Nghiên cứu tinh sạch và xác định hoạt tính miễn dịch của fucoidan từ rong sụn (kappaphycus alvarezii)

Untitled VAN HIEN UNIVERSITY JOURNAL OF SCIENCE VOLUME 6 NUMBER 3 112 NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH MIỄN DỊCH CỦA FUCOIDAN TỪ RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii) Đinh Thị Huyền1, Lê Thị Mỹ N[.]

VAN HIEN UNIVERSITY JOURNAL OF SCIENCE VOLUME NUMBER NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH MIỄN DỊCH CỦA FUCOIDAN TỪ RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii) Đinh Thị Huyền1, Lê Thị Mỹ Ngọc2, Nguyễn Thị Minh Chi3, Nguyễn Phạm Cẩm Tiên4, Hoàng Thị Ngọc Nhơn5 1, 2, 3, 4, Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm Tp HCM nhonhtn@hufi.edu.vn Ngày nhận bài: 7/11/2018, Ngày duyệt đăng: 17/12/2018 Tóm tắt Rong sụn (Kappaphycus alvarezii) loại rong biển có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, đáng ý fucoidan Về mặt hóa học, fucoidan chuỗi phân tử cao polysaccharides có thành phần chủ yếu sulfate fucose, có nhiều hoạt tính sinh học q kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng mốc, kháng đơng máu, chống khối u… đặc biệt hoạt tính miễn dịch Nghiên cứu tiến hành thu nhận fucoidan từ rong sụn (khu vực Đầm Mơn, tỉnh Khánh Hịa), tinh fucoidan phương pháp sắc ký lọc gel, xác định hàm lượng fucoidan từ phân đoạn thu được; Thực xác định khối lượng phân tử fucoidan rong sụn phương pháp GPC; thử hoạt tính miễn dịch với MTT Các phân đoạn chọn qua sắc ký lọc gel có hàm lượng fucoidan 150,14 (μg/ml) độ tinh 36,48% Khối lượng phân tử trung bình fucoidan thấp có giá trị 4,2 kDa Fucoidan ghi nhận có hoạt tính gây tăng sinh tế bào đơn nhân máu ngoại vi (Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC), nồng độ 250 µg/mL thể tính gây độc hoạt tính gây độc giảm dần theo nồng độ Từ khóa: fucoidan, hoạt tính miễn dịch, rong sụn Kappaphycus alvarezii, tinh Study of purification and immune activity of fucoidan from Kappaphycus alvarezii Abstract Kappaphycus alvarezii is a seaweed containing numerous carbohydrate with biological activities, especially fucoidan Fucoidan is fucose polysaccharides (FCSPs) with diverse biological activities including antioxidant, anticoagulant, antiviral, antitumor, anti-inflammatory and especially immune activity In this study, fucoidan purification and immune acitivity from Kappaphycus alvarezii algae (collected at Dam Mon area, Khanh Hoa provine) were investigated Fucoidan was purified from the extract by gel filtration chromatography, the content and the purity in fractions were determined The molecular mass of fucoidan was determined by GPC and the immune activity of fucoidan was evaluated with MTT The average molecular weight of low fucoidan was 4.2 kDa Fucoidan has been shown to be effective in the treatment of several types of cancer that cause peripheral blood mononuclear hyperplasia Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC), at a concentration of 250μg/ml exhibiting toxicity and toxic depressant activity Keywords: fucoidan, immune activity, Kappaphycus alvarezii, purification Đặt vấn đề Rong sụn thuộc ngành tảo đỏ loài rong biển có giá trị kinh tế cao Trong rong sụn, hàm lượng nước chiếm 77-91% lại phần trăm chất khô Trong chất khô chứa chủ yếu 112 carbohydrate, protein, chất khoáng, lipid, sắc tố, enzym… Hàm lượng carbohydrate dao động từ 50-60% thường tập trung chủ yếu thành tế bào gồm có cellulose loại đường có hoạt tính sinh học (Nisho cộng sự, 1991) TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC VĂN HIẾN Fucoidan hợp chất có chứa fucose polysaccharides, có mặt tảo biển có nhiều chức liên quan đến hoạt động sinh lý (Ale cộng sự, 2011) Fucoidan hợp chất đa dạng công thức cấu tạo nên có nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm, ứng dụng cho thực phẩm chức năng, chống ung thư, miễn dịch, chống viêm, kháng virus, thuốc chống đơng máu chất chống oxy hóa (Ale cộng sự, 2011; Fitton, 2011; Lakmal cộng sự, 2014) Rong biển biết đến nguồn fucoidan lớn nhất, nguồn lợi chưa khai thác nhiều (Hahn cộng 2012) Phương pháp trích ly thường sử dụng tiến hành theo bước tiền xử lý khác nhau, sử dụng dung mơi cho q trình trích ly, kết tủa, sắc ký để tinh fucoidan có dịch trích Tiền xử lý cần thiết để loại bỏ chất diệp lục, mannitol, muối hợp chất nhỏ khác Hệ MeOH-CHCl3-H2O với tỷ lệ (4:2:1) (Ale cộng sự, 2011) ethanol 80-85% hai cách thường sử dụng xử lý nguyên liệu trước trích ly (Yang cộng sự, 2008) Trích ly dung môi acid (Ale cộng sự, 2011) nước nóng với nhiệt độ 60 −1000C (Luo cộng sự, 2009) CaCl2 sử dụng để kết tủa alginate trình chiết (Bilan cộng sự, 2002) Theo nghiên cứu tách chiết fucoidan dung dịch acid, chẳng hạn HCl, nâng cao hiệu suất thu nhận fucoidan (Kawamoto cộng sự, 2006) Việc bổ sung CaCl2 để kết tủa alginate làm tăng độ tinh khiết fucoidan làm giảm sản lượng Tuy nhiên, vấn đề quan tâm nghiên cứu nâng cao độ tinh fucoidan từ chế phẩm dịch trích ly để nghiên cứu hoạt tính sinh học quý giá hợp chất Fucoidan biết đến hợp chất quan trọng nghiên cứu hoạt tính chống ung thư nên hoạt tính miễn dịch tính chất quan tâm Nghiên cứu trình tinh fucoidan từ rong sụn phương pháp sắc ký lọc gel để nâng cao độ tinh fucoidan, nhà xác định hoạt tính sinh học fucoidan từ rong sụn làm sở cho ứng TẬP SỐ dụng chế phẩm fucoidan sau Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu, địa điểm, thời gian Rong sụn (Kappaphycus alvarezii) tươi thu nhận khu vực Đầm Mơn, tỉnh Khánh Hịa Rong rửa nước loại bỏ tạp chất rây, sấy đối lưu 600C, nghiền thành bột máy xay khô Nghiên cứu thực tai Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, Trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, 93 Tân Kỳ Tân Quý, phường Tân Sơn Nhì, quận Tân Phú, thành phố Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 10 năm 2017 đến tháng năm 2018 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu tinh fucoidan phương pháp lọc gel Quy trình trích ly, thu nhận tinh fucoidan từ dịch trích tiến hành theo Kim cộng (2007) sau: Rong tươi  Xử lý  Trích ly  Kết tủa  Lọc gel  Fucoidan tinh Quy trình chi tiết tiến hành thu nhận tinh fucoidan Trích ly fucoidan: Cân 200g rong sụn tươi xử lý với ethanol 85% 24 để loại chất màu, lipid tạp chất khác Rong sau xử lý trích ly với HCl 1M, nhiệt độ 800C giờ, tỷ lệ nguyên liệu dung môi (HCl 1M) 1:40 (w/v – tỷ lệ khối lượng/ thể tích (g/mL)) Thu dịch, bổ sung Acid trichloroacetic (TCA) tỷ lệ dịch trích/TCA (50:0,2), nhiệt độ 40C sau ly tâm 5000 vịng/phút 15 phút loại tủa protein, thu dịch trích fucoidan Kết tủa fucoidan: Kết tủa fucoidan với ethanol 99% qua hai giai đoạn Thêm cồn 99% vào bình chứa dịch trích với tỷ lệ 30:69 (w/w – tỷ lệ khối lượng/khối lượng (g/g)) để nồng độ cồn dung dịch 30%, giữ nhiệt độ lạnh ly tâm loại tủa thu dịch Tiếp tục thêm cồn 99% vào dịch (29:40 w/w) để nồng độ cồn 70%, giữ 40C 12 để kết tủa fucoidan, ly tâm 5000 vòng/phút 15 phút, thu tủa fucoidan (Marudhupandi cộng sự, 2014) Tinh fucoidan từ dịch trích: Hịa tan tủa fucoidan với đệm, ly tâm lấy dịch cho 113 VAN HIEN UNIVERSITY JOURNAL OF SCIENCE vào cột sắc ký lọc gel Các thông số cố định: Thể tích mẫu: 5mL, khối lượng tủa: 1g, 15g gel sephadex G-100, pH (đệm)=7, tốc độ dòng: 5mL/10phút, khảo sát nhiệt độ phòng Các tiêu theo dõi: Hàm lượng độ tinh khiết fucoidan sau sắc ký lọc gel Các loại đệm khảo sát (tris-HCl, phosphate, acetate) nồng độ NaCl rửa giải khảo sát (0,5M; 1M; 1,5M; 2M) Tất thí nghiệm thực lặp lại lần 2.2.2 Xác định hoạt tính miễn dịch fucoidan Máu pha dung dịch muối cân bằng, đặt lên lớp Ficoll, ly tâm thu nhận lớp PBMC rửa dung dịch muối cân bằng, ly tâm để thu hòa tế bào vào mL dung dịch ly giải hồng cầu ủ từ 3-5 phút Ly tâm thu tế bào hịa tế bào vào 1mL mơi trường RPMI 1640 có bổ sung 10% FBS Xác định mật độ tế bào tỷ lệ tế bào sống, chết phương pháp Trypan blue (Altman cộng sự, 1993) Tế bào sau phủ lên đĩa với mật độ 105 tế bào/giếng cảm ứng với thuốc Ủ 48 370C, 5% CO2 Sau bổ sung 20µL MTT (nồng độ cuối 0,5 µg/mL), ủ đĩa tối, ly tâm thu tinh thể formazan hịa lại 100µL isopropanol Ghi nhận giá trị OD máy ELISA Reader bước sóng 570nm 590nm Tất thí nghiệm thực lặp lại lần 2.3 Các phương pháp phân tích 2.3.1 Xác định khối lượng phân tử fucoidan từ rong sụn phương pháp GPC Trọng lượng phân tử trung bình (Mw) fucoidan rong sụn phân tích thiết bị Shimadzu LC-20A với RID-10A - dò khúc xạ cột Tosoh (TSKgel Super H2000 7,8 mm x 30 cm) khối lượng mẫu lần tiêm 10μl sử dụng nước dung môi rửa giải 650C với tốc độ dòng chảy ml/phút 2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng fucoidan Thêm mL dung dịch fucoidan nồng độ vào ống nghiệm, làm lạnh 40C (2-3 phút) Thêm 4,5 mL H2SO4 (85%), đun sơi 10 phút, sau để nguội, thêm 0,3 mL acid cysteine hydrochloric 0,1% vào ống nghiệm, ủ bóng tối giờ, sau đo độ hấp thụ 114 VOLUME NUMBER quang phổ kế 396 nm 430 nm Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Xác định hàm lượng fucoidan có mẫu phương pháp đo quang phổ UV-VIS 390nm 430nm, theo đường chuẩn 𝐲 = 𝟎, 𝟎𝟎𝟕𝟒𝐱 + 𝟎, 𝟎𝟎𝟓𝟗 (Dische cộng sự, 1948) Độ tinh khiết = (khối lượng fucoidan) (khối lượng chất khô) 2.3.3 Phương pháp xác định thử hoạt tính miễn dịch (phương pháp MTT) Hoạt tính miễn dịch fucoidan xác định cách sử dụng phương pháp MTT (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide để khảo sát tăng sinh PBMC với mật độ tế bào dùng phủ giếng 105 tế bào/giếng, nồng độ dung môi nước 1% Nồng độ mầu fucoidan thí nghiệm 50 µg/mL, 100 µg/mL, 150 µg/mL, 200 µg/mL, 250 µg/mL 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Mỗi thí nghiệm tiến hành lặp lại ba lần, kết trình bày dạng giá trị trung bình ± giá trị sai số Kết tính tốn phần mềm Microft Office Excel 2010 phần mềm thống kê JMP Kết phân tích ANOVA với độ tin cậy 95%, so sánh khác biệt nghiệm thức qua phép thử LSD Kết thảo luận 3.1 Khảo sát tinh fucoidan phương pháp sắc ký lọc gel Sau thực q trình trích ly thu nhận fucoidan thu dịch trích có hàm lượng fucoidan 44,25µg/mL Sau kết tủa fucoidan tiến hành trình sắc ký lọc gel loại đệm phổ biến là: Tris-HCl, phosphate, acetate Cân 1g mẫu tủa hòa 5mL đệm trước đưa vào cột sắc ký lọc gel Mẫu nạp vào cột sắc ký lọc gel lắp sẵn, dùng đệm rửa mẫu cột sắc ký với thể tích gấp lần thể tích cột, điều chỉnh tốc độ dòng 5mL/10phút, mẫu hứng theo phân đoạn phân đoạn 10mL, hứng 10 phân đoạn loại đệm Các phân đoạn thu đem đo quang để xác định độ tinh khiết hàm lượng fucoidan Ảnh hưởng loại đệm nồng độ muối NaCl rửa giải sắc ký lọc gel thể Hình TẬP SỐ 180 36,48 160 150,14 140 28,60 27,97 120 106,89 104,19 100 80 60 40 20 Đệm TrisĐệm Đệm HCl phosphat acetate 40 35 30 25 20 15 10 Độ tinh khiết (%) Hàm lượng fucoidan(𝜇g/ml) TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC VĂN HIẾN Hàm lượng Độ tinh khiết Hình Ảnh hưởng loại đệm sắc ký lọc gel Từ kết Hình cho thấy, loại đệm sử dụng sắc ký lọc gel ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến hàm lượng fucoidan phân đoạn thu hồi Về độ tinh khiết, với đệm Tris-HCl pH cao (36,48%) so với loại đệm cịn lại có khác có ý nghĩa (p0,05) hàm lượng thu nhận đệm TrisHCl cao (150,14 µg/mL) Tiếp theo, tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối NaCl rửa giải, hàm lượng fucoidan qua nồng độ NaCl thể qua Bảng Bảng Ảnh hưởng nồng độ NaCl rửa giải sắc ký lọc gel Nồng độ muối NaCl (M) Hàm lượng (µg/mL) Độ tinh khiết (%) 0,5 (3,96±0,78)a (5,73±0,54)a (183,74±2,38)c (36,64±0,88)c b 1,5 (22,66±2,73) (17,92±1,05)b (2,97±0,50)a (5,37±0,75)a Trong cột, giá trị đánh dấu chữ giống khác khơng có ý nghĩa mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α=0,05) Hàm lượng fucoidan rửa giải muối có nồng độ 1M cho hàm lượng cao 183,74µg/mL đạt độ tinh khiết 36,64% Phương pháp sắc ký lọc gel tinh dựa vào trọng lượng phân tử, nồng độ muối rửa giải có ảnh hưởng đáng kể đến q trình tinh sắc ký lọc gel Tuy nhiên, từ kết thấy sắc ký lọc gel phương pháp làm tăng độ tinh fucoidan phân đoạn thu Như vậy, phương pháp sắc ký lọc gel có hiệu việc tinh fucoidan từ dịch trích ly từ rong sụn Phân tử lượng fucoidan có khoảng dao động lớn (1kDa-1,500kDa) nên chọn gel sử dụng tinh fucoidan phương pháp sắc ký lọc gel G100 (4,000-150,000) Phương pháp nhiều tác giả sử dụng hiệu để nghiên cứu tinh fucoidan như: Mak (2012) tinh fucoidan từ rong Undaria pinnatifida, Cong cộng (2015) tinh fucoidan từ rong Sargassum fusiforme, Synytsya cộng (2010) tinh fucoidan từ Undaria pinnatifida 3.2 Xác định khối lượng phân tử fucoidan từ rong sụn phương pháp GPC Sau thực việc trích ly HCl, tinh phương pháp lọc gel Tiến hành xác định khối lượng phân tử fucoidan từ rong sụn phương pháp GPC, kết thể Hình 115 VAN HIEN UNIVERSITY JOURNAL OF SCIENCE VOLUME NUMBER Hình Kết phổ đồ xác định khối lượng phân tử fucoidan rong sụn phương pháp GPC Kết xác định khối lượng phân tử fucoidan rong sụn phương pháp GPC cho thấy khối lượng phân tử trung bình fucoidan thấp có giá trị 4,2 kDa Như công bố khối lượng phân tử trung bình fucoidan dao động khoảng kDa – 1500 kDa (Li cộng sự, 2008) Tuy nhiên, kết cho thấy khối lượng phân tử trung bình fucoidan nghiên cứu nằm vùng khối lượng phân tử trung bình thấp, nhiều yếu tố tác động đến trình trích ly ảnh hưởng nhiệt độ loại dung mơi trích ly, làm phân cắt mạch polysaccharide thành nhiều đoạn có khối lượng phân tử nhỏ fucoidan có khối lượng phân tử khác thu từ lồi (Altman cộng sự, 1993) Nghiên cứu này, dung môi HCl với nồng độ cao sử dụng nên ảnh hưởng đến kích thước phân tử fucoidan thu nhận Nhiều nhà khoa học chứng minh trọng lượng phân tử fucoidan thấp ứng dụng nhiều hoạt tính sinh học fucoidan cao, bên cạnh trọng lượng phân tử thấp dùng làm chất chống oxy hóa có hiệu tốt (McNeil, 2013) Kim cộng (2007) công bố khối lượng phân tử thấp (1389 ~ 3749 Da) fucoidan có giá trị cho q trình sản xuất fuco-oligosaccharides có hoạt tính chống đơng cao (Duarte cộng sự, 2001) García-Ríos (2012) cho khối 116 lượng phân tử trung bình fucoidan thấp lợi cho trình điều trị tác dụng hệ miễn dịch chống viêm Nishino cộng (1991) công bố hàm lượng sulfate yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học fucoidan Fucoidan có trọng lượng phân tử thấp (