KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA POLISACCARIT TÙ CÂY THUỐC XUÂN HOA PSEUDERANTHEMUM PALATIEERUM (NEES) RALK TRÊN CÁC CYTOKINE T1ÈN VIÊM TRÊN MÔ HÌNH IN VITRO Người.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA POLISACCARIT TÙ CÂY THUỐC XUÂN HOA PSEUDERANTHEMUM PALATIEERUM (NEES) RALK TRÊN CÁC CYTOKINE T1ÈN VIÊM TRÊN MƠ HÌNH IN VITRO Người hướng dẫn : TS VÕ HOÀI BẮC Sinh viên thực : NGUYỄN THANH THỦY Lóp : 13-01 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC -C355O tì GíiĩO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐÈ TÀI NGHIÊN cúu TINH SẠCH VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA POLISACCARIT TÙ CÂY THƯỐC XƯÂN HOA PSEUDERANTHEMUMPALATIFERUM (NEES) RALK TRÊN CÁC CYTOKINE TIỀN VIÊM TRÊN MƠ HÌNH IN VITRO Người hướng dẫn : TS VỎ HOÀI BẲC Sinh viên thực : NGUYỀN THANH THỦY Lớp : 13-01 GVHD: TS Võ Hồi Bắc Khóa Luận Tốt Nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm - Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện, môi trường tốt giúp thực tốt khóa luận Tơi xin bày tỏ lời càm ơn sâu sắc tới TS.Võ Hồi Bắc tận tình chi báo, hướng dần giúp đỡ suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Viện Đại Học Mớ Hà Nội, phòng ban liên quan, Ban Chù Nhiệm khoa công nghệ sinh học, tồn thầy giáo giáng dạy, hướng dẫn đe tơi có kiến thức ngày hơm Cuối cùng, tơi xin bày tỏ tình cám lịng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè tận tinh giúp đỡ, động viên suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2017 Sinh viên NGUYỄN THANH THỦY Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 GVHD: TS Võ Hồi Bắc Khóa Luận Tốt Nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐÀU Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cún cua đề tài PHẦN I - TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm viêm 1.2 Vai trị ciía đại thực bào (macrophage) đáp ứng viêm 1.3 Vai trò cytokine đáp ứng viêm 1.4 Giói thiệu chung Xuân Hoa Pseuderanthemumpalatiferum .6 1.5 Polisaccarit 1.5.1 Oligosaccarit 1.5.2 Polisaccarit 1.6 Vai trò sinh học tác dụng polisaccarit thực vật 12 1.6.1 Vai trò sinh học ý nghĩa kinh tế 12 1.6.2 Tác dụng chừa bệnh số polisaccarit thực vật 12 1.7 Những nghiên cún Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum 14 1.7.1 Kinh nghiệm dân gian sử dụng Xuân Hoa 14 1.7.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học Xuân Hoa 15 1.7.3 Những nghiên cứu in vitro dược tính 16 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯÚ .20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 20 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 20 2.2 Phuong pháp nghiên cún 20 2.2.1 Xử lý nguyên liệu 20 2.2.2 Định lượng polisaccarit phương pháp phenol - sunfuric axit (Dubois, 1956) 21 Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2.2.3 GVHD: TS Võ Hồi Bắc Nghiên cứu điều kiện tối ưu chiết rút polisaccarit 22 2.2.3.1 Anh hưởng cùa nồng độ ethanol đen hiệu suat chief rút polisaccarit 22 2.2.3.2 Anh hường cùa nhiệt độ đến khả chiết rút polisaccharit 22 2.2.3.3 Xác định thời gian toi ưu chiết rút polisaccarit 23 2.2.3.4 Xác định tỷ lệ ngun liệu dung mơi thích họp chiết rút polisaccarit 23 2.2.4 Phương pháp tinh poiisaccarit 24 2.2.5 Đo độ hấp thụ quang phổ dung dịch polisaccarit 25 2.2.6 Phương pháp sắc ký thấm thấu gel GPC xác định độ trọng lượng phân tử cúa polisaccarit .25 2.2.7 Phương pháp xác định mức ánh hưởng polisaccarit len khả sống sót cúa đại thực bào 25 2.2.8 Phương pháp định lượng nồng độ cytokine IL-6 TNF-a 26 2.2.9 Phân tích thống kê 27 PHÀN III: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Nghiên cứu điều kiện tối ưu chiết rút polisaccarit .28 3.1.1 Ảnh hướng cúa nồng độ ethanol đến hiệu suất chiết rút polisaccarit 28 3.1.2 Ánh hướng nhiệt độ đến hiệu suất chiết rút polisaccarit 29 3.1.3 Thời gian tối ưu chiết rút polisaccarit 30 3.1.4 Tỷ lệ ngun liệu dung mơi thích hợp chiết rút polisaccarit 31 3.2 Tinh polisaccarit 32 3.3 Sơ đồ tinh chế phẩm polisaccarit 34 3.4 Kiểm tra độ trọng luợng phân tử chế phẩm polisaccarit.35 3.5 Đánh giá hoạt tính độc tố polisaccarit tới khả sống ciía tế bào macrophage 37 3.6 Đánh giá ảnh huơng polisaccarit đến giải phóng cytokine 37 Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hoài Bắc PHẦN IV: KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 48 Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 GVHD: TS Võ Hồi Bắc Khóa Luận Tốt Nghiệp DANH MỤC BẢNG Báng 2.1 Xây dựng đồ thị chuẩn glucoz 21 Báng 3.1 Hoạt tính polisaccarit phân đoạn qua cột Sephadex GI00 33 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Xn Hoa Pseuderanthemumpalatiferum (Nees) Radik Hình 3.1 Ánh hường nồng độ ethanol đến hàm lượng polisaccarit chiết xuất 28 Hình 3.2 Ảnh hướng nhiệt độ đến hàm lượng polisaccarit chiết xuất 29 Hình 3.3 Thời gian tối ưu chiết rút polisaccarit 30 Hình 3.4 Tý lệ dung mơi thích hợp chiết rút polisaccarit 31 Hình 3.5 Sắc ký qua cột Sephadex GI00 32 Hình 3.6 Sơ đồ tinh chế phấm polisaccarit 34 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng cùa polisaccarit chiết từ Xuân Hoa 35 Hình 3.8 Pho sắc ký tham thấu gel GPC polisaccarit tinh từ Xuân Hoa p palatiferum 36 Hình 3.9 Anh hướng cứa polisaccarit lên khả sống chết cúa te bào RAW264.7 37 Hình 3.10 Ảnh hưởng cùa polisaccarit tinh giải phóng 38 cúa 1L-6 38 Hình 3.11 Ảnh hưởng polisaccarit tinh giải phóng TNF-a39 Hình 1: Đồ thị chuấn glucoz theo phương pháp DuBoietal 48 Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hoài Bắc DANH MỤC NHŨNG TÙ VIẾT TẮT A490 : bước sóng 490nm A585 : bước sóng 585nm BSA : albumin huyết bò OD : optical density TCA : axit tricloaxctic IL-6 : interleukin-6 Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 GVHD: TS Võ Hồi Bắc Khóa Luận Tốt Nghiệp MỞ ĐÀU Đặt vấn đề Tại Việt Nam, bệnh ve viêm thường sử dụng thuốc tống hợp Các thuốc điều trị viêm glucocorticoid, phenylbutazol, dielofenac cần phái sứ dụng dài ngày thường gây hiệu q phụ cho sức khóe người bệnh Vì vậy, hướng nghiên cứu sử dụng hợp chất có nguồn gốc tự nhiên Y, Dược thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học giới việc sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược giảm tác dụng phụ chi phí điều trị Theo Y học cố truyền, nhiều vị thuốc chứa chất nhầy dùng phố biến tạo máu, chống viêm, chữa lành vết thương Trong năm gần polisaccarit nhóm hợp chất nhà khoa học giới quan tâm tác dụng quan trọng chúng tăng cường miễn dịch, kháng bổ thể, kháng viêm, chống loét, chổng đông máu, phân húy fibrin Các nghiên cứu trước cho thấy Xuân Hoa p palatiferum chứa hàm lượng cao polisaccarit có tác dụng tăng cường miền dịch chuột tiêm chất gây suy giám miễn dịch cyclophosphamide Cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radik thuộc họ Ơrơ Acanthaceae dùng dân gian Việt Nam đe chữa nhiều bệnh như: nhiễm khuẩn tiêu hoá, trĩ, chấn thưong chảy máu, tiêu mủ vết thương Trong khoảng 15 năm gần đây, nhiều nhà khoa học Việt Nam giới xác minh số tác dụng sinh học thuốc như: kháng khuấn, kháng nấm, tác dụng chống oxi hóa, giảm huyết áp, hạ đường huyết Tuy nhiên, việc nghiên cứu cấu trúc, đặc tính tác dụng dược lý chi tập trung vào nhóm chất như: flavonoids, phytol, triterponoid saponin, stigmasterol, salicylic acid Cho đến chưa có cơng bố nghiên cứu sâu đặc tính sinh hóa, tác dụng kháng viêm Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 GVHD: TS Võ Hoài Bắc Khóa Luận Tốt Nghiệp polisaccarit từ thuốc Xuân Hoa Trong khóa luận chúng tơi tinh xác định ảnh hướng polisaccarit từ thuốc Xuân Hoa p palatiferum cytokine tiền viêm mô hình in vitro Các kết nghiên cứu đề tài góp phần bố sung nhũng thơng tin khoa học thuốc quý Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu đề tài Tinh polisaccarit tìr thuốc Xuân Hoa p Palatiferum (Ncss) Radlk có độ 95% Xác định độ trọng lượng phân tứ polisaccarit Đánh giá ánh hướng cùa polisaccarit tinh cytokine tiền viêm mơ hình in vitro Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 GVHD: TS Võ Hồi Bắc Khóa Luận Tốt Nghiệp Hình 3.6 Sơ đồ tinh chế phẩm polisaccarit Nguyễn Thanh Thủy 34 Lớp: 13-01 GVHD: TS Võ Hoài Bắc Khóa Luận Tốt Nghiệp 3.4 Kiểm tra độ trọng lượng phân tử chế phẳm polisaccarit Đe khảo sát độ chế phẩm polisaccarit chiết từ Xuân Hoa p palatiferum Trong trinh chiết rút, đo độ hấp thụ quang phổ từ 200-700nm Khi tiến hành đo độ hấp thụ quang phổ dịch chiết dung dịch polisaccarit qua giai đoạn tinh sạch, nhận thấy chế phẩm polisaccarit đạt độ cao đường hấp thụ ánh sáng cùa dung dịch chi cịn đinh bước sóng từ 200-220nm (hình 3.7) Độ hấp thụ quang phố polisaccarit chiết từ Xuân Hoa Trắng Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng polisaccarit chiết từ Xuân Hoa Nguyễn Thanh Thủy 35 Lớp: 13-01 GVHD: TS Võ Hồi Bắc Khóa Luận Tốt Nghiệp Độ trọng lượng phân tử cúa polisaccarit sau tinh qua cột Sephadex GI00 đánh giá qua sắc ký thấm thấu gcl GPC Hệ thống sắc ký lóng thẩm thấu/lọc gel dìing để xác định xác cỡ trọng lượng phân tử sinh học hay đặc tính polymer Ket từ sắc ký GPC cho thấy phân bố trọng lượng phân tử hẹp, chất thu có độ cao, trọng lượng phân tử (Mw = 2321 g/mol) (hình 3.8) Ket hợp đánh giá chế phấm tinh phương pháp phenol-sunfuric axit (Dubois, 1956), chế phẩm polisaccarit tinh sau qua cột Sephadex G100 có độ tinh đạt (97 ± 2,1 %) Hình 3.8 Phổ sắc ký thẩm thấu gel GPC polysaccharit tinh từ Xuân Hoa p palatiferum Do cấu trúc polisaccarit phức tạp việc nghiên cứu cấu trúc polisaccarit cịn khó khăn, đòi hỏi nhiều thời gian nghiên cứu sâu Nguyễn Thanh Thủy 36 Lớp: 13-01 GVHD: TS Võ Hoài Bắc Khóa Luận Tốt Nghiệp 3.5 Đánh giá hoạt tính độc tố polisaccarit tói khả sống cua tế bào macrophage Anh hường cứa polisaccarit tinh từ Xuân Hoa p Palatiferum (XH) (lên khả sống xót đại thực bào RAW264.7 xác định thí nghiệm MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyltetrazolium bromide) Khả sống xót cứa tế bào giếng tra thuốc XH nồng độ 10, 20, 30 pg/ml khơng có khác biệt đáng kế so với sống xót tế bào giếng đối chứng sinh học (giếng tế bào chi ni mơi trường ni cấy) (Hình 3.9) Ket q cho thấy polisaccarit tinh khơng có khả gây độc với đại thực bào Nồng độ sử dụng cho thí nghiệm Hình 3.9 Ảnh hưởng polisaccarit lên khả sống chết cua tế bào RAW264.7 p> 0,05 ( sai khác nhóm ) 3.6 Đánh giá ảnh hưởng polisaccarit đến giải phóng cytokine Trong năm gần polisaccarit nhóm hợp chất nhà khoa học giới quan tâm tác dụng quan trọng cùa chúng tăng cường miền dịch, chống ưng thư, chống oxi hóa Nhiều nghiên cứu cho thấy polisaccarit từ thực vật có khả điều hịa miễn Nguyễn Thanh Thủy 37 Lớp: 13-01 GVHD: TS Võ Hồi Bắc Khóa Luận Tốt Nghiệp dịch (Indranil, 2011), kháng viêm Kết qua nghiên cứu trước cùa cho thấy chế phẩm polisaccarit tinh phần (độ 77,8%) từ Xuân Hoa có khả phục hồi số chức quan tuyến ức, lách điều hòa miền dịch chuột tiêm chất gây suy giảm miễn dịch cyclophosphamide (luận văn Vũ Thị Thu Trang, sinh viên K19, Viện Đại học Mở) Trong luận văn này, đánh giá ảnh hường polisaccarit tinh hồn tồn đến giái phóng cytokine tiền viêm mơ hình in vitro Đe đánh giá hiệu polisaccarit tinh từ Xuân Hoa Hoa p Palatiferum trinh này, Polisaccarit nồng độ 5, 10 pg/ml môi trường nuôi cấy tra vào giếng tế bào RAW 264.7 Cảm ứng đại thực bào RAW 264.7 LPS với nồng độ ụg/ml 24 theo mô tả chi tiết phần phương pháp Lần lượt thu dịch nồng độ để phục vụ cho bước cúa thí nghiệm phân tích cytokine Nịng độ XH (ng/ml) Hình 3.10 Ảnh hưởng polisaccarit tinh giải phóng cua IL-6 #.■ khác có ý nghĩa nhóm gáy cảm ứng LPS (+) so với nhóm đối chứng khơng gãy LPS (-); *• khác có ý nghĩa nhóm LPS điều trị XH (lOug) so với nhóm LPS khơng điều trị LPS điều trị XH (5pg) Nguyễn Thanh Thủy 38 Lớp: 13-01 GVHD: TS Võ Hồi Bắc Khóa Luận Tốt Nghiệp Từ hình 3.10 cho thấy tất cá nhóm đại thực bào RAW 264.7 gây cảm ứng giải phóng cao hàm lượng IL-6 Polisaccarit tinh từ Xuân Hoa p Palatiferum với nồng độ 10pg/ml ức chế trình sản xuất cytokine tiền viêm IL-6 so với nhóm tế bào gây đáp ứng viêm LPS không điều trị (p