streptomyces avermitilis", J Am Chem Soc, 128(40), pp 13036-7 52 Rimal H., Subedi P., et al (2020), "Characterization of CYP125A13, the First Steroid C-27 Monooxygenase from Streptomyces peucetius ATCC27952", J Microbiol Biotechnol, 30(11), pp 1750-1759 53 Rudolf J D., Chang C Y., et al (2017), "Cytochromes P450 for natural product biosynthesis in Streptomyces: sequence, structure, and function", Nat Prod Rep, 34(9), pp 1141-1172 54 Sawada N., Sakaki T., et al (2004), "Conversion of vitamin D3 to 1alpha,25- 55 dihydroxyvitamin D3 by Streptomyces griseolus cytochrome P450SU-1", Biochem Biophys Res Commun, 320(1), pp 156-64 Schenkman J B., Sligar S G., et al (1981), "Substrate interaction with 56 57 cytochrome P-450", Pharmacol Ther, 12(1), pp 43-71 Shrestha P., Oh T J., et al (2008), "Designing a whole-cell biotransformation system in Escherichia coli using cytochrome P450 from Streptomyces peucetius", Biotechnol Lett, 30(6), pp 1101-6 Spriestersbach A., Kubicek J., et al (2015), "Purification of His-Tagged Proteins", Methods Enzymol, 559, pp 1-15 58 Sun Y., Zeng W., et al (2013), "Investigations of heme ligation and ligand switching in cytochromes p450 and p420", Biochemistry, 52(34), pp 5941-51 59 Szaleniec M., Wojtkiewicz A M., et al (2018), "Bacterial steroid hydroxylases: enzyme classes, their functions and comparison of their catalytic mechanisms", Appl Microbiol Biotechnol, 102(19), pp 8153-8171 Tung Nguyen Van, Hoang Nguyen Huy, et al (2019), "Mining cytochrome P450 genes throught next generation sequencing and metagenomic analysis from Binh Chau hot spring", Vietnam Journal of biology, 3(41), pp Verras A., Ortiz de Montellano P R (2006), "Protein dynamics and imidazole 60 61 62 63 binding in cytochrome P450 enzymes", Biochem Soc Trans, 34(Pt 6), pp 11702 Vu H T., Nguyen D T., et al (2018), "Antimicrobial and Cytotoxic Properties of Bioactive Metabolites Produced by Streptomyces cavourensis YBQ59 Isolated from Cinnamomum cassia Prels in Yen Bai Province of Vietnam", Curr Microbiol, 75(10), pp 1247-1255 Watve M G., Tickoo R., et al (2001), "How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces?", Arch Microbiol, 176(5), pp 386-90 64 Werck-Reichhart D., Feyereisen R (2000), "Cytochromes P450: a success story", Genome Biol, 1(6), pp Reviews3003 65 White R E., Sligar S G., et al (1980), "Evidence for a homolytic mechanism of peroxide oxygen oxygen bond cleavage during substrate hydroxylation by cytochrome P-450", J Biol Chem, 255(23), pp 11108-11 66 Xue Y., Wilson D., et al (1998), "Hydroxylation of macrolactones YC-17 and narbomycin is mediated by the pikC-encoded cytochrome P450 in Streptomyces venezuelae", Chem Biol, 5(11), pp 661-7 PHỤ LỤC Bảng 4.1 Số liệu xây dựng đường chuẩn protein BSA y = 0,0038 + 0,0304 R2 = 0,9877 BSA (µg/ml) OD1 OD2 ODtb 20 0,087 0,099 0,0930 40 0,185 0,162 0,1735 60 0,279 0,268 0,2735 80 0,373 0,370 0,3715 100 0,441 0,451 0,446 150 0,669 0,570 0,6195 200 0,770 0,736 0,753 PHỤ LỤC Hình 2.1 Véc tơ pET – 17b PHỤ LỤC 3.1 Trình tự acid amin mã hóa cho CYP154C MTRIALDPFVRDLDGESAALRAAGPLAEVELPGGVHVYAVTHHAEARALLTD SRVVKDINVWNAWRRGEIPMDWPLIGLANPGRSMLTVDGADHRRLRTLVAQ ALTVRRVERLREGIEALTNASLEKLAAHPAGEPVDLKAEFAYPLPMNVISELM GVDAADHPRLKELFEKFFSTQTPPEEFVQLMADLDTLFRRIIEDKRANPGDDLT SALIAASENGDHLTDEEILNTLQLIIAAGHETTISLIVNAVKALQTHPEQRKKVL DGEIGWDGVIEETLRWNTPTSHVLIRFATEDIEVGDKILPKGEALIVSFAALGR DERQHGPTAGEFDATRTPNRHIAFGHGPHVCPGAALSRLEAGIALPALYEKFP ELELAVPASELRNKPIVTQNDLYELPVKLGCPFGHEE3.2 Trình tự acid amin mã hóa cho CYP154A MAAQPTKPIVLDPTGADHHGEHRQLRAHGAAVRVDILGVTAWSITDPDVLKR LLKSKDVSKDGRAHWPDFQDVVQTWPLALWVGVQNMFTAYGANHRRLRRL VGPALSARRVDDLGGVVENIVAHLLDDIEALAEEVIDLRERLAYPLPIAVIGHL MGVPVDQREGFRAIVDGVFDTTLSAQEQEVNTSRLYAALDGLIAARRAEPGD DMTSLLIAARDEEGDGGGLSDAELRDTLLLMISAGYETTVNVIDQAVSLLLTH PEQLAHVRAGRADWSDVVEETLRLEPAVKHLPLRFAVADVTLPDGQTIARGE AILASYAAANRHPGWHDDADTFDIRRPEQDHLAFGHGIHFCLGAPLARLEVA VSLRMLFTRFPELHLAVPADQLEPLGSLISNGHQQLPVRCRLTGPRRT- ... YBQ59 tái tổ hợp E .coli Biểu cytochrom P450 tái tổ hợp E .coli Tinh cytochrom P450 tái tổ hợp Xác định tính chất cytochrom P450 tái tổ hợp tinh Biến nạp plasmid, nuôi cấy E .coli cảm ứng biểu gen,... ? ?Biểu hiện, tinh xác định tính chất enzym cytochrom P450 từ vi khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59 tái tổ hợp Escherichia coli? ?? với mục tiêu sau: Biểu số 21 gen mã hóa cho cytochrom P450 từ vi. .. THÙY DƯƠNG MÃ SINH VI? ?N: 1701114 BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA ENZYM CYTOCHROM P450 TỪ VI KHUẨN STREPTOMYCES CAVOURENSIS YBQ59 TÁI TỔ HỢP TRONG ESCHERICHIA COLI KHÓA LUẬN TỐT