Trong nghiên cứu này, tiến hành các nghiên cứu phương pháp kết tủa fucoidan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii), sau đó tinh sạch fucoidan bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH và ABTS, hoạt tính kháng khuẩn (Bacillus cereus, Escherichiacoli) và kháng mốc (Aspergillus niger, Aspergillus flavus) từ các phân đoạn thu được.
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU THU NHẬN FUCOIDAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Lê Thị Mỹ Ngọc*, Nguyễn Thị Minh Chi, Nguyễn Phạm Cẩm Tiên, Đinh Thị Huyền, Hồng Thị Ngọc Nhơn Trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên lạc: myngocdhtp198@gmail.com TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, tiến hành nghiên cứu phương pháp kết tủa fucoidan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii), sau tinh fucoidan phương pháp sắc ký trao đổi ion, thử hoạt tính chống oxy hóa phương pháp DPPH ABTS, hoạt tính kháng khuẩn (Bacillus cereus, Escherichiacoli) kháng mốc (Aspergillus niger, Aspergillus flavus) từ phân đoạn thu Các phân đoạn chọn qua sắc ký trao đổi ion có độ tinh cao từ 49.02% - 61.14% Tổng hàm lượng fucoidan sau tinh với hiệu suất thu hồi đạt 60.99% Ngoài ra, phân đoạn fucoidan sau sắc kí trao đổi ion cịn có hoạt tính kháng khuẩn (Bacillus cereus, Escherichiacoli) với MIC 380 μg/ml kháng mốc (Aspergillus niger, Aspergillus flavus) với MIC 680 μg/ml 580 (μg/ml), khả bắt gốc tự DPPH với IC50 đạt 303.51 (μg/ml), ABTS với IC50 đạt 299.97 (μg/ml) Từ khóa: Fucoidan, rong sụn, tinh sạch, hoạt tính sinh học RESEARCH FUCOIDAN FROM KAPPAPHYCUS ALVAREZII Le Thi My Ngoc*, Nguyen Thi Minh Chi, Nguyen Phạm Cam Tien, Dinh Thi Huyen, Hoang Thi Ngoc Nhon Ho Chi Minh City University of Food Industry *Corresponding Author: myngocdhtp198@gmail.com ABSTRACT In this study, the effects of prepitation fucowidan method were investigated Kappaphycus alvarezii Fucoidan fractions which ere obtained after ion-exchange chromatography purifications were tested the antioxidants activity by DPPH and ABTS, as well as, antibacterial and antifungal activity As a result, fractions which were collected from ion-exchange chromatography had remarkable proportion of purification from 49.02% - 61.14%, extraction yield was 60.99% for all fractions Moreover, fucoidan fractions also had an antibacterial (Bacillus cereus, Escherichiacoli) and antifungal (Aspergillus niger, Aspergillus flavus) activities with the minimum inhibitory concentrations (MICs) were 380 μg/ml, 680 μg/ml and 580 μg/ml, respectively Antioxidant activies by ABTS method reached 299.97 ± 1.75 µg/ml (IC50 value), whereas DPPH free radical scavenging activity with IC50 value was 303.51 ± 1.65 µg/ml Keywords: Fucoidan, kappaphycus alvarezii, purifications, biological activity TỔNG QUAN Rong sụn thuộc ngành tảo đỏ loài rong biển có giá trị kinh tế cao Trong rong sụn hàm lượng nước chiếm 77 - 91% lại phần trăm chất khô Trong chất khô chứa chủ yếu glucid, 559 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 protein, chất khóa ng, lipip, sắc tố, enzim cacbohydrat… Hàm lượng cacbohydrate dao động từ 50-60% thường tập trung chủ yếu thành tế bào gồm có cellulose loại đường có hoạt tính sinh học (N H Dinh, 1991).Nhưng chưa có nhiều nghiên cứu cách khai thác hợp chất quý Fucoidan sulfate polysacharide dị thể với thành phần cấu tạo phức tạp Fucoidan phân lập xác định polysacharide có chứa L-fucose Dxylose Fucoidan hợp chất đa dạng cơng thức cấu tạo nên có nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm như: Kháng đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virut, chống kết dính tế bào, chống tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch ( B Li et al., 2008) Do đó, fucoidan trở thành đề tài thu hút nhà khoa học giới với tiềm ứng dụng lớn lĩnh vực thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng dược liệu NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Rong sụn tươi (Kappaphycus alvarezii) thu nhận Khánh Hòa Rong rửa nhiều lần nước loại bỏ tạp chất rây, sấy đối lưu 600C, nghiền thành bột máy xay khô Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: Dịch trích: Cân 120g rong cho vào cốc ngâm với ethanol 80% 12 Trích ly bã với dung mơi HCl (1.38M) 1:40 (w/v), nhiệt độ 880C 3.5 Kết tủa dịch trích với TCA nhiệt độ lạnh, sau ly tâm 5000 vịng/phút 15 phút loại tủa protein để thu dịch trích ly fucoidan (C K Veena et Kỷ yếu khoa học al., 2008) Khảo sát phương pháp kết tủa trước tinh fucoidan (T Marudhupandi et al., 2014): Phương pháp 1: Kết tủa giai đoạn, tiến hành kết tủa fucoidan từ dịch trích với ethanol 99% Phương pháp 2: Kết tủa giai đoạn, tiến hành kết tủa fucoidan với ethanol 99% để nồng độ cồn dung dịch 30% (4 giờ), 70% (12 giờ) Khảo sát trình tinh fucoidan phương pháp sắc kí trao đổi ion Thực nhồi cội sắc ký trao đổi ion với 3g DEAE – Cellulose, chỉnh tốc độ dòng 5ml/10phút Rửa giải dung dịch đệm bổ sung NaCl Ở nồng độ NaCl tiến hành rửa giải 30ml, tăng nồng độ muối NaCl cao để tiếp tục trình rửa giải nồng độ cuối Các loại đệm khảo sát (tris-HCl, phosphate, acetate), nồng độ muối rửa giải khảo sát (0.5M; 1M; 1.5M; 2M) Fucoidan thu theo phân đoạn, phân đoạn 10ml Xác định hoạt tính kháng kháng mốc, kháng khuẩn Ống giống vi khuẩn/nấm mốc cấy chuyển vào môi trường TSA/PDA để tạo khuẩn lạc/mốc riêng rẽ Dùng que cấy vơ trùng lấy khuẩn lạc/mốc hịa tan vào nước muối sinh lý vô trùng trộn máy trộn Vortex, mật độ tế bào dịch huyền phù xác định phương pháp đếm hồng cầu, điều chỉnh mật độ tế bào dịch huyền phù đạt 106 CFU/ml Hút 2ml dịch huyền phù chứa vi khuẩn có nồng độ 106 CFU/ml cho vào đĩa thạch Dùng que cấy trang vô khuẩn, trang mặt thạch cho vi khuẩn/nấm mốc khuếch tán đầy mặt thạch Để khơ nhiệt độ phịng 30 phút Nhỏ 10 µl dịch sau tinh pha loãng 560 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học nồng độ khác vào đĩa thạch Mỗi 0.0074x + 0.0059 nồng độ lặp lại lần, đĩa thạch Phương pháp xử lý số liệu: Mỗi thí ủ 320C/24h Đường kính vùng nghiệm tiến hành lặp lại ba lần, ức chế đo thước đo đơn vị kết trình bày dạng giá trị mm trung bình ± giá trị sai số Kết Xác định hoạt tính kháng đơng máu tính tóa n phần mềm Microft Hoạt động chống đông fucoidan Office Excel 2010 phần mềm SPSS xác định theo phương pháp USA Kết phân tích ANOVA với độ tin pharmacopia: Hút 0.8 ml dung dịch cậy 95%, so sánh khác biệt fucoidan qua DEAE phân đoạn 1M nghiệm thức qua phép thử LSD nồng độ (600, 500, 400µg/ml) Hút 0.8 ml dung dịch natri heparin KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN chuẩn (0.7 đơn vị USP/0.8 ml) 0.8 Kết tủa trước tinh fucoidan ml dung dịch muối 96% cho Thực trích ly fucoidan theo quy vào ống nghiệm Bổ sung thêm trình (mục 2.2.1) thu dịch trích có vào ống chuẩn bị hàm lượng fucoidan 44.25 (µg/ml) ml huyết tương 0.2 ml dung dịch Hàm lượng độ tinh khiết CaCl2 (1%) Đồng hỗn hợp dung fucoidan có tủa thực theo dịch ống Ghi lại thời phương pháp 163.631 (µg/ml) gian máu đơng phương pháp 191.378 (µg/ml) Hàm lượng độ tinh khiết fucoidan Phương pháp phân tích Thêm 1ml dung dịch fucoidan có tủa phương pháp (tủa nồng độ vào ống nghiệm, làm lạnh giai đoạn) cao phương pháp (tủa 40C (2-3 phút) Thêm 4.5 ml acid giai đoạn) (bảng 2.1) Tác giả sunfuric (85%), đun sôi 10 phút, T.Marudhupandi cộng (2014) sau để nguội, thêm 0.3 ml acid sử dụng phương pháp cysteine hydrochloric 0.1% vào ống nghiên cứu fucoiddan nghiệm, ủ bóng tối giờ, rong biển (T Marudhupandi et al., sau đo độ hấp thụ quang phổ kế 2014) 396 nm 430 nm Mỗi thí nghiệm Hoạt tính kháng oxy hóa lặp lại lần Xác định hàm lượng fucoidan từ rong sụn fucoidan có mẫu phương Kết DPPH hoạt tính kháng oxy hóa pháp đo quang phổ UV-VIS 390 nm tủa fucoidan (chưa qua tinh 430 nm, theo đường chuẩn y = DEAE) thể Bảng Bảng Kết thử hoạt tính Fucoidan rong sụn theo phương pháp DPPH, ABTS Nồng độ (µg/ml) Phương pháp DPPH Phương pháp ABTS 39.38 15.91 ± 1.61 14.92± 3.81 78.77 27.61 ± 3.44 29.49± 6.99 157.54 42.15 ± 1.81 43.75± 5.38 315.08 57.02 ± 1.49 58.42 ± 4.32 630.13 69.97 ± 1.12 70.05 ± 1.71 IC50 IC50=303.51± 1.65 (µg/ml) IC50=299.97+ 1.75(µg/ml) Xác định hoạt tính kháng khuẩn fucoidan từ rong sụn Kết xác định vòng kháng khuẩn dịch trích ly sau tinh 561 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học fucoidan thể qua Bảng Bảng Kết đường kính vịng kháng khuẩn dịch trích ly dịch sau tinh fucoidan Nồng độ Đường kính vịng kháng Nồng Đường kính vịng kháng mẫu khuẩn (mm) độ mẫu khuẩn (mm) pha pha Dịch trích ly fucoidan Dịch fucoidan tinh lỗng lỗng B.cereus E.coli B.cereus E.coli (µg/ml) (µg/ml) 350 280 450 1.67 5,17 380 2.83 6.83 550 5.83 6.17 480 7.17 8.17 650 8.00 9.33 580 9.00 10.50 Từ Bảng 2, E.coli, dịch chiết nồng độ 580 µg/ml ức chế tốt fucoidan 650µg/ml cho đường kính Escherichia coli lẫn Bacillus cereus vịng vơ khuẩn lớn (9.33mm) Đối Xác định thử hoạt tính kháng mốc với lồi vi khuẩn Bacillus cereus Kết thử hoạt tính kháng mốc nồng độ 650µg/ml, 550µg/ml, dịch trích ly sau tinh fucoidan 450µg/ml dịch chiết sau 24 thể Bảng Bảng cho thấy khảo sát hiệu lực tương tự với dịch fucoidan tinh đặc có kết đường kính từ 1.67-8mm Với khả ức chế phát triển các nồng độ 380µg/ml, 480µg/ml, loại nấm mốc Aspergillus niger 580µg/ml sau 24 khảo sát kết Aspergillus flavus Nồng độ ức chế tối đường kính ghi nhận trải dài từ thiểu đường kính vịng kháng khuẩn 2.83-9mm Bacillus subtilis không bị hai loại nấm mốc 680 ức chế mạnh loại cao chiết hay μg/ml, 11.17 mm 580 μg/ml, 9mm dịch fucoidan tinh so với Dịch fucoidan tinh có hoạt tính Escherichia coli Điều thấy vi cao dịch trích ban đầu (đường kính khuẩn Gram âm nhạy cảm dễ bị vòng kháng mốc) lớn dịch ảnh hưởng từ hiệu ứng kháng fucoidan tinh có nồng độ thấp khuẩn so với Gram dương Như dịch trích ban đầu ức chế vậy, với cao chiết nồng độ 650 phát triển nấm mốc µg/ml ức chế tốt, với dịch tinh Bảng Kết đường kính kháng nấm mốc dịch fucoidan tinh Đường kính vịng Đường kính vịng kháng nấm (mm) kháng nấm (mm) Nồng độ Nồng độ mẫu pha mẫu pha Dịch fucoidan tinh lỗng lỗng Dịch trích ly fucoidan (µg/ml) (µg/ml) A.niger A.flavus A.niger A.flavus 350 380 450 480 550 580 650 10 10 680 11.17 12.83 562 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 KẾT LUẬN Các kết nghiên cứu rằng, sắc ký trao đổi ion có hiệu việc tinh fucoidan từ rong sụn đồng thời tổng hàm lượng fucoidan thu sau tinh cao Ngoài dịch fucoidan sau tinh cịn có hoạt Kỷ yếu khoa học tính kháng khuẩn (B cereus, E coli) kháng mốc (A niger, A flavus), đồng thời có khả chống oxy hóa Như thấy, rong sụn nguồn nguyên liệu tiềm năng, giúp mở hướng việc ứng dụng vào thực phẩm chức TÀI LIỆU THAM KHẢO K MARXEN, K H VANSELOW, S LIPPEMEIER, R HINTZE, A RUSER, AND U.P HANSEN Determination of DPPH radical oxidation caused by methanolic extracts of some microalgal species by linear regression analysis of spectrophotometric measurements Sensors, vol 7, no 10, pp 2080-2095, 2007 R RE, N PELLEGRINI, A PROTEGGENTE, A PANNALA, M YANG, AND C RICE-EVANS Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay Free radical biology and medicine, vol 26, no 9-10, pp 1231-1237, 1999 S P KAMBLE, R B GAIKAR, R B PADALIA, AND K D SHINDE Extraction and purification of C-phycocyanin from dry Spirulina powder and evaluating its antioxidant, anticoagulation and prevention of DNA damage activity Journal of Applied Pharmaceutical Science, vol 3, no 8, p 149, 2013 T MARUDHUPANDI, T A KUMAR, S L SENTHIL, AND K N DEVI In vitro antioxidant properties of fucoidan fractions from Sargassum tenerrimum Pakistan Journal of Biological Sciences, vol 17, no 3, p 402, 2014 563 ... Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 KẾT LUẬN Các kết nghiên cứu rằng, sắc ký trao đổi ion có hiệu việc tinh fucoidan từ rong sụn đồng thời tổng hàm lượng fucoidan thu sau tinh... tính kháng khuẩn fucoidan từ rong sụn Kết xác định vịng kháng khuẩn dịch trích ly sau tinh 561 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học fucoidan thể qua... liệu Rong sụn tươi (Kappaphycus alvarezii) thu nhận Khánh Hòa Rong rửa nhiều lần nước loại bỏ tạp chất rây, sấy đối lưu 600C, nghiền thành bột máy xay khơ Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị mẫu thí