Hiện nay, dịch bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây thiệt hại rất lớn đối với nghề nuôi cá tra. Có nhiều biện pháp để phòng và điều trị, trong đó biện pháp sinh học đang được tập trung nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, 2 chủng Bacillus subtilis (Q16 và Q111) cho thấy có khả năng đối kháng với E. ictaluri bằng phương pháp vạch vuông góc và giếng khuếch tán.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC Edwardsiella ictaluri CỦA HAI CHỦNG Bacillus subtilis Q16 Bacillus subtilis Q111 TRONG ĐIỀU KIỆN CẢM NHIỄM TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG Nguyễn Văn Minh1*, Đỗ Phương Quỳnh1, Võ Ngọc Yến Nhi1, Dương Nhật Linh1, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh2, Lê Hồng Phước2 TÓM TẮT Hiện nay, dịch bệnh gan thận mủ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây thiệt hại lớn nghề nuôi cá tra Có nhiều biện pháp để phịng điều trị, biện pháp sinh học tập trung nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chủng Bacillus subtilis (Q16 Q111) cho thấy có khả đối kháng với E ictaluri phương pháp vạch vng góc giếng khuếch tán Đồng thời, thử nghiệm đánh giá tính an tồn thử nghiệm khả bảo vệ cá tra giống điều kiện cảm nhiễm E ictaluri cho thấy chủng B subtilis (Q16 Q111) an tồn có khả bảo vệ vật chủ với số RPS 56,44% chủng B subtilis Q16, 100% B subtilis Q111 100% chủng B subtilis (Q16 + Q111) Những kết cho thấy chủng B subtilis (Q16 Q111) phân lập từ ao nuôi cá tra có tiềm để sản xuất chế phẩm probiotic dùng cho cá tra Từ khóa: Kiểm sốt sinh học, Bacillus subtilis Q16, Bacillus subtilis Q111, bệnh gan thận mủ, Edwardsiella ictaluri I MỞ ĐẦU Việc nuôi cá tra thâm canh với quy mô lớn nhằm đáp ứng nhu cầu xuất dẫn đến nguy xuất dịch bệnh ngày nhiều Trong đó, bệnh gan thận mủ tác nhân Edwardsiella ictaluri gây chết 10 - 90% cá ni khơng có biện pháp can thiệp kịp thời (Crumlish ctv., 2002) Gần đây, chế phẩm sinh học từ vi sinh vật xem giải pháp cần hướng đến để ngăn chặn giảm thiểu thiệt hại nhờ an toàn với vật nuôi, thân thiện với môi trường cung cấp lồi vi sinh vật có lợi (Lại Thúy Hiền ctv., 2002) Vi khuẩn Bacillus sử dụng tác nhân sinh học, xây dựng thành sản phẩm thương mại hữu ích có khả tạo bào tử có lợi tế bào sinh dưỡng ổn định thời gian dài, có tác động đối kháng mầm bệnh tiêu hoá tự nhiên động vật (Kwon ctv., 2009) Trong báo cáo Chao ctv., (2012) chứng minh chủng Bacillus phân lập sàng lọc từ đất ruột cá da trơn có khả đối kháng với tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính cá da trơn E ictaluri Aeromonas hydrophila (Chao ctv., 2012) Hai chủng Bacillus subtilis (Q16 Q111) định danh phương pháp sinh hóa giải trình tự 16S rDNA, chứng minh tính an tồn khả bảo vệ cá tra bột chống lại E ictaluri gây bệnh gan Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở TP HCM *Email: nguyenminhou@gmail.com Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản 48 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN thận mủ (Nguyễn Văn Minh (a) ctv., 2013) Trong nghiên cứu này, tiếp tục thực thử nghiệm cá tra giống để ứng dụng làm probiotic sử dụng nuôi trồng cá tra II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Cá tra giống kích thước đồng khoảng 15-20 g.con-1, nuôi ngày cung cấp từ trại cá giống Út Nhân (Củ Chi, TP HCM) Hai chủng vi khuẩn B subtilis (Q16 Q111) cung cấp phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh, Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh Vi khuẩn gây bệnh E ictaluri cung cấp từ Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II Các chủng bảo quản glycerin -400C 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thử đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Ewardsiella ictaluri Phương pháp vạch vng góc: cấy vi khuẩn gây bệnh thẳng vạch thứ môi trường Nutrient agar (NA) Sau đó, cấy vi khuẩn thử nghiệm thẳng vạch vng góc với vạch thứ nhất, ủ 30oC Quan sát sau 24 giờ, 48 giờ, 72 (Purivirojkul ctv., 2007) Phương pháp giếng khuếch tán: trải dịch vi khuẩn gây bệnh E ictaluri (mật độ 2.108CFU.ml-1) lên đĩa thạch Brain Heart Infusion (BHI) Sau 50 µl dịch khuẩn khảo sát trung hòa pH = bơm vào giếng có đường kính mm đĩa thạch trải vi khuẩn gây bệnh Đo đường kính vịng kháng khuẩn sau 24 giờ, ủ 30oC (Chythanya ctv., 2002) 2.2.2 Đánh giá tính an toàn B subtilis (Q16, Q111) thử nghiệm Thử nghiệm khả gây dung huyết Vi khuẩn thử nghiệm cấy lên môi trường thạch máu Blood Agar (bổ sung 5% máu cừu) Tiến hành với vi khuẩn đối chứng không tiêu huyết Đọc kết sau ủ 30oC 24 (Gerhardt ctv., 1981) Thử nghiệm đánh giá tính an tồn B subtilis (Q16 Q111) cá tra giống Chuẩn bị thức ăn bổ sung vi khuẩn thử nghiệm: chủng vi khuẩn thử nghiệm ni cấy lắc 150 vịng.phút-1 môi trường Nutrient Broth (NB), ủ 37oC Sau 24 giờ, thu sinh khối cách ly tâm 8.000 vòng.phút-1 10 phút Sinh khối đông khô sữa gầy Bột đông khô bổ sung vào thức ăn tổng hợp Uni President (protein 28%, chất béo, tro, chất xơ…) để mật độ vi khuẩn đạt 2.107 CFU.g-1 Sau thức ăn áo lớp dầu mực (Newaj ctv., 2007) Thí nghiệm tiến hành với lô thử nghiệm bổ sung thức ăn phối trộn với chủng B subtilis Q16, B subtilis Q111 lô đối chứng cho ăn thức ăn bình thường Mỗi nghiệm thức gồm 75 con.300 l-1.bể composit-1, lặp lại lần Nước nuôi lọc thay 50% lần-1.tuần-1 Ở nghiệm thức thử nghiệm, thức ăn bổ sung vi khuẩn tương ứng với liều lượng: ngày lần, lần 3% trọng lượng cá (Essa ctv., 2010) Theo dõi ghi nhận số cá chết 28 ngày cho ăn thức ăn bổ sung vi khuẩn thử nghiệm Tỉ lệ sống cá tính theo cơng thức: % sống = số cá sống×tổng số cá thí nghiệm-1 2.2.3 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm từ B subtilis (Q16, Q111) Chủng B subtilis Q16 B subtilis Q111 tối ưu hóa mơi trường lên men thu sinh khối phương pháp quy hoạch thực nghiệm (Nguyễn Văn Minh (b) ctv., 2013; Nguyễn Thị Thúy ctv., 2013) Bằng nồi lên men Bioflo 110, lên men chủng B subtilis (Q16, Q111) môi trường tối ưu tương ứng Mật độ vi khuẩn sau trình lên men kiểm tra phương pháp cấy trang mơi trường NA (Nguyễn TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 49 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Đức Lượng, 2003) Thu sinh khối cách ly tâm 8.000 vòng.phút-1 10 phút Sinh khối đông khô -50oC sữa gầy sau phối trộn với bột khoai mì (Nguyễn Đức Lượng, 2002) với tỷ lệ thích hợp để tạo thành sản phẩm có mật độ tế bào 109 CFU.g-1 Đóng gói thành phẩm với khối lượng tịnh 500 g.gói-1 2.2.4 Khảo sát liều gây chết trung bình LD50 E ictaluri lên cá tra giống Cá tra giống cho vào lơ thí nghiệm 10 con.40 l-1.thau nhựa-1 Mật độ vi khuẩn E ictaluri xác định thông qua đường tương quan giá trị OD610 mật độ tế bào vi khuẩn E ictaluri (Trần Linh Thước, 2010) Ngâm vi khuẩn E ictaluri (mật độ thử nghiệm 108, 109, 1010, 1011 CFU.ml-1) 15 l nước.10 cá-1.lô-1 Sau 60 phút, bơm nước để đạt 40 l (Capkin ctv., 2009) Cá thử nghiệm nhịn đói 12 sau cảm nhiễm Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Ghi nhận số cá chết ngày cá ngưng chết liên tục ngày (NewajFyzul ctv., 2007) LD50 tính dựa vào cơng thức Reed Muech (1938): LD50 = 10 (lũy thừa nồng độ gây chết nhỏ 50% - PD) Trong đó, PD = [(tỉ lệ cá nhiễm thấp 50% - 50%) (tỉ lệ cá nhiễm thấp 50% - tỉ lệ cá nhiễm cao 50%)-1] LD50 tính dựa vào cơng thức Reed Muech (1938): LD50 = 10 (lũy thừa nồng độ gây chết nhỏ 50% - PD) Trong đó, PD = [(tỉ lệ cá nhiễm thấp 50 - 50%)×(tỉ lệ cá nhiễm thấp 50% - tỉ lệ cá nhiễm cao 50%)-1] 2.2.5 Đánh giá khả bảo vệ cá tra giống điều kiện gây nhiễm E ictaluri hai chủng vi khuẩn B subtilis (Q16, Q111) Các lơ thí nghiệm thức ăn chuẩn bị tương tự mục thí nghiệm đánh giá tính an toàn chủng thử nghiệm lên cá tra giống, bột đơng khơ thay chế phẩm thử nghiệm 50 Thí nghiệm tiến hành nghiệm thức: nghiệm thức đơn chủng, nghiệm thức phối hợp chủng, đối chứng dương đối chứng âm Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Ở nghiệm thức thử nghiệm, thức ăn bổ sung vi khuẩn tương ứng với liều lượng: 3% trọng lượng cá×lần-1, lần×ngày-1 (Essa ctv., 2010) Sau 28 ngày, nghiệm thức thử nghiệm đối chứng dương cảm nhiễm với E ictaluri mật độ LD50 (Newaj-Fyzul, 2007) Bể đối chứng âm bổ sung môi trường canh BHI Theo dõi ghi nhận số cá chết 14 ngày cho ăn thức ăn bổ sung vi khuẩn thử nghiệm Tỉ lệ sống cá tính theo cơng thức: % sống = số cá sống.tổng số cá thí nghiệm-1 Xác định số RPS (Relative Percentage of Survival) theo công thức: RPS = (1- (số cá chết nghiệm thức vừa có probiotic vừa có E ictaluri/số cá chết nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn (đối chứng âm)-1) x 100 (Amend, 1981) Kết xử lý thống kê ANOVA phần mềm Excel Microsoft phần mềm Stargraphic 3.0 Kết trình bày gồm giá trị trung bình ± sai số Cá chết sau kiểm tra dấu hiệu bệnh lý, đồng thời tiến hành phân lập định danh vi khuẩn gan, thận, lách cá thử nghiệm sinh hoá theo khoá phân loại Bergey’s (Holt ctv., 1994) III KẾT QUẢ 3.1 Khả đối kháng E ictaluri chủng B subtilis (Q16, Q111) Hai chủng vi khuẩn B subtilis Q16 B subtilis Q111 thử khả đối kháng với E ictaluri gây bệnh cá tra Bằng phương pháp cấy vạch vng góc, vị trí giao 24 giờ, 48 72 giờ, chủng E ictaluri không mọc Điều cho thấy, chủng thử nghiệm đối kháng với E ictaluri (Hình 1) Bằng phương pháp giếng khuếch tán, chủng B subtilis Q16 Q111 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Hình Khả đối kháng E ictaluri chủng thử nghiệm tạo vịng kháng mạnh với đường kính vịng kháng khuẩn tương ứng 23 ± 0,3 mm 21,5 ± 0,3 mm 3.2 Tính an tồn chủng vi khuẩn B subtilis (Q16 Q111) Cả chủng B subtilis (Q16 Q111) khơng có khả dung huyết ( ) an toàn cá tra giống với tỷ lệ sống 100% khơng có khác biệt nghiệm thức đối chứng γ 3.3 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Chế phẩm sau đông khô kiểm tra mật độ phối trộn với chất mang bột khoai mì với tỉ lệ thích hợp, cho thành phẩm đạt 109 CFU.g-1 Đóng gói thành phẩm với khối lượng tịnh 500 g.gói-1 3.4 Kết liều gây chết trung bình - LD50 E ictaluri lên cá tra giống Kết khảo sát liều gây chết trung bình LD50 trình bày bảng Bảng Kết liều gây chết LD50 Nghiệm Liều gây độc thức (CFU.ml-1) NT1 NT2 NT3 NT4 x 108 x 109 x 1010 x 1011 PD LD50 Tổng chết (con) 15 21 30 0,84481 x 109 Tổng sống (con) 26 15 Tổng chết dồn (con) 19 40 70 Tổng sống dồn (con) 50 24 Tỷ lệ chết dồn (%) 7,41 44,19 81,63 100,00 3.5 Khả bảo vệ cá tra giống Kết khảo sát bảng cho thấy mật độ E ictaluri 109 CFU/mL, cá tra chết 50% điều kiện gây nhiễm E ictaluri chủng sau cảm nhiễm Dựa vào kết LD50, vi khuẩn B subtilis (Q16 Q111) sử dụng liều LD50 tức 2.109 CFU Sau 14 ngày theo dõi, kết thí nghiệm ml-1 để sử dụng cho thí nghiệm chúng tơi trình bày hình Nghiệm TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 51 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN thức đối chứng âm (NT5) có 100% cá sống hoạt động bình thường Ở nghiệm thức NT2, NT3, 100% cá thử nghiệm khỏe mạnh Ở nghiệm thức NT1, NT4 cá có biểu đặc trưng bệnh gan thận mủ gây E ictaluri: mắt đỏ, xuất huyết mang đuôi, giải phẫu gan thận có đốm trắng Tiến hành phân lập định danh từ mẫu gan, thận cá chết cho thấy vi khuẩn gan, thận cá vi khuẩn E ictaluri Điều chứng tỏ cá chết nghiệm thức NT1 NT4 vi khuẩn E ictaluri gây Từ ngày thứ trở cá nghiệm thức NT4 (đối chứng dương) bắt đầu chết, từ ngày thứ trở đi, cá nghiệm thức NT1 (B subtilis Q16) bắt đầu chết Sau 14 ngày thử nghiệm, số lượng cá chết nghiệm thức có khác nhau, nghiệm thức NT2 (B subtilis Q111) nghiệm thức NT3 (phối hợp) có tỉ lệ sống cao đạt 100%, nghiệm thức NT1 (B subtilis Q16) có tỉ lệ sống 73,3% nghiệm thức NT4 (đối chứng dương) có tỉ lệ sống thấp 38,7% Tỷ lệ sống tương đối (Relative Percentage of Survival) tương ứng NT1, NT2, NT3 (%) 56,44, 100 100 Như chủng B subtilis (Q16 Q111) cho thấy có khả kiểm sốt E ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra giống Hình Tỉ lệ sống cá tra sau cảm nhiễm với E ictaluri Ghi chú: NT1: cho cá ăn với thức ăn bổ sung vi khuẩn B subtilis Q16; NT2: cho cá ăn với thức ăn bổ sung vi khuẩn B subtilis Q111; NT3: cho cá ăn với thức ăn bổ sung vi khuẩn B subtilis (Q16 + Q111); NT4: đối chứng dương; NT5: đối chứng âm IV THẢO LUẬN Hai chủng B subtilis (Q16, Q111) thử nghiệm cho thấy chúng có tính an tồn khả bảo vệ cá tra khỏi E ictaluri gây bệnh gan thận mủ Với phương pháp cấy vạch vng góc, vị trí giao đĩa thử nghiệm, chủng vi khuẩn gây bệnh 52 E ictaluri không mọc chứng tỏ chủng mẫn cảm với chất kháng khuẩn chủng B subtilis Q16 Q111 tạo Kết thử nghiệm phương pháp giếng khuếch tán phù hợp với nghiên cứu Võ Minh Sơn ctv., (2011), chủng Bacillus spp phân lập từ ao ni cá tra có hoạt tính kháng E ictaluri với vịng kháng cao TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Từ thí nghiệm khả bảo vệ cá tra giống điều kiện gây nhiễm E ictaluri, nhận thấy 100% cá nghiệm thức NT5 (đối chứng âm) sống hoạt động bình thường nghĩa yếu tố mơi trường không ảnh hưởng đến cá Đồng thời, cá nghiệm thức NT4 (đối chứng dương), NT1 (B subtilis Q16) chết 61,3 26,7 % nhiễm vi khuẩn E ictaluri Nghiệm thức NT2 (B subtilis Q111) NT3 (B subtilis Q16 Q111) 100% cá thử nghiệm khỏe mạnh cho thấy hai chủng có khả bảo vệ cá tra giống khỏi E ictaluri gây bệnh gan thận mủ Đặc biệt, bổ sung chủng B subtilis Q111vào thức ăn riêng lẻ hay kết hợp với B subtilis Q16 tỉ lệ sống cá đạt 100% Chao ctv., (2012) báo báo bổ sung Bacillus vào thức ăn có khả kiểm sốt E ictaluri gây bệnh cá tra V KẾT LUẬN Với kết thực nghiệm trình bày trên, chúng tơi kết luận chủng B subtilis (Q16 Q111) vừa an tồn vừa có khả bảo vệ cá tra giống chống lại E ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra điều kiện thí nghiệm Đây chủng có tiềm lớn để đưa vào ứng dụng làm probiotic sử dụng nuôi cá tra TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lại Thúy Hiền, Đỗ Bá Tú, Đỗ Thu Phương, Phạm Thị Hằng, Nguyễn Thị Yên, Vương Thị Nga, Võ Mai Hương, Phạm Ngọc Lan, Nguyễn Thu Thủy, Bùi Lê Thanh Nhàn, 2008 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học Nitrobac ứng dụng xử lý nước nuôi tôm Thừa Thiên - Huế Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 62, 249-256 Nguyễn Văn Minh (a), Nguyễn Hoàng Tuấn Duy, Đỗ Phương Quỳnh, Võ Ngọc Yến Nhi, Dương Nhật Linh, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Lê Hồng Phước, 2013 Khả kiểm soát sinh học Edwardsiella ictaluri gây bệnh số chủng Bacillus spp phân lập từ ao ni cá tra Tạp chí Khoa học Công nghệ 51(3A), 1-16 Nguyễn Văn Minh (b), Nguyễn Thị Diệu Hiền, Nguyễn Thị Thúy, Võ Ngọc Yến Nhi, Dương Nhật Linh, 2013 Tối ưu hóa mơi trường lên men thu sinh khối chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Q16 phương pháp bề mặt đáp ứng Hội nghị Khoa học Công nghệ Quốc tế ISCE 2013 Nguyễn Đức Lượng, 2002 Công nghệ vi sinh – tập NXB Đại học Quốc gia Tp HCM, 372 trang Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Thị Ánh Tuyết, 2003 Thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học – tập 2: Thí nghiệm vi sinh vật học NXB Đại học Quốc gia Tp HCM, 462 trang Võ Minh Sơn, Văn Thị Thuý, Nguyễn Ngọc Tĩnh, 2011 Phân lập đánh giá hoạt tính sinh học hai chủng vi khuẩn Bacillus spp có tiềm sử dụng pzrobiotic phịng bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn ISSNN 0866-7020, 144-152 Nguyễn Thị Thúy, Nguyễn Thị Diệu Hiền, Dương Nhật Linh, Nguyễn Văn Minh, 2013 Tối ưu hóa mơi trường lên men thu sinh khối chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Q111 phương pháp đáp ứng bề mặt Hội nghị CNSH Toàn quốc năm 2013, 2, 578-581 Trần Linh Thước, 2010 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo dục Việt Nam, 70 trang Tài liệu tiếng Anh Amend, D.F., 1981 Potency testing of fish vaccines Dev Biol Standard 49, 447-454 Capkin, E., Altinok, I., 2009 Effect of dietary probiotic supplementation on prevention/ treatment of yersiniosis disease Journal of Applied Microbiology 106, 1147-1149 Chao, R., Abel, C., Malachi, A.W., Nancy, C., Bui, C.T.D., Joseph, C.N., Joseph, W.K., EiL, O., Craig, L.B., Jeffery, S.T., Mark, R.L., 2012 Identification of Bacillus strains for TAÏP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 53 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN biological control of catfish pathogens Plos one 7(9), 1-9 Chythanya, R., Karunasagar, I., 2002 Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain Aquaculture 208, 1-10 Crumlish, M., Dung, T.T., Turnbull, J.F., Ngoc, N.T.N., Ferguson, H.W., 2002 Indentification of E ictaluri from diseased freshwater catfish, P hypoththalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases 25 (12), 733-736 Essa, A.M., El-Serafy, S.S., El-Ezabi M.M., Daboor, M.S., Esmael, A.N., Lall, P.S., 2010 Effect of different dietary probiotics on growth, feed utilization and digestive enzymes activities of Nile Tilapia, Oreochromis niloticus Journal of the Arabian Aquaculture society 5(2), 143-161 Gerhardt, P., Murray, R.G.E., Costilow, R.N., Nester, E.W., Wood, W.A., Krieg, N.R., Phillips, G.B., 1981 Manual of methos for general bacteriology American Society for Microbilogy 54 Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., Williams, S.T., 1994 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 9th edition, Chapper V, 816 pages Kwon, G.H., Lee, H.A., Park, J.Y., Kim, J.S., Lim, J., Park, C.S., Kwon, D.Y., Kim, Y.S., Kim, J.H., 2009 Development of a RAPD-PCR method for identification of Bacillus species isolated from Cheonggukjang International Journal of Food Microbiology 129, 282-287 Newaj-Fyzul, A., Adesiyun, A.A., Mutani, A., Ramsubhag, A., Brunt, J., Austin, B., 2007 Bacillus subtilis AB1 control Aeromonas infection in rainbow trout (Oncohynchus mykiss, Walbaum) Journal of Applied Microbiology 103, 1-6 Purivirojkul, W., Areechon, N., 2007 Application of Bacillus spp Isolated from the Intestine of BlackTiger Shrimp (Penaeus monodon Fabricius) from Natural Habitat for Control Pathogenic Bacteria in Aquaculture Kasetsart J (Nat Sci.) 41, 125-132 Reed, J.L., Muench, H., 1938 A simple method of estimating fifty percent Endpoints The American journal of hygiene 27, 493-497 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN BIOCONTROL CAPABILITY OF Edwardsiella ictaluri IN TRA CATFISH FINGERLINGS (Pangasianodon hypophthalmus) BY Bacillus subtilis Q16 AND Bacillus subtilis Q111 UNDER EXPERIMENTAL INFECTION CONDITIONS Nguyen Van Minh1*, Do Phuong Quynh1, Vo Ngoc Yen Nhi1, Duong Nhat Linh1, Nguyen Thi Ngoc Tinh2, Le Hong Phuoc2 ABSTRACT Currently, Bacillary Necrosis of Pangassius (BNP) in Tra catfish (Pangasianodon hypophthalmus) caused by bacteria Edwardsiella ictaluri brings about detrimental losses to catfish farming Many measures have been developed for prevention and treatment of BNP, among them biological control measure is being focused In this study, two strains of Bacillus subtilis (Q16, Q111) have showed strong inhibition toward E ictaluri using cross-streak and well-diffusion methods At the same time, trials on safety and protection capability assessment were conducted on Tra catfish larvae challenged with E ictaluri The results indicated both strains (Q16 and Q111) are safe for Tra catfish and have a good protection ability toward the host with RPS of 56.44% for B subtilis Q16, of 100% for B subtilis Q111 and 100% for B subtilis (Q16 + Q111) These results show that these two strains of B subtilis, that were isolated from Tra catfish ponds, can be potential probiotic strains that can be used in disease prevention for farmed Tra catfish Keywords: Biocontrol, Bacillus subtilis Q16, Bacillus subtilis Q111, Bacillary Necrosis Pangasius (BNP), Edwardsiella ictaluri Người phản biện: ThS Nguyễn Thị Hiền Ngày nhận bài: 29/5/2015 Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015 Ngày duyệt đăng: 07/8/2015 Falcuty of Biotechnology, Open University, HCMC *Email: nguyenminhou@gmail.com Research Institute of Aquaculture No.2 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THAÙNG 8/2015 55 ... 3.5 Khả bảo vệ cá tra giống Kết khảo sát bảng cho thấy mật độ E ictaluri 109 CFU/mL, cá tra chết 50% điều kiện gây nhiễm E ictaluri chủng sau cảm nhiễm Dựa vào kết LD50, vi khuẩn B subtilis (Q16. .. 50% - PD) Trong đó, PD = [(tỉ lệ cá nhiễm thấp 50 - 50%)×(tỉ lệ cá nhiễm thấp 50% - tỉ lệ cá nhiễm cao 50%)-1] 2.2.5 Đánh giá khả bảo vệ cá tra giống điều kiện gây nhiễm E ictaluri hai chủng vi... III KẾT QUẢ 3.1 Khả đối kháng E ictaluri chủng B subtilis (Q16, Q111) Hai chủng vi khuẩn B subtilis Q16 B subtilis Q111 thử khả đối kháng với E ictaluri gây bệnh cá tra Bằng phương pháp cấy vạch