Trong nghiên cứu này, các chủng Paecilomyces được phân lập từ các loại đất trồng khác nhau và được nhận dạng dựa trên hình thái và giải trình tự gene 28S rDNA. Sau khi định danh, các chủng Paecilomyces được xác định hoạt lực sinh học in vitro trên sâu khoang (Spodoptera litura).
Science & Technology Development, Vol 5, No.T20- 2017 Nghiên cứu thu nhận bào tử Paecilomyces spp có khả diệt sâu khoang (Spodoptera litura) phân lập từ đất trồng trọt Nguyễn Quốc Linh Nguyễn Như Nhứt Chi nhánh Cơng ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương (Bài nhận ngày 12 tháng 12 năm 2016, nhận đăng ngày 30 tháng 11 năm 2017) TÓM TẮT Paecilomyces biết đến tác nhân javanicus, chủng F02 thuộc Paecilomyces sp., chủng kiểm sốt trùng sâu hại trồng Tuy nhiên, F03 thuộc P lilacinum chủng F04 F05 thuộc Việt Nam, Paecilomyces chưa nghiên cứu P lilacinus) Trong đó, chủng F03 F04 cho hoạt ứng dụng rộng rãi Trong nghiên cứu này, chủng lực cao việc diệt sâu khoang sau 10 ngày gây Paecilomyces phân lập từ loại đất trồng nhiễm Thử nghiệm nuôi cấy tăng sinh bán rắn hai khác nhận dạng dựa hình thái chủng F03 F04 cho thấy chúng tạo nhiều bào tử giải trình tự gene 28S rDNA Sau định danh, mơi trường có thành phần gạo lức, cám chủng Paecilomyces xác định hoạt lực sinh học mì trấu với độ ẩm 55% Kết nghiên cứu cho in vitro sâu khoang (Spodoptera litura) Các thấy chủng Paecilomyces địa có tiềm chủng có hoạt lực sinh học cao sử dụng để ứng dụng để tạo sản phẩm sinh học kiểm sốt nghiên cứu thu nhận bào tử phương pháp nuôi trùng dựa nguồn chất rẻ tiền sẵn có cấy bán rắn Kết từ 33 mẫu đất phân lập nước chủng Paecilomyces (chủng F01 thuộc P Từ khóa: gạo lức, hoạt lực diệt sâu, kiểm sốt trùng, Paecilomyces, sản xuất bào tử, sâu khoang MỞ ĐẦU Nấm Paecilomyces nhóm nấm ký sinh trùng có phổ ký chủ rộng diện phổ biến tự nhiên vùng nhiệt đới ơn đới Các lồi Paecilomyces dễ dàng tìm thấy đất tơi xốp, xác bã hữu cơ, thức ăn, tàn dư thực vật sản phẩm thực phẩm P lilacinus diện phổ biến nông trại Sarawak bao gồm nông trại có sử dụng thuốc diệt nấm P variotii tìm thấy khơng khí thực phẩm Lồi P farinosus phân bố rộng rãi nhiều vùng giới phân lập từ số côn trùng thuộc Cánh vẩy (Lepidoptera) Cánh giống (Isoptera) Lồi P carneus tìm thấy rộng rãi Quebec, Alberta, Anh, Columbia phân lập từ đất phần mục nát linh sam [14] Trang 58 Ngoài ra, loài Paecilomyces khác P amoeneroseus, P breviramosus, P cateniannulatus, P cateniobliquus, P cicadae, P fumosoroseus… báo cáo tìm thấy vùng có khí hậu ơn đới nhiệt đới ký sinh gây bệnh cho côn trùng thuộc Cánh cứng (Coleoptera) Cánh vẩy Các lồi nấm Paecilomyces sp có khả gây bệnh cho lồi trùng thuộc Cánh vẩy, sâu đo (Trichoplusia ni), sâu xanh (Spodoptera frugiperda) sâu khoang (S litura) Ngoài ra, theo báo cáo nhiều tác giả nhiều lồi Paecilomyces sp có khả gây bệnh hiệu lồi trùng khác loài P farinosus gây bệnh loài côn trùng thuộc Cánh giống, muỗi Culex pipiens (Abdusalom et al., 2010); TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SOÁ T5- 2017 P tenuipes gây nhiễm cho ấu trùng Plutella xylostella [1, 15] Nấm Paecilomyces xâm nhiễm vật chủ trực tiếp thơng qua lớp biều bì qua đường thức ăn sau giết chết trùng Do đó, Paecilomyces nước giới sử dụng làm tác nhân kiểm soát dịch hại thay cho loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học Ngoài ra, diện đất, Paecilomyces xâm nhiễm vào tuyến trùng gây hại Meloidogyne incognita, M arenaria M javanica [12] Tại Việt Nam, sản phẩm ứng dụng Paecilomyces việc kiểm sốt, tiêu diệt trùng sâu hại trồng chưa phổ biến nghiên cứu chủ yếu tập trung vào ứng dụng loài Paecilomyces lilacinus, P tenuipe Do đó, nghiên cứu này, tiến hành phân lập thu nhận Paecilomyces có đất trồng số loại khác bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học ứng dụng kiểm sốt trùng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Địa điểm thời gian thu mẫu Mẫu thu thập gồm mẫu đất tự nhiên nơi có mức độ thâm canh cao lồi thực vật Sau gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2–3 cm lấy lớp đất phía tùy loại trồng canh tác mà độ sâu lấy mẫu khác nhau: đất trồng rau (0–20 cm), lấy củ (0–40 cm) ăn lâu năm (20–70 cm) M (%) C T x100 C Các mẫu đất thu thập tỉnh Bình Định, Bình Thuận, Khánh Hòa, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bình Dương, Tây Ninh, Trà Vinh Tiền Giang Thời gian thu mẫu từ tháng đến cuối tháng năm 2013 Phân lập định danh Paecilomyces phân lập môi trường SDA+ (Sabouraud Dextrose Agar bổ sung kháng sinh) môi trường CTC (Potato dextrose agar có bổ sung cao nấm men g, Chloramphenicol 0,5 g, Thiabendazole 0,001 g, Cycloheximide 0,25 g lít, pH 6,9) Ủ nhiệt độ 25 0C khoảng ngày [5, 8] Việc phân loại định danh mẫu thực phương pháp hình thái học dựa đặc điểm màu sắc khuẩn lạc, hình dạng bào tử quan phát sinh bào tử… [3] phương pháp giải trình tự gene 28S rDNA Hassouna et al.(1984) [7] Xác định hoạt lực sinh học in vitro chủng Paecilomyces sp sâu khoang (Spodoptera litura) Các chủng Paecilomyces phân lập thử nghiệm hoạt lực sâu khoang Thí nghiệm thực cách phun huyền phù bào tử chủng nấm Paecilomyces có mật độ 108 bào tử/mL lên thức ăn sâu Ghi nhận số sâu chết ngày mẫu thí nghiệm mẫu đối chứng phun nước cất vô trùng Hoạt lực diệt sâu tính theo cơng thức Abbott [15] M (%): tỷ lệ sâu chết C: số sâu sống nghiệm thức đối chứng T: số sâu sống nghiệm thức có xử lý nấm Phương pháp ni cấy bán rắn thu nhận bào tử Paecilomyces sp KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Cấy mL huyền phù bào tử (107 bào tử/mL) Paecilomyces sp vào bình tam giác chứa 50 g mơi trường Sau đó, ủ nhiệt độ 28 oC ngày Xác định mật độ bào tử canh trường phương pháp đếm trực tiếp bào tử buồng đếm hồng cầu [2] Từ 33 mẫu đất thu (Bảng 1), sau phân lập tiến hành quan sát đặc điểm hình thái học hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, hình dạng bào tử quan phát sinh bào tử thu chủng nấm có đặc điểm tương tự với Paecilomyces theo tài liệu khóa phân loại Samson et al (1974) [14] Kết ghi nhận Bảng Phân lập Paecilomyces Trang 59 Science & Technology Development, Vol 5, No.T20- 2017 Bảng Các mẫu đất sử dụng để phân lập Paecilomyces Stt Ký hiệu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 MP01 MP02 MP03 MP04 MP05 MP06 MP07 MP08 MP09 MP10 MP11 MP12 MP13 MP14 MP15 MP16 MP17 MP18 MP19 MP20 MP21 MP22 MP23 MP24 MP25 MP25 MP27 MP28 MP29 MP30 MP31 MP32 MP33 Trang 60 Nơi lấy mẫu Phước An–Tuy Phước–Bình Định Phước An–Tuy Phước–Bình Định Phước An–Tuy Phước–Bình Định Phước An–Tuy Phước–Bình Định Phước An–Tuy Phước–Bình Định Suối Tiên–Cam Ranh–Khánh Hòa Suối Tiên–Cam Ranh–Khánh Hòa Phường 8–Đà Lạt–Lâm Đồng Xuân Thọ–Đà Lạt–Lâm Đồng Xuân Thọ–Đà Lạt–Lâm Đồng Phú Long–Thuận Bắc–Bình Thuận Trà Tân–Đức Linh–Bình Thuận Đơng Hà–Đức Linh–Bình Thuận Đơng Hà–Đức Lin –Bình Thuận Đơng Hà–Đức Linh–Bình Thuận Trà Tân–Đức Linh–Bình Thuận Trà Tân–Đức Linh–Bình Thuận Đơng Hà–Đức Linh–Bình Thuận Trà Tân–Đức Linh–Bình Thuận Trà Tân–Đức Linh–Bình Thuận Tân Phú–Đồng Nai Phước Ninh–Dương Minh Châu–Tây Ninh Phước Ninh–Dương Minh Châu–Tây Ninh Chà Là–Dương Minh Châu–Tây Ninh Thanh An–Dầu Tiếng–Bình Dương An Thái Đơng–Cái Bè–Tiền Giang An Thái Đông–Cái Bè–Tiền Giang An Thái Đông–Cái Bè–Tiền Giang An Thái Đông–Cái Bè–Tiền Giang An Thái Đông–Cái Bè–Tiền Giang Tam Bình–Vĩnh Long–Trà Vinh Tam Bình–Vĩnh Long–Trà Vinh Tam Bình–Vĩnh Long–Trà Vinh Loại trồng Bắp Khoai mì Khoai mì Bắp Khoai mì Dưa leo Xà lách Hoa đồng tiền Cà phê Rau cải Thanh long Khoai mì Khoai mơn Lúa Lúa Khoai mì Tiêu Khoai mơn Khoai mì Lúa Bắp Hồn ngọc Mía Cao su Khoai mì Cóc Sầu riêng Dừa Mận Mít Khoai mì Lúa Khoai mì TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T5- 2017 Bảng Đặc điểm khuẩn lạc đặc điểm vi thể chủng nấm phân lập môi trường PGA Chủng nấm F01 F02 F03 F04 F05 Nguồn mẫu Đặc điểm phân lập MP21 Khuẩn lạc ban đầu có màu trắng tuyết Sau đó, tâm bắt đầu xuất vòng tròn nhỏ có màu vàng nhạt hình thành bào tử, mặt khuẩn lạc có màu vàng nhạt Sợi nấm ngắn, mịn xốp Mép khuẩn lạc dày, khuẩn lạc nhô cao khoảng 0,3mm Sợi nấm mảnh, suốt, giá bào tử trần dài, suốt bình dài Bảo tử trần suốt, có hình tròn đến elip, nối thành chuỗi dài MP22 Khuẩn lạc có màu trắng tuyết, tâm khuẩn lạc bắt đầu chuyển thành màu vàng nhạt hình thành bào tử Mặt khuẩn lạc có màu trắng Khuẩn lạc dạng hình tròn nằm sát mặt thạch, mép khuẩn lạc mỏng Sợi nấm mịn, nhỏ nằm rời rạc chồng lên Khuẩn lạc đạt đường kính 20 mm sau ngày nuôi cấy Sợi nấm mảnh suốt Giá bào tử trần suốt, hình thành thể bình có cổ hẹp Bào tử trần suốt, có hình elip xếp thành chuỗi MP24 Khuẩn lạc ban đầu có màu trắng sau chuyển thành màu hồng cánh sen từ tâm mép Khuẩn lạc có dạng hình tròn, mép đều, dày có màu trắng Tâm khuẩn lạc nhô cao khoảng 0,2 mm Sợi nấm mịn, ngắn xốp Mặt khuẩn lạc có màu vàng nhạt, sau xuất viền màu trắng hình thành bào tử Khuẩn lạc đạt đường kính khoảng 33 mm sau ngày nuôi cấy Sợi nấm mảnh suốt Giá bào tử trần suốt, dài mang thể bình Thể bình có hình bình, dài hẹp cổ Bào tử trần suốt, có hình elip xếp thành chuỗi dài MP33 Khuẩn lạc phát triển đạt đường kính khoảng 35 mm sau ngày ni cấy Khuẩn lạc ban đầu có màu hồng, mép khuẩn lạc khơng tròn, khơng nhìn rõ viền Về sau khuẩn lạc dần tròn, giữ nguyên màu hồng tạo bào tử, xuất đường thẳng từ tâm, viền khuẩn lạc bắt đầu dày Sợi nấm ngắn mịn, có xu hướng bám chặt vào Mặt khuẩn lạc ban đầu màu trắng, sau chuyển dần sang màu đen từ tâm Sợi nấm mảnh, suốt; giá bào tử trần suốt mang thể bình có cổ hẹp dài Bào tử trần có hình elip, suốt, xếp thành chuỗi dài MP33 Khuẩn lạc màu trắng sau chuyển dần sang màu hồng phấn từ tâm khuẩn lạc hồn tồn thành màu hồng hình thành bào tử Khuẩn lạc tròn, dẹt, sợi nấm mịn Mặt khuẩn lạc có màu trắng Đường kính khuẩn lạc đạt khoảng 30 mm sau ngày ni cấy Dưới kính hiển vi quang học (X40), sợi nấm mảnh, suốt; giá bào tử trần suốt mang thể bình có hình trứng đến elip xếp thành chuỗi dài Bào tử hình tròn đến elip, suốt, xếp thành chuỗi Trang 61 Science & Technology Development, Vol 5, No.T20- 2017 A D B E C Hình Đặc điểm khuẩn lạc mặt (trái), mặt (giữa) cấu trúc quan sinh bào tử (phải) chủng F01(A), chủng F02 (B), chủng F03 (C), chủng F04 (D) chủng F05 (E) Bảng Kết định danh chủng nấm Paecilomyces sp phân lập dựa trình tự gene 28S rDNA Chủng nấm F01 F02 F03 F04 F05 Tên loài Paecilomyces javanicus Paecilomyces sp Paecilomyces lilacinum Paecilomyces lilacinus Paecilomyces lilacinus Kết định danh đến loài phương pháp giải trình tự gene 28S rDNA thể Bảng Kết thu cho thấy có chủng thuộc lồi Paecilomyces lilacinus (F04 F05), chủng thuộc loài Paecilomyces javanicus (F01), chủng thuộc loài Paecilomyces lilacinum (F03) chủng Paecilomyces sp (F02) Các nghiên cứu trước cho thấy, Paecilomyces diện nhiều loại đất trồng loại trồng khác P lilacinus diện đất trồng cà chua, đậu bắp, đậu xanh đậu đen [17] Pacilomyces diện đất trồng dưa chuột ớt [3, 11] Trong nghiên cứu cho thấy, Paecilomyces diện đất trồng bắp (F01), hoàn ngọc (F02), cao su (F03) khoai mì (F04 F05) Trang 62 Mức độ tương đồng 100 % 99 % 100 % 99 % 99 % Hoạt lực sinh học in vitro chủng Paecilomyces Các số liệu thu cho thấy hoạt lực diệt sâu khoang chủng phân lập khác (bảng 4) Hầu hết hoạt lực diệt sâu chủng nấm tăng dần theo thời gian từ đến ngày sau gây nhiễm đạt cao 10 ngày sau gây nhiễm Nhìn chung, hoạt lực thấp việc diệt sâu khoang chủng nghiên cứu thời điểm 4, ngày sau gây nhiễm khác biệt mặt thống kê chủng Chỉ có chủng F03 F04 hoạt lực tiếp tục tăng cao 10 ngày sau gây nhiễm Hoạt lực chủng 42,00 % 64,29 % có khác biệt mặt thống kê so với chủng lại TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T5- 2017 Bảng Hoạt lực diệt sâu chủng nấm Paecilomyces sâu khoang (Spodoptera litura) Hoạt lực diệt sâu (%) SGN SGN SGN 10 SGN F01 4,00 ef 14,00 df 22,00 be 22,00 be F02 4,50 ef 13,00 df 14,86 df 14,86 df F03 0,00 f 10,00 ef 32,00 bd 42,00 a ef df bc F04 10,00 16,00 38,29 64,29 a f df be F05 0,00 15,00 22,11 22,11 be Trong cột dòng, số có chữ theo sau giống khơng khác biệt mức ý nghĩa % (Nhiệt độ = 26,9–29,8 0C , Độ ẩm = 62,8–81,6 %, SGN: sau gây nhiễm) Chủng nấm Kết nghiên cứu Hu et al (2007) báo cáo P javanicus với mật độ 4,75x107 bào tử/mL gây tỷ lệ chết cho sâu khoang 50 % với thời gian gây nhiễm ngày [9] Theo báo cáo Lê Hữu Phước (2009) hoạt lực diệt sâu khoang hai chủng Paecilomyces P3–TG Paecilomyces P2–AG đạt cao 10 ngày sau gây nhiễm 69,2 đến 69,5 % [15] Điều cho thấy, tùy theo chủng Paecilomyces mà thời gian đạt hoạt lực diệt sâu cao khác Kết nghiên cứu cho thấy, hai chủng F03 F04 có thời gian để đạt hoạt lực diệt sâu cao lâu chủng P javanicus Hu cộng tương đương với hai chủng Paecilomyces Lê Hữu Phước Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên tạo bào tử chủng nấm Paecilomyces Sau nuôi cấy riêng lẻ chủng nấm F03 F04 loại môi trường bán rắn khác độ ẩm 55 %, kết cho thấy nuôi cấy môi trường khác mật độ bào tử hai chủng không giống Trên môi trường MT1, MT2, MT4, MT5, MT6, MT7 MT8 (Bảng 5), chủng F03 cho mật độ bào tử thấp khơng có khác biệt mặt thống kê (Bảng 6) Trong đó, thấp môi trường MT2 (với chất lúa) Điều mơi trường MT2 không cung cấp đầy đủ nguồn dinh dưỡng cho phát triển chủng F03 Trong đó, chủng F04 nuôi cấy môi trường thử nghiệm đạt mật độ bào tử cao chủng F03 đạt cao nuôi cấy môi trường MT1 (với chất gạo lức) có khác biệt mặt thống kê với môi trường lại Ngồi ra, đa số mơi trường có chứa chất gạo lức cho mật độ bào tử chủng F03 F04 cao so với chất lúa Điển hình mơi trường MT3 (gồm gạo lức, cám mì trấu) cho mật độ bào tử chủng F03 cao (9,67x108 bào tử/g) có khác biệt mặt thống kê so với mơi trường lại Mật độ bào tử chủng F04 đạt cao môi trường chứa gạo lức Hai chủng F03 F04 cho mật độ bào tử cao mơi trường có chứa gạo lức gạo lức có chứa nhiều dưỡng chất, đặc biệt vitamin nguyên tố vi lượng Kết phù hợp với nghiên cứu Shim et al (2003) Các tác giả nghiên cứu ảnh hưởng lúa mì, gạo lức ngô lên phát triển P fumosoroseus kết cho thấy gạo lức chất tốt cho phát triển P Fumosoroseu [16] Ngoài ra, theo nghiên cứu Amala cộng (2012), P lilacinus phát triển cám gạo (MT4) cám mì (MT3) [2], với nghiên cứu này, chủng F03 (P lilacinum) lại sử dụng cám mì tốt cám gạo cám ngơ Còn chủng F04 (P lilacinus) ảnh hưởng cám mì (MT3) cám gạo (MT4) đến hình thành bào tử khơng có khác biệt mặt thống kê Điều cho thấy, có khác nhu cầu nguồn chất bổ sung loài Paecilomyces chủng loài Trang 63 Science & Technology Development, Vol 5, No.T20- 2017 Bảng Thành phần môi trường sử dụng để nuôi cấy thu nhận bào tử Paecilomyces sp Môi trường Gạo lức Lúa MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 25 15 15 15 0 0 25 0 17,5 17,5 17,5 Thành phần (g) Cám mì Trấu 0 7,5 0 7,5 0 0 2,5 2,5 2,5 0 Cám gạo 0 7,5 0 7,5 Cám bắp 0 0 7,5 0 7,5 Bảng Mật độ bào tử chủng nấm Paecilomyces tạo thành môi trường nuôi cấy khác Môi trường Mật độ bào tử (x108 bào tử/g canh trường tươi) Chủng nấm F03 Chủng nấm F04 MT1 4,09 bc 32,83 a MT2 0,55 d 7,43 b MT3 9,67 a 15,00 b MT4 4,75 b 14,67 b MT5 2,02 cd 1,78 b MT6 1,17 d 8,42 b MT7 4,54 bc 10,92 b MT8 1,00 d 5,09 b Trong cột, số có chữ theo sau giống khơng khác biệt mức ý nghĩa 5% Ảnh hưởng độ ẩm môi trường bán rắn lên môi trường ni cấy đến khả hình thành bào tử hình thành bào tử chủng nấm Paecilomyces Theo Kruger et al (2014) độ Paecilomyces ẩm mơi trường thích hợp để ni cấy Metarhizium anisopliae nghiên cứu họ 45 % [13] Kết Kết thu sau nuôi cấy riêng lẻ chủng nghiên cứu Vu et al (2008) cho thấy F03 môi trường MT3 F04 môi trường Lecanicillium lecanii 41185 sinh bào tử cao độ MT1 mức độ ẩm khác cho thấy hai ẩm môi trường 28,5 % [18] Nghiên cứu Vũ Xuân chủng nấm thử nghiệm chịu ảnh hưởng đáng Đạt (2011) báo cáo độ ẩm chất thích hợp cho kể độ ẩm mơi trường nuôi cấy đến khả chủng L lecanii 485 phát triển 41 % [4] Theo hình thành bào tử Mật độ bào tử tăng từ mức độ ẩm Flórez (2008) độ ẩm mơi trường thích hợp để tăng 45 % đến 55 % đạt cực đại độ ẩm 55 % sinh Beauveria bassiana 55 % [6] Kết chủng nghiên cứu (Bảng 7) Các báo cáo trước nghiên cứu cho thấy độ ẩm môi trường nuôi cấy nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm môi trường có ảnh hưởng khơng giống đến phát triển xung quanh đến khả sinh trưởng, nảy mầm hình thành bào tử chủng nấm diệt côn trùng bào tử khả gây nhiễm lên côn chi khác chủng khác trùng mà chưa có báo cáo ảnh hưởng độ ẩm Trang 64 TAÏP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T5- 2017 lồi Trong nghiên cứu này, độ ẩm mơi trường thích hợp cho hai chủng Paecilomyces F03 F04 phát triển giống với chủng B bassiana nghiên cứu Flórez cao so với chủng M anisopliae, L lecanii 485 L lecanii 41185 tác giả lại Bảng Mật độ bào tử chủng nấm Paecilomyces tạo thành môi trường ni cấy có độ ẩm khác Độ ẩm (%) 45 50 55 60 65 70 75 Mật độ bào tử (x108 bào tử/g canh trường tươi) Chủng nấm F03 Chủng nấm F04 de 3,27 2,34 b 5,38 bd 4,34 b a 11,47 21,73 a 6,75 b 5,73 b ce 4,00 5,48 b 3,04 e 4,25 b bc 5,91 4,84 b Trong cột, số có chữ theo sau giống khơng khác biệt mức ý nghĩa 5% Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên hình thành bào tử Hai chủng nấm F03 F04 nuôi cấy môi trường thích hợp độ ẩm 55 % xác định mật độ bào tử mốc thời gian 4, 6, 8, 10 12 ngày Kết thu cho thấy mật độ bào tử chủng tăng theo thời gian nuôi cấy (Bảng 8), mật độ bào tử bắt đầu tăng cao từ ngày thứ tiếp tục tăng đến ngày thứ 10, đến ngày thứ 12 mật độ bào tử khơng thay đổi mặt thống kê Như vậy, thời gian nuôi cấy thích hợp để thu nhận bào tử chủng F03 F04 10 ngày, thời gian thích hợp để ni cấy P fumosoroseus chủng P lilacinus [16] Theo Kruger et al (2014), thời gian thích hợp để tăng sinh M anisopliae nghiên cứu họ 12 ngày [13] Theo Vu et al (2008), 12 ngày thời gian thích hợp để tăng sinh chủng L lecanii 41185 [18] Kết nghiên cứu cho thấy, hai chủng F03 F04 có thời gian tăng sinh ngắn chủng M anisopliae L lecanii 41185 Bảng Mật độ bào tử chủng nấm Paecilomyces tạo thành mốc thời gian nuôi cấy khác Thời gian 10 12 Mật độ bào tử (x108 bào tử/g canh trường tươi) Chủng nấm F03 Chủng nấm F04 c 2,12 4,88 c d 4,88 8,63 b 6,37 b 10,06 b a 10,47 19,70 a 11,13 a 20,17 a Trong cột, số có chữ theo sau giống khơng khác biệt mức ý nghĩa 5% Hoạt tính chủng Paecilomyces sau tăng sinh môi trường MT1 (gạo lức) MT3 (gạo lức, cám mì trấu) với độ ẩm mơi trường ni cấy 55 % Sau nuôi cấy 10 ngày, thu sinh khối tiến Trang 65 Science & Technology Development, Vol 5, No.T20- 2017 hành thử hoạt lực sâu khoang mức nồng độ 106, 107 108 bào tử/mL Kết thu cho thấy chủng nấm đạt hoạt lực tiêu diệt sâu khoang cao sau 8–10 ngày gây nhiễm (Bảng Bảng 10) Chủng F03 có hoạt lực diệt sâu tương đương nồng độ thử nghiệm 107 108 bào tử/mL Với chủng nấm F04 hoạt lực diệt sâu đạt cao nồng độ 108 bào tử/mL Hoạt lực diệt sâu chủng F03 F04 sau tăng sinh điều kiện chọn lọc nhìn chung khơng thay đổi đáng kể mặt thống kê so với kết thử hoạt lực ban đầu Theo báo cáo Hu et al (2007) nồng độ 4,75x107 bào tử/mL P javanicus gây tỷ lệ chết cho sâu khoang cao sau ngày gây nhiễm [9] Nghiên cứu Lê Hữu Phước (2009) cho kết hoạt lực diệt sâu khoang hai chủng Paecilomyces P3–TG Paecilomyces P2–AG đạt cao nồng độ 108 bào tử/mL sau 10 ngày gây nhiễm [15] Kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ gây nhiễm thích hợp hai chủng F03 F04 tương tự với chủng P javanicus Hu et al hai chủng Paecilomyces Lê Hữu Phước Bảng Hoạt lực diệt sâu chủng F03 sâu khoang Thời gian (ngày) Nồng độ dung dịch nấm chủng F03 (bào tử/ml) 106 0,00 e 3,33 de 17,78 bcde 22,00 bcde 22,00 bcde 10 HLBĐ 107 0,00 e 13,33 cde 33,33 abcd 59,26 a 59,26 a 108 0,00 e 3,33 de 40,74 abc 59,26 a 59,26 a 42,00 ab Trong cột, số có chữ theo sau giống khơng khác biệt mức ý nghĩa 5% HLBĐ : hoạt lực ban đầu Bảng 10 Hoạt lực diệt sâu chủng F04 sâu khoang Thời gian (ngày) 10 HLBĐ Nồng độ dung dịch nấm chủng F04 (bào tử/ml) 10 0,00 e 0,00 e 3,70 de 22,22 cd 22,22 cd 107 0,00 e 0,00 e 18,52 de 40,74 bc 40,74 bc 108 0,00 e 3,33 de 14,81 de 55,56 ab 55,56 ab 64,29 a Trong cột, số có chữ theo sau giống khơng khác biệt mức ý nghĩa 5% KẾT LUẬN Sự phân bố Paecilomyces sp đất đa dạng, không phụ thuộc vào loại trồng định hoạt tính diệt sâu chủng phân lập không giống Từ 33 mẫu đất phân lập năm chủng Paecilomyces Trong đó, chủng F01 Trang 66 thuộc P javanicus từ đất trồng bắp Đồng Nai, chủng F02 thuộc Paecilomyces sp từ đất trồng hoàn ngọc Tây Ninh, chủng F03 thuộc P lilacinum từ đất trồng cao su Tây Ninh hai chủng F04 F05 thuộc P lilacinus từ đất trồng khoai mì Tây Ninh Trong năm chủng nấm phân lập có hai TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T5- 2017 chủng F03 F04 cho hoạt lực cao việc diệt sâu khoang sau 10 ngày gây nhiễm Các môi trường bán rắn thích hợp để tăng sinh chủng F03 mơi trường gạo lức, cám mì trấu, chủng F05 môi trường gạo lức Độ ẩm môi trường nuôi cấy thích hợp cho hai chủng 55 % thời gian tăng sinh thích hợp 10 ngày Như vậy, với nguồn chất nuôi cấy bắn rắn dễ tìm kiếm rẻ tiền với điều kiện tăng sinh không phức tạp cho thấy triển vọng ứng dụng hai chủng F03 F04 vào sản xuất chế phẩm vi sinh phục vụ nông nghiệp Investigation of the spore production of Paecilomyces spp isolated from several agricultural soils with the biocontrol activily against Spodoptera litura Nguyen Quoc Linh Nguyen Nhu Nhut Gia Tuong Company Binh Duong ABSTRACT Paecilomyces is a fungus that parasites on various insect species However, Paecilomyces has not been widely studied and applied in Vietnam In this study, Paecilomyces spp were isolated from several agricultural soils and identified based on the morphology and 28S rDNA gene sequencing Biocontrol activities of Paecilomyces were measured in vitro against Spodoptera litura The Paecilomyces strains with high biocontrol were studied for the spore acquisition on semi-solid culture There were five isolated strains belonged to Paecilomyces (strain F01 belonged to P javanicus, strain F02 belonged to Paecilomyces sp., strain F03 belonged to P lilacinum and strains F04 and F05 belonged to P lilacinus) from 33 different samples In particular, both of F03 and F04 performed high biocontrol activity against S litura after 10 days of inoculation Optimization of spores production medium showed that F03 and F04 grew well on a defined semi-solid medium whose the main components were unpolished rice, wheat bran and husk of 55% humidity The results indicated that the native strains of Paecilomyces were potential for applications to produce bioproducts for pest management strategies Keywords: isolation, Paecilomyces, semi-solid, Spodoptera litura, spore production, unpolished rice TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A Khan, K.L Williams, H.K.M Nevelainen, A Abdusalom and J Rohila, The possibilities of computed tomography in paecilomycosis of lungs, Medical and Health Science Journal, 3, 36-41 (2010) [2] U Amala, T Jiji and A Naseema, Mass multiplication of entomopathogenic fungus, Paecilomyces lilacinus with solid substrate, Journal of biopesticides, 5, 2, 168 (2012) [3] K.K Chaudhar, K.R Ka, Compatibility of Pasteuria penetrans with fungal parasite Paecilomyces lilacinus against root knot nematode on Chilli (Capsicum annuum L.), Trang 67 Science & Technology Development, Vol 5, No.T20- 2017 Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences, 1, 1, 36 – 42 (2012) [4] Vũ Xuân Đạt, Nghiên cứu sử dụng nấm Lecanicillium kí sinh trùng để kiểm soát rệp hại rau, Luận văn thạc sĩ khoa học ĐH Khoa Học Tự Nhiên Hà Nội (2011) [5] K.K Everton , C.A Keyser, E N Rangel, R.N Nelson , D W.Roberts, CTC medium: A novel doine-free selective medium for isolatin entomopathogenic fungi, especially Metarhizium aacridum, from soil, Biological Control, 54, 197205 (2010) [6] F.J.P Flórez, Production of Beauveria bassiana fungal spores on rice to control the coffee berry borer, Hypothenemus hampei, in Colombia, Journal of Insect Science 8, 1–13 (2008) [7] N Hassouna, B Michot, and J Bachelleire, The complete nucleotide sequence of mouse 28 S rRNA gene, implications for the process of size increase of the large subunit rRNA in higher eukaryotes Nucleic Acids Research, 8, 3563-3583 (1984) [8] G Hu, J S Leger , Field studies using a recombinant mycoinsecticide (Metarhizium anisopliae) reveal that it is rhizosphere competent, Applied and Environmental Microbiology, 68, 12, 6383-6387 (2002) [9] Q.B Hu, S.X Ren, X.C An, M.H Qian, Insecticidal activity influence of destruxins on the pathogenicity of Paecilomyces javanicus against Spodoptera litura, Journal of Applied Entomology 131, 4, 262–268 (2007) [10] H.W Kan, L Ming, C Li, H Kan, B Sun, and Y Liang, Antidepressant effect of bioactive compounds from Paecilomyces tenuipes in mice and rats, Neural Regeneration Research, 5, 20, 1568 – 1572 (2010) [11] T.A Khan, B K Goswami, C Bhattacharyza , and R Paul , Perfomance of pesticide and biopesticide on growth, yield and forskolin content in Coleus forskohlii infected with Meloidogyne incognita, Pakista Journal of Nematology, 30, 1, 49–56 (2012) Trang 68 [12] A Khan, K.L Williams, H.K.M Nevelainen, Infection of plant-parasitic nematodes by Paecilomyces lilacinus and Monacrosporium lysipagum, BioControl, 51, 659–678 (2006) [13] R.D Kruger, J.B Posadas, M.A Lewylle, J I Mini, R.E Lecuona, Solid substrate production and formulation of an isolate of Metarhizium anisopliae for biological control of stem bug Tibraca limbativentris, World Applied Sciences Journal, 32, 7, 1242–1251 (2014) [14] C.G Pau, C.T.S Leong, S.K Wong, L Eng, M Jiwan, F.R Kundat, Z.F.B.A Aziz, O.H Ahmed, and N.M Majid, Isolation of indigenous strains of Paecilomyces lilacinus with antagonistic activity against Meloidogyne incognita, International Journal of Agriculture and Biology, 14, 197-203 (2012) [15] Lê Hữu Phước, Võ Thị Hướng Dương, Lê Hòa Lợi, Phân lập chọn môi trường nhân sinh khối ba lồi nấm ký sinh trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill Paecilomyces spp nhóm rau ăn Đồng sông Cửu Long, Đề tài nghiên cứu khoa học Trường Đại học An Giang (2009) [16] S.M Shim, K.R Lee, S.H Kim, K.H Im, J W Kim, U Y Lee, J.O Shim, M.W Lee, T.S Lee, The optimal culture conditions affecting the mycelial growth and fruiting body formation of Paecilomyces fumosoroseus, Mycobiology, 31, 4, 214–220 (2003) [17] P.Vetrivelkalai, M Sivakumar, I.E Jonathan, Biocontrol potential of endophytic bacteria on Meloidogyne incognita and its effect on plant growth in bhendi, Journal of Biopesticides 3, 2, 452–457 (2010) [18] V.H Vu, S.I Hong, K Kim, Production of aerial conidia of Lecanicillium lecanii 41185 by solidstate fermentation for use as a mycoinsecticide, Mycobiology, 36, 3, 183–189 (2008) ... hại trồng chưa phổ biến nghiên cứu chủ yếu tập trung vào ứng dụng loài Paecilomyces lilacinus, P tenuipe Do đó, nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành phân lập thu nhận Paecilomyces có đất trồng. .. Các chủng Paecilomyces phân lập thử nghiệm hoạt lực sâu khoang Thí nghiệm thực cách phun huyền phù bào tử chủng nấm Paecilomyces có mật độ 108 bào tử/ mL lên thức ăn sâu Ghi nhận số sâu chết ngày... mẫu đất phân lập năm chủng Paecilomyces Trong đó, chủng F01 Trang 66 thu c P javanicus từ đất trồng bắp Đồng Nai, chủng F02 thu c Paecilomyces sp từ đất trồng hoàn ngọc Tây Ninh, chủng F03 thu c