Mangiferin C19H18O11 là một C – glucoside xanthone với nhiều hoạt tính dược lý quan trọng như kháng oxy hóa kháng khuẩn điều hòa miễn dịch đặc biệt trong điều trị đái tháo đường loại 2 được tìm thấy chủ yếu trong lá xoài Cao chiết mangiferin thô trong ethanol từ lá xoài còn nhiều tạp chất được nghiên cứu làm sạch bằng phương pháp chiết phân đoạn lỏng – lỏng với diclometan và ethyl acetate thu được các cao phân đoạn có độ phân cực khác nhau và chứa ít hợp chất hơn cao chiết thô ban đầu Từ đó chọn ra cao ethyl acetate để tục tiếp tách bằng sắc ký cột hở với pha tĩnh được nhồi bởi silica gel 60 0 040 – 0 063 mm sử dụng pha động là hỗn hợp chloroform ethanol với độ phân cực tăng dần Trong nghiên cứu này các cao phân đoạn được định tính bằng sắc ký lớp mỏng định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC đồng thời khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa Kết quả cho thấy trong cao ethyl acetate chứa hàm lượng mangiferin khá cao 107 233 mg g mangiferin tinh sạch được có độ tinh khiết 94 2 so với mangiferin chuẩn và hàm lượng mangiferin trong 1 g bột lá xoài nghiên cứu là 8 2 mg g Mangiferin tinh sạch có khả năng kháng oxy hóa IC50 15 5479 μg mL cao hơn cao thô IC50 27 522 μg mL 1 77 lần cao hơn mangiferin chuẩn IC50 16 383 μg mL 1 05 lần và thấp hơn so với vitamin C IC50 2 5508 μg mL 6 09 lần Tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm của cao thô các cao phân đoạn mangiferin chuẩn và mangiferin tinh sạch bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên môi trường thạch đối với vi khuẩn Escherichia coli E coli Salmonella và nấm mốc Aspergillus flavus kết quả cho thấy cao thô có khả năng kháng tốt vi khuẩn E coli còn cao ethyl acetate có khả năng kháng tốt cả vi khuẩn E coli và Salmonella tuy nhiên tại nồng độ đem khảo sát hoạt tính kháng khuẩn thì mangiferin chuẩn và mangiferin tinh sạch vẫn chưa có khả năng kháng các chủng vi sinh vật thử nghiệm này Nội dung đồ án tốt nghiệp gồm 3 chương Mở đầu Chương 1 Tổng quan Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Chương 3 Kết quả và thảo luận Kết luận và kiến nghị
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TINH SẠCH DỊCH CHIẾT MANGIFERIN TỪ LÁ XOÀI BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHÂN ĐOẠN VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MANGIFERIN SAU TINH SẠCH Người hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ TRÚC LOAN Sinh viên thực hiện: HỒ THỊ CỎ MAY Số thẻ sinh viên: 107150155 Lớp: 15H2B Đà Nẵng, 12/2019 TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu tinh dịch chiết mangiferin từ xoài phương pháp chiết phân đoạn đánh giá hoạt tính sinh học mangiferin sau tinh Sinh viên thực hiện: Hồ Thị Cỏ May Số thể SV: 107150155 Lớp: 15H2B Nội dung đồ án tốt nghiệp gồm chương: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Kết luận kiến nghị Mangiferin (C19 H18 O11 ) C – glucoside xanthone với nhiều hoạt tính dược lý quan trọng kháng oxy hóa, kháng khuẩn, điều hịa miễn dịch đặc biệt điều trị đái tháo đường loại tìm thấy chủ yếu xồi Cao chiết mangiferin thơ ethanol từ xồi cịn nhiều tạp chất nghiên cứu làm phương pháp chiết phân đoạn lỏng – lỏng với diclometan ethyl acetate, thu cao phân đoạn có độ phân cực khác chứa hợp chất cao chiết thơ ban đầu Từ chọn cao ethyl acetate để tục tiếp tách sắc ký cột hở với pha tĩnh nhồi silica gel 60 (0,040 – 0,063 mm), sử dụng pha động hỗn hợp chloroform : ethanol với độ phân cực tăng dần Trong nghiên cứu cao phân đoạn định tính sắc ký lớp mỏng, định lượng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đồng thời khảo sát hoạt tính kháng khuẩn kháng oxy hóa Kết cho thấy, cao ethyl acetate chứa hàm lượng mangiferin cao 107,233 mg/g; mangiferin tinh có độ tinh khiết 94,2% so với mangiferin chuẩn hàm lượng mangiferin g bột xoài nghiên cứu 8,2 mg/g Mangiferin tinh có khả kháng oxy hóa (IC50 = 15,5479 μg/mL) cao cao thơ (IC50 = 27,522 μg/mL) 1,77 lần, cao mangiferin chuẩn (IC50 = 16,383 μg/mL) 1,05 lần thấp so với vitamin C (IC50 = 2,5508 μg/mL ) 6,09 lần Tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao thô, cao phân đoạn, mangiferin chuẩn mangiferin tinh phương pháp khoanh giấy khuếch tán môi trường thạch vi khuẩn Escherichia coli (E coli), Salmonella nấm mốc Aspergillus flavus , kết cho thấy cao thơ có khả kháng tốt vi khuẩn E coli, cịn cao ethyl acetate có khả kháng tốt vi khuẩn E coli Salmonella; nhiên nồng độ đem khảo sát hoạt tính kháng khuẩn mangiferin chuẩn mangiferin tinh chưa có khả kháng chủng vi sinh vật thử nghiệm ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự – Hạnh phúc KHOA HÓA NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Hồ Thị Cỏ May Lớp: 15H2B Số thẻ sinh viên: 107150155 Khoa: Hóa Ngành: Cơng Nghệ Thực Phẩm Tên đề tài đồ án: “Nghiên cứu tinh dịch chiết mangiferin từ xoài phương pháp chiết phân đoạn đánh giá hoạt tính sinh học mangiferin sau tinh sạch” Đề tài thuộc diện: Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Các số liệu liệu ban đầu: Nội dung phần thuyết minh tính tốn: - Nhiệm vụ - Lời mở đầu - Chương 1: Tổng quan - Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết thảo luận - Kết luận kiến nghị - Tài liệu tham khảo - Phụ lục Các vẽ, đồ thị (ghi rõ loại kích thước vẽ): Họ tên người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Trúc Loan Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 01/09/2019 Ngày hoàn thành đồ án: 18/12/2019 Đà Nẵng, ngày tháng Trưởng Bộ môn Đặng Minh Nhật năm 2019 Người hướng dẫn Nguyễn Thị Trúc Loan LỜI NÓI ĐẦU Sau tháng thực đề tài “Nghiên cứu tinh dịch chiết mangiferin từ xoài phương pháp chiết phân đoạn đánh giá hoạt tính sinh học mangiferin sau tinh sạch”, hướng dẫn tận tình TS Nguyễn Thị Trúc Loan với giúp đỡ Th.S Đặng Thanh Long bạn sinh viên phịng thí nghiệm, em hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến quý Thầy Cô khoa Hóa nói chung Thầy Cơ mơn Cơng nghệ Thực phẩm nói riêng ln tận tình truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em suốt thời gian học tập trường Và đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Trúc Loan tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em từ nhận đề tài đến lúc hoàn thành đồ án tốt nghiệp Cô dẫn dắt em vào bước đầu đường nghiên cứu khoa học, động viên khích lệ tinh thần em thiếu kiên trì Mặc dù cơng việc bận Cô dành thời gian tâm huyết việc hướng dẫn em, cung cấp cho em nhiều kiến thức bổ ích, ln định hướng, góp ý sửa chữa lỗi sai để em hồn thành đồ án cách tốt Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Đặng Thanh Long – Trưởng phịng thí nghiệm phân tích, Viện Cơng nghệ sinh học, Đại học Huế tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, hỗ trợ sở vật chất tạo điều kiện tốt em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Ngoài ra, em xin gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Văn Hiệp bạn sinh viên phịng thí nghiệm giúp đỡ em thời gian làm nghiên cứu Viện Em chân thành cảm ơn quý Thầy Cô Hội đồng Bảo vệ Tốt Nghiệp dành thời gian để đọc nhận xét cho đồ án tốt nghiệp em Đà Nẵng, ngày 30 tháng 11 năm 2019 Sinh viên thực Hồ Thị Cỏ May i CAM ĐOAN Tôi – Hồ Thị Cỏ May xin cam đoan đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tinh dịch chiết mangiferin từ xoài phương pháp chiết phân đoạn đánh giá hoạt tính sinh học mangiferin sau tinh sạch” hướng dẫn TS Nguyễn Thị Trúc Loan cơng trình nghiên cứu độc lập thực thân Các kết số liệu thu trung thực, khách quan, khơng có chỉnh sửa, chép Tài liệu tham khảo sử dụng đồ án trích dẫn đầy đủ quy định Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Sinh viên thực Hồ Thị Cỏ May ii MỤC LỤC NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN TÓM TẮT NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI NÓI ĐẦU i CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC BẢNG vi DANH SÁCH CÁC HÌNH VẼ vii DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan xoài mangiferin 1.1.1 Tổng quan xoài 1.1.2 Cấu trúc thành phần hóa học mangiferin .4 1.1.3 Tính chất mangiferin 1.1.4 Tác dụng dược lý mangiferin 1.2 Tổng quan phương pháp chiết tách tinh hợp chất thiên nhiên từ thực vật 1.2.1 Phương pháp chiết rắn – lỏng 1.2.2 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 10 1.3 Tổng quan sắc ký 11 1.3.1 Phương pháp sắc ký 11 1.3.2 Sắc ký cột hở cổ điển 12 1.3.3 Sắc ký lớp mỏng 12 1.3.4 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 15 1.4 Tổng quan kháng oxy hóa kháng khuẩn 16 1.4.1 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa phương pháp thử nghiệm sử dụng gốc tự DPPH 16 1.4.2 Tổng quan kháng khuẩn 19 1.5 Tình hình nghiên cứu tinh khảo sát hoạt tính mangiferin Việt Nam giới 20 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 20 iii 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 24 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị sử dụng 28 2.2.1 Hóa chất 28 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 28 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tinh mangiferin từ cao chiết mangiferin thơ 28 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 30 2.4 Phương pháp nghiên cứu 33 2.4.1 Phương pháp định tính mangiferin 33 2.4.2 Phương pháp định lượng mangiferin HPLC 34 2.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa phương pháp DPPH 35 2.4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khoanh giấy khuếch tán môi trường thạch 37 2.4.5 Phương pháp tính độ tinh khiết 38 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 39 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Kết định tính mangiferin cao chiết thơ từ xồi 40 3.1.1 Kết định tính mangiferin cao thô phản ứng màu đặc trưng 40 3.1.2 Kết định tính mangiferin cao thơ SKLM 41 3.2 Kết định lượng hàm lượng mangiferin cao thô HPLC 41 3.3 Kết định tính mangiferin cao phân đoạn chiết lỏng – lỏng với diclometan SKLM 43 3.4 Kết định tính mangiferin cao phân đoạn chiết lỏng – lỏng với ethyl acetate SKLM 44 3.5 Kết định lượng hàm lượng mangiferin cao phân đoạn chiết lỏng – lỏng với ethyl acetate HPLC 45 3.5.1 Định lượng hàm lượng mangiferin cao lớp ethyl acetate 45 3.5.2 Định lượng hàm lượng mangiferin cao lớp ethyl acetate 46 3.6 Kết trình tinh mangiferin sắc ký cột silica gel pha thường 47 3.7 Kết q trình rửa kết tinh dung mơi khác 48 3.8 Kết hiệu suất thu cao thô mangiferin tinh 50 3.9 Kết đánh giá khả kháng oxy hóa 52 iv 3.10 Kết đánh giá khả kháng khuẩn cao thô, cao ethyl acetate, mangiferin chuẩn mangiferin tinh 53 3.10.1 Đối với vi khuẩn E coli 53 3.10.2 Đối với vi khuẩn Salmonella 56 3.10.3 Đối với nấm mốc Aspergillus flavus 57 3.11 Đề xuất quy trình cơng nghệ tinh mangiferin 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC PHỤ LỤC v DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại thực vật học xoài Bảng 1.2 Các loại pha tĩnh pha động sử dụng kỹ thuật sắc ký 12 Bảng 3.1 Hàm lượng mangiferin cao thô 43 Bảng 3.2 Hàm lượng mangiferin cao phân đoạn ethyl acetate 46 Bảng 3.3 Xác định độ tinh khiết mangiferin tinh 50 Bảng 3.4 Hoạt tính kháng oxy hóa mẫu 52 Bảng 3.5 Đường kính vịng kháng khuẩn vi khuẩn E coli (mm) 53 Bảng 3.6 Đường kính vịng kháng khuẩn vi khuẩn Salmonella (mm) 56 Bảng 3.7 Đường kính vịng kháng nấm mốc Aspergillus flavus (mm) 57 vi DANH SÁCH CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc mangiferin homomangiferin .5 Hình 1.2 Cấu trúc mangiferin, homomangiferin isomangiferin Hình 1.3 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 10 Hình 1.4 Bình sắc ký lớp mỏng 13 Hình 1.5 Bản mỏng chưa khai triển khai triển 13 Hình 1.6 Thiết bị HPLC 15 Hình 1.7 Dạng oxy hóa dạng khử DPPH 18 Hình 2.1 Bột xoài 27 Hình 2.2 Mangiferin chuẩn 28 Hình 2.3 Sơ đồ dự kiến để tinh mangiferin 29 Hình 3.1 Mangiferin chuẩn phản ứng màu với thuốc thử đặc trưng 40 Hình 3.2 Kết định tính có mặt mangiferin cao chiết thô 40 Hình 3.3 Hình ảnh chạy SKLM mangiferin chuẩn cao thơ 41 Hình 3.4 SKĐ mangiferin chuẩn nồng độ mg/mL 42 Hình 3.5 SKĐ cao thô nồng độ 10 mg/mL 42 Hình 3.6 Hình ảnh chạy SKLM cao phân đoạn diclometan 43 Hình 3.7 Hình ảnh chạy SKLM cao phân đoạn 44 Hình 3.8 SKĐ cao lớp ethyl acetate nồng độ 95 mg/mL 45 Hình 3.9 SKĐ cao lớp ethyl acetate nồng độ 30 mg/mL 46 Hình 3.10 Hình ảnh SKLM sau giải ly cột 47 Hình 3.11 Hình ảnh SKLM trước sau chạy sắc ký cột 47 Hình 3.12 SKĐ kết tinh thu chưa rửa 48 Hình 3.13 Hình ảnh chạy đối chứng chuẩn mangiferin tinh SKLM 49 Hình 3.14 SKĐ mangiferin tinh nồng độ 0,8 mg/mL 50 Hình 3.15 Sơ đồ quy trình tóm tắt khối lượng cao phân đoạn thu 51 vii ... tài nghiên cứu ? ?Nghiên cứu tinh dịch chiết mangiferin từ xoài phương pháp chiết phân đoạn đánh giá hoạt tính sinh học mangiferin sau tinh sạch? ?? đề xuất thực nhằm tìm quy trình phù hợp để tinh mangiferin. .. Thị Trúc Loan LỜI NÓI ĐẦU Sau tháng thực đề tài ? ?Nghiên cứu tinh dịch chiết mangiferin từ xoài phương pháp chiết phân đoạn đánh giá hoạt tính sinh học mangiferin sau tinh sạch? ??, hướng dẫn tận tình... Nguyễn Thị Trúc Loan Trang 59 Nghiên cứu tinh dịch chiết mangiferin từ xoài phương pháp chiết phân đoạn đánh giá hoạt tính sinh học mangiferin sau tinh Bột xoài (240 g) + Chiết lần với ethanol 60%