Nghiên cứu này nhằm xác định điều kiện thích hợp để thu nhận levan từ canh trường nuôi cấy. Dịch canh trường nuôi cấy sau khi ly tâm loại bỏ sinh khối được trộn với ethanol theo tỷ lệ dịch lọc: ethanol là 1:3 ở nhiệt độ -50 C trong 3 giờ sẽ cho hàm lượng levan cao nhất. Mời các bạn cùng tham khảo!
Công nghệ sinh học & Giống trồng NGHIÊN CỨU THU NHẬN LEVAN TỪ BACILLUS SUBTILIS VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN GÀ CẢNH GIAI ĐOẠN - 14 NGÀY TUỔI Lê Anh Tú1, Trần Đình Đức1, Nguyễn Thị Lan Anh1, Vũ Kim Dung1 Trường Đại học Lâm nghiệp TÓM TẮT Levan hợp chất polymer sinh học tổng hợp từ vi khuẩn mơi trường có thành phần sucrose Levan cung cấp nguyên liệu cho hàng loạt ngành công nghiệp nhiều lĩnh vực khác như: y dược, thực phẩm mỹ phẩm Ứng dụng tiềm levan để làm chất nhũ hóa dùng sữa, chất ổn định, chất làm đặc, đặc biệt có khả phục hồi sức khỏe có giá trị liệu pháp điều trị ung thư Ngoài ra, levan cịn ứng dụng ngành cơng nghiệp thức ăn chăn ni, làm tăng khả tiêu hóa thay sử dụng chất kháng sinh Nghiên cứu nhằm xác định điều kiện thích hợp để thu nhận levan từ canh trường nuôi cấy Dịch canh trường nuôi cấy sau ly tâm loại bỏ sinh khối trộn với ethanol theo tỷ lệ dịch lọc: ethanol 1:3 nhiệt độ -50C cho hàm lượng levan cao Bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi cho cám gà giai đoạn - 14 ngày tuổi bổ sung chế phẩm levan 0,1% nhiệt độ ép viên 700C cho kết chất lượng cám tốt đạt theo tiêu chuẩn Việt Nam cho phép Từ khóa: Bacillus subtilis, levan, polymer, thức ăn chăn nuôi ĐẶT VẤN ĐỀ Levan polymer fructose tạo liên kết β - (2 - 6) fructo – furanosidic (Ki-Hyo cộng sự, 2001; Mardo cộng sự, 2014), sản xuất thực vật, nấm men, nấm vi khuẩn (Jang cộng sự, 2001) Các nghiên cứu levan có khả chống ung thư (Calazans cộng sự, 1997) Levan sản xuất từ Microbacterium laevaniformans, Rahnella aquatilis Zymomonas mobilis có khả chống lại tám dòng khác tế bào ung thư (El-Safty cộng sự, 2012) Nhiều nghiên cứu levan thúc đẩy vai trò chúng điều trị sâu (Arvidson cộng sự, 2006) làm giảm cholesterol (Yamamoto cộng sự, 1999), điều hòa hoạt động miễn dịch thể (Calazans cộng sự, 1997) Levan ứng dụng chất làm sản phẩm sử dụng cho bệnh nhân tiểu đường (Jaecho cộng sự, 2001) Trong năm gần đây, việc sử dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trưởng thức ăn bị cấm hoàn toàn phần số quốc gia Việc sử dụng fructan sản xuất từ levan giúp cải thiện khả tiêu hóa chất dinh dưỡng, tăng hiệu suất tăng trưởng, tránh viêm nhiễm (Li cộng sự, 2013) tăng số lượng vi khuẩn axit lactic phân lợn cai sữa (Xin cộng sự, 2017) Với nhiều ứng dụng mang tính thực tế thân thiện với mơi trường (Poli cộng sự, 2009) levan trở thành đối tượng nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu nhằm thu nhận sản lượng mức cao nhất, ứng dụng nhiều ngành sản xuất Việc bổ sung dinh dưỡng chế độ ăn cho gà cảnh hay chế phẩm sinh học phần ăn, đặc biệt giai đoạn - 14 ngày tuổi giai đoạn sức đề kháng kém, nhạy cảm dễ tăng tỷ lệ chết Bổ sung dinh dưỡng giai đoạn cách hợp lý phù hợp với phát triển gà giúp cân dinh dưỡng, tăng sức đề kháng, tăng lợi khuẩn cho đường ruột cân đối ngoại hình phục vụ cho mục đích sử dụng Xuất phát từ thực tế đó, nghiên cứu thu nhận levan từ Bacillus subtilis bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn - 14 ngày tuổi nhằm tìm điều kiện thu nhận levan thích hợp xác định hàm lượng levan bổ sung vào thức ăn cho gà cảnh đạt tiêu chuẩn chế biến cảm quan PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Chủng vi khuẩn B subtilis natto từ sưu tập giống Bộ mơn Cơng nghệ vi sinh – hóa sinh Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp - Đại TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 21 Công nghệ sinh học & Giống trồng học Lâm nghiệp cung cấp Môi trường L1 (cao thịt g/l, peptone g/l) sử dụng để hoạt hóa B subtilis natto Mơi trường nhân giống (L2): cao thịt (3 g/l), peptone (1,5 g/l), NaCl (5 g/l) Môi trường sinh tổng hợp levan: sucrose (80 g/l), cao nấm men (2,3 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l), NaH2PO4.2H2O (3 g/l), Na2HPO4.12H2O (3 g/l) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Sinh tổng hợp levan Quá trình sinh tổng hợp levan B subtilis natto thực theo phương pháp Jothi cộng (2019) Theo đó, vi khuẩn hoạt hóa mơi trường L1, nhân giống mơi trường L2 nhiệt độ 370C thời gian 48 giờ, ni lắc120 vịng/phút Sau cấp giống với tỷ lệ giống cấp 7,5% vào môi trường sinh tổng hợp levan ni lắc với tốc độ 120 vịng/phút, nhiệt độ 370C thời gian 24 2.2.2 Thu nhận levan Dịch canh trường nuôi cấy B subtilis ly tâm loại sinh khối, sau nghiên cứu thu nhận levan phương pháp kết tủa với loại dung môi: ethanol 96o, iso propanol aceton Tiến hành kết tủa theo tỉ lệ thể tích dịch chiết levan với dung môi 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 để hỗn hợp -5oC, 0oC 32oC giờ, giờ, để tạo kết tủa levan Tiến hành lọc thu levan kết tủa theo phương pháp Santos cộng (2013) 2.2.3 Xác định hàm lượng levan Levan thu sau kết tủa ethanol o 96 thuỷ phân HCl 1M 1000C Dịch thuỷ phân trung hoà NaOH 2M hàm lượng fructose xác định phản ứng tạo màu với DNS đo bước sóng 540 nm (Berte cộng sự, 2013) Do levan polymer fructose nên hàm lượng levan tính theo cơng thức: L = F × 0,9 (Szwengiel cộng sự, 2004; Santos cộng sự, 2013) Trong đó: L: hàm lượng levan (g/l); F: hàm lượng fructose (g/l); 0,9: hệ số chuyển đổi 2.2.4 Xây dựng quy trình sản xuất cám gà cảnh bổ sung levan (giai đoạn 1-14 ngày tuổi) - Xác định tỷ lệ levan phối trộn: Sử dụng công thức cám cho gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi bảng Công ty Cổ phần chăn nuôi 22 C.P Việt Nam (đối chứng) sau bổ sung levan với hàm lượng 0,1% (Cơng thức 1); 0,2% (Công thức 2) 0,3% (Công thức 3) sau lựa chọn chế độ dinh dưỡng phù hợp - Xác định nhiệt độ ép viên: Sau lựa chọn công thức cám bổ sung levan tiến hành phối trộn ép viên Nhiệt độ lựa chọn cho máy ép viên gồm mức: 70oC, 80oC, 90oC để xác định hàm lượng levan lại theo mức nhiệt độ thông qua hàm lượng đường tổng số (Becrorang) tiêu ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan cám thành phẩm Công ty Cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam Bảng Thành phần nguyên liệu công thức cám gà giai đoạn - 14 ngày tuổi TT Loại nguyên liệu Tỷ lệ (%) Ngô nghiền 60,10 Khô đậu tương 12,50 Khô hạt cải 1,80 Cám gạo 6,20 Cám mì 14,90 Đá bột 0,80 Muối 0,40 Dầu cá 0,70 Lysin 0,04 10 L-Therionine 0,06 11 Premix vitamin + 2,48 khoáng 2.3 Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm lặp lại lần số liệu thu xử lý sai số phần mềm Excel KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát yếu tố đến trình thu nhận levan 3.1.1 Ảnh hưởng loại dung môi Theo Beste cộng (2014) việc thu nhận hợp chất polysaccharides từ thực vật ảnh hưởng lớn loại dung mơi Chính thế, tiến hành nghiên cứu ba loại dung môi: ethanol 96o, iso propanol, aceton đến khả tạo kết tủa levan việc lựa chọn loại dung mơi có số điện môi nhỏ nên không làm phân tán tới phân tử dung dịch Kết hình cho thấy khả kết tủa levan ethanol 96o hiệu so với iso propanol aceton Mặt khác, kết tủa levan TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng ethanol 96o có nhiều thuận lợi ethanol 96o hợp chất an toàn cho sản phẩm thu (Kang cộng sự, 1979) Hơn nữa, ethanol 96o có sẵn dạng tinh khiết với tạp chất gây nhiễm độc hay ức chế Nhiệt độ bay dung môi ethanol thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym phương pháp sấy nhẹ quạt gió Nghiên cứu Jothi cộng (2019) thử nghiệm ảnh hưởng dung môi khác nhau: ethanol, isopropanol, acetone, methanol lên hàm lượng levan thu được, kết cho thấy dung môi kết tủa ethanol cho hàm lượng levan lớn Kết tương đồng với kết thí nghiệm lựa chọn dung mơi ethanol 96o để kết tủa sinh tổng hợp levan Vì vậy, lựa chọn dung môi ethanol 96o cho nghiên cứu Hình Hàm lượng levan thu theo loại dung môi 3.1.2 Ảnh hưởng tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi đến hàm lượng levan thu Sau lựa chọn dung môi kết tủa ethanol 96o cho hàm lượng levan cao nhất, tiếp tục lựa chọn tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi 1:1, 1:2, 1:3 1:4 để xác định hàm lượng levan thu theo tỷ lệ Kết hàm lượng levan thu thể hình Qua kết hình cho thấy, thể tích dịch chiết levan dung môi tỷ lệ 1:1 1:2 kết tủa tạo thành dạng nhầy, lọc kết tủa Khi tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi 1:3 cho hàm lượng levan thu cao (18,02 g/l) cao so với tỷ lệ 1:4 (16,63 g/l) Hình Ảnh hưởng tỷ lệ thể tích dịch chiết dung môi đến hàm lượng levan (Ghi chú: giá trị – không lọc kết tủa) Năm 2013, tác giả Bruna cộng nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp levan chủng B subtilis Natto CCT 7712 cho thấy với tỷ lệ thể tích levan dung mơi ethanol 96o 1:3, điều kiện nhiệt độ 40C thời gian 12 thu hàm lượng levan cao Cũng nghiên cứu Gabrielly cộng (2017) lựa chọn tỷ lệ 1:3 (tỷ lệ thể tích levan dung mơi ethanol) cho q trình sinh tổng hợp levan fructooligosaccharides từ chủng B subtilis Natto Các kết tương đồng với kết nghiên cứu sử dụng tỷ lệ thể tích dịch chiết levan với dung môi ethanol 96o 1:3 thu hàm lượng levan cao Chính vậy, TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 23 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng lựa chọn tỷ lệ cho nghiên cứu 3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ Ở mức nhiệt độ khác có ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng levan kết tủa thu Do đó, với điều kiện thu nhận levan xác định cách sử dụng dung môi kết tủa ethanol 96o, tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi 1:3, tiếp tục xác định nhiệt độ kết tủa hỗn hợp lỏng nhiệt độ: -5oC, 0oC 32oC Kết ảnh hưởng nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thể hình Hình Ảnh hưởng nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan Kết hình cho thấy, kết tủa nhiệt độ -5oC, hàm lượng levan thu cao (18,02 g/l) Nhiệt độ kết tủa 0oC làm cho hàm lượng levan giảm dần (16,63 g/l) nhiệt độ môi trường (32oC) hàm lượng levan thu thấp (12,48 g/l) Khi nghiên cứu tối ưu điều kiện thu nhận levan từ chủng B subtilis Natto, Santos cộng (2013) cho hàm lượng levan thu cao lựa chọn kết tủa levan dung môi ethanol nhiệt độ 5oC Do vậy, lựa chọn nhiệt độ kết tủa -5oC cho nghiên cứu 3.1.4 Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu Nghiên cứu lựa chọn thời gian kết tủa giờ, với điều kiện xác định: sử dụng dung môi kết tủa ethanol 96o, tỷ lệ thể tích dịch chứa levan dung mơi 1:3 nhiệt độ kết tủa -5oC Kết hàm lượng levan thu thể hình cho thấy hàm lượng levan tăng lên (16,63 g/l) tăng thời gian lên so với thời gian kết tủa ngắn (1 giờ; 14,56 g/l) Hình Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hàm lượng levan Trong nghiên cứu Manel cộng (2018) đánh giá hiệu việc sử dụng kết tủa ethanol exopolysaccharides có sử dụng ba loại vi khuẩn acid lactic nhận thấy, 24 tăng thời gian lên hiệu suất kết tủa khơng tăng Tương tự quy luật thay đổi độ tinh tăng tăng thời gian Tuy nhiên, tăng thời gian đến mức tới hạn độ tinh TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 Công nghệ sinh học & Giống trồng giảm Điều thời gian kéo dài tạo điều kiện cho tập hợp phân tử vùng pH đẳng điện làm tăng lượng kết tủa Tuy vậy, kéo dài đến thời gian xác định khơng làm tăng số lượng kết tủa, nên không làm tăng hiệu suất kết tủa Ngồi ra, số polysaccharide bị kết tủa pH thay đổi thời gian dài làm giảm độ tinh sản phẩm Do nghiên cứu này, tăng thời gian kết tủa lên không làm tăng hàm lượng levan thu Vì vậy, lựa chọn thời gian kết tủa để thu nhận levan 3.2 Nghiên cứu quy trình sản xuất cám gà cảnh từ chế phẩm levan (giai đoạn - 14 ngày tuổi) 3.2.1 Xác định tỷ lệ levan phối trộn Gà giai đoạn - 14 ngày tuổi có lượng tế bào tăng lên mạnh mẽ nên trình sinh trưởng diễn nhanh, số quan chưa phát triển hồn chỉnh men tiêu hóa chưa đầy đủ, khả điều tiết thân nhiệt kém, gà dễ bị ảnh hưởng thức ăn trình ni dưỡng Vì thức ăn có đủ hàm lượng dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến gà thời kì Bảng Kết phân tích dinh dưỡng cám công thức Thành phần Công thức Công thức Công thức Công thức dinh dưỡng (%) đối chứng M 11,5 ± 0,03 11,5 ± 0,03 11,4 ± 0,03 11,4 ± 0,03 CP 21,8 ± 0,03 21,8 ± 0,03 21,9 ± 0,03 22,0 ± 0,03 Fat 4,7 ± 0,02 4,7 ± 0,02 4,6 ± 0,02 4,7 ± 0,02 Fib 2,3 ± 0,011 2,3 ± 0,011 2,4 ± 0,011 2,4 ± 0,011 GE (kcal/kg) 3120 ± 1,5 3140 ± 1,5 3158 ± 1,5 3177 ± 1,5 Ca 0,71 ± 0,005 0,70 ± 0,005 0,71 ± 0,005 0,72 ± 0,005 P 0,77 ± 0,005 0,77 ± 0,005 0,76 ± 0,005 0,77 ± 0,005 Lysin 0,04 ± 0,001 0,04 ± 0,001 0,04 ± 0,005 0,04 ± 0,005 Ghi chú: M (Moisture), CP (Cruide Protein), Fat (Fat), Fib (Fiber), GE (Gross Energy), Ca (Calcium), P (Phosphorus) Dựa vào kết bảng cho thấy tất công thức bổ sung levan khơng có thay đổi đáng kể với tiêu: M, CP, Fat, Fib, Ca, P, Lysin Trong dinh dưỡng gia cầm lượng xem nguồn dinh dưỡng giới hạn nhu cầu lớn so với chất dinh dưỡng khác Nhu cầu lượng gia cầm xác định mức lượng cần thiết cho sinh trưởng phát triển cho trì hoạt động sống thể Thiếu lượng dẫn đến suy giảm trình trao đổi hoạt động chức thể khiến gia cầm còi cọc, chậm lớn, suất giảm Năng lượng công thức đạt mức cao (3177 kcal/kg) cao so với công thức đối chứng (3120 kcal/kg), công thức (3140 kcal/kg), công thức (3148 kcal/kg) Tuy nhiên, xét mức độ giá thành cho chế phẩm levan bổ sung vào thức ăn chăn ni tỷ lệ 0,1% công thức đem lại hiệu không làm tăng giá nhiều cám thành phẩm Kết tương đồng với việc bổ sung chế phẩm prebiotic (0,1%) vào thức ăn cho lợn giai đoạn nhỏ (Li cộng sự, 2013) hay việc bổ sung tỷ lệ 0,0075% chế phẩm prebiotic vào giai đoạn gà đẻ giai đoạn 1-35 ngày tuổi (Lensing cộng sự, 2012) 3.2.2 Nghiên cứu xác định nhiệt độ ép viên Trong toàn quy trình sản xuất thức ăn chăn ni, hệ thống ép viên có vai trị quan quan trọng, định tính chất dinh dưỡng, hình dạng, độ bền, độ cứng, độ bụi viên cám Ngoài ra, nhiệt độ máy ép viên ảnh hưởng tới hoạt động vi sinh vật, chất dinh dưỡng, enzyme nguyên liệu, enzyme bổ sung thêm vào thức ăn chăn nuôi Chính vậy, q trình ép viên nhiệt độ cao ảnh hưởng đến hàm lượng levan lại cám thành phẩm, gây hao hụt chất dinh dưỡng Do vậy, nghiên cứu giúp lựa chọn nhiệt độ ép viên thích hợp để giữ TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 25 Công nghệ sinh học & Giống trồng hàm lượng levan cao sau ép viên Thí nghiệm nhiệt độ thực máy cám viên thuộc phịng sản xuất Cơng ty cổ phần chăn ni C.P Việt Nam, phân tích hàm lượng levan dựa xác định hàm lượng đường tổng số mẫu cám thành phẩm, phân tích tiêu dinh dưỡng, tiêu cảm quan tiêu vi sinh cho kết theo bảng Bảng Kết phân tích thành phần dinh dưỡng bổ sung chế phẩm levan Chỉ tiêu Công thức đối chứng Công thức bổ sung levan (%) 0 0 70 C 80 C 90 C 70 C 800C 900C Đường tổng số 6,29 ± 0,01 6,28 ± 0,01 6,29 ± 0,01 6,35 ± 0,01 6,36 ± 0,01 6,36 ± 0,01 M 11,5 ± 0,05 11,0 ± 0,05 10,8 ± 0,05 11,5 ± 0,05 11,1 ± 0,05 10,8 ± 0,05 CP 21,8 ± 0,05 21,5 ± 0,05 20,9 ± 0,05 21,9 ± 0,05 21,5 ± 0,05 21,0 ± 0,05 Fat 4,8 ± 0,1 4,5 ± 0,1 4,3 ± 0,1 4,8 ± 0,1 4,6 ± 0,1 4,2 ± 0,1 Fib 2,3 ± 0,05 2,2 ± 0,05 2,0 ± 0,05 2,3 ± 0,05 2,1 ± 0,05 2,0 ± 0,05 GE 3120 ± 2,5 3121 ± 2,5 3123 ± 2,5 3140 ± 2,5 3141 ± 2,5 3140 ± 2,5 (Kcal/kg) Ca 0,71 ± 0,05 0,70 ± 0,05 0,69 ± 0,05 0,70 ± 0,05 0,70 ± 0,05 0,69 ± 0,05 P 0,77 ± 0,05 0,72 ± 0,05 0,70 ± 0,05 0,77 ± 0,05 0,72 ± 0,05 0,70 ± 0,05 Lysin 0,04 ± 0,001 0,03 ± 0,001 0,02 ± 0,001 0,04 ± 0,001 0,03 ± 0,001 0,02 ± 0,001 Ghi chú: M (Moisture), CP (Cruide Protein), Fat (Fat), Fib (Fiber), GE (Gross Energy), Ca (Calcium), P (Phosphorus) Chỉ tiêu Độ bền (%) Độ cứng (kg) Độ bụi (%) Bảng Kết kiểm tra cảm quan thức ăn chăn nuôi bổ sung levan Công thức đối chứng Công thức 700C 98,0 ± 0,5 2,0 ± 0,1 2,0 ± 0,1 800C 95,6 ± 0,6 2,2 ± 0,1 4,6 ± 0,1 900C 94,3 ± 0,5 2,5 ± 0,1 5,7 ± 0,1 700C 98,0 ± 0,6 2,0 ± 0,1 2,0 ± 0,1 800C 95,6 ± 0,5 2,2 ± 0,1 4,4 ± 0,1 900C 94,4 ± 0,5 2,5 ± 0,1 5,6 ± 0,1 Bảng Kết phân tích vi sinh thức ăn chăn nuôi bổ sung levan Công thức đối chứng Công thức Chỉ tiêu 0 0 70 C 80 C 90 C 70 C 800C 3 Tổng vi khuẩn hiếu khí (CFU/g) 3.2x10