Nghiên cứu tiến hành phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh từ đất trồng trọt ở huyện Quốc Oai, nhằm định hướng cho việc tìm kiếm các chất kháng sinh mới. Nghiên cứu đã phân lập được 89 chủng xạ khuẩn, chia làm 4 nhóm màu với tỷ lệ khác nhau: trắng (36,0%); xám (34,8%); vàng (18,0%) và nâu (11,2%).
TNU Journal of Science and Technology 226(05): 258 - 267 ISOLATION AND SELECTION OF ACTINOMYCETES STRAINS CAPABLE OF PRODUCING ANTIBIOTICS FROM A PLANTED LAND IN QUOC OAI DISTRICT, HANOI Nguyen Thi Ngoc Anh*, Nguyen Thi Phuong Thao, Nguyen Thanh Chung, Vu Kim Thoa, Ta Thi Thu Thuy Ha Noi Open University ARTICLE INFO ABSTRACT Received: 25/3/2021 In this study, we isolated and selected actinomycetes strains with antibiotic activity from cultivated soil in Quoc Oai district, to orient the search for new antibiotic compounds 89 strains of actinomycetes have been isolated, divided into color groups with different ratios: white (36.0%); gray (34.8%); yellow (18.0%) and brown (11.2%) In which, 44 strains inhibited Escherichia coli, 11 inhibited strains of Baccilus subtilis and were resistant to both types of microorganisms tested above The selection of strain CH8.1 has the strongest antibacterial activity against the two types of microorganisms mentioned above A survey on ISP2 medium showed that CH8.1 has the best growth at 28oC, neutral pH, NaCl concentration is 4% A survey on growth on ISP9 medium shows that CH8.1 is capable of using a variety of sugar sources such as: D- glucose, succrose, D-galactose, mantose, Dcellobiose, raffinose Based on the classification of the International Sterilizer Program (ISP), combined with the 16S rDNA sequence of strain CH8.1 is named Streptomyces manipurencis CH8.1 Revised: 29/4/2021 Published: 29/4/2021 KEYWORDS Actinomycetes Antibiotic Escherichia coli Baccilus subtilis Streptomyces manipurencis PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG SINH TỪ ĐẤT TRỒNG TRỌT TẠI HUYỆN QUỐC OAI, HÀ NỘI Nguyễn Thị Ngọc Anh*, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thành Chung, Vu Kim Thoa, Tạ Thị Thu Thủy Trường Đại học Mở Hà Nội THƠNG TIN BÀI BÁO TĨM TẮT Ngày nhận bài: 25/3/2021 Trong nghiên cứu này, tiến hành phân lập tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh từ đất trồng trọt huyện Quốc Oai, nhằm định hướng cho việc tìm kiếm chất kháng sinh Nghiên cứu phân lập 89 chủng xạ khuẩn, chia làm nhóm màu với tỷ lệ khác nhau: trắng (36,0%); xám (34,8%); vàng (18,0%) nâu (11,2%) Trong đó, có 44 chủng ức chế vi khuẩn Escherichia coli, 11 chủng ức chế vi khuẩn Baccilus subtilis chủng ức chế loài vi khuẩn kiểm định Tuyển chọn chủng CH8.1 có hoạt tính kháng lồi vi khuẩn kiểm định mạnh Khảo sát khả sinh trưởng mơi trường ISP2 cho thấy, chủng CH8.1 có khả sinh trưởng tốt 28oC, pH trung tính, nồng độ NaCl 4% Khảo sát khả sinh trưởng mơi trường ISP9 cho thấy, chủng CH8.1 có khả sử dụng đa dạng nguồn đường như: D- glucose, succrose, D-galactose, mantose, Dcellobiose, raffinose Căn vào phương pháp Chương trình xạ khuẩn Quốc tế (ISP), kết hợp với giải trình tự 16S rDNA, chủng CH8.1 đặt tên Streptomyces manipurencis CH8.1 Ngày hoàn thiện: 29/4/2021 Ngày đăng: 29/4/2021 TỪ KHÓA Xạ khuẩn Chất kháng sinh Escherichia coli Baccilus subtilis Streptomyces manipurencis * Corresponding author Email: ngocanhcnsh@hou.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn 258 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(05): 258 - 267 Giới thiệu Nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất sinh học, chất kháng sinh từ thực vật, vi sinh vật định hướng quan trọng nhiều nhóm nghiên cứu giới quan tâm thực Trong thực tế, hiệu điều trị nhiều nhóm kháng sinh ngày giảm tượng kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh ngày tăng [1] Nhiều công ty dược phẩm lớn, với nhiều nhà khoa học giới đặt mục tiêu nghiên cứu tạo kháng sinh hiệu hơn, bị kháng thuốc vi sinh vật, chủ yếu có nguồn gốc từ xạ khuẩn [2] Xạ khuẩn có đóng góp quan trọng với phát triển sản xuất kháng sinh, số lượng lớn loại thuốc kháng sinh sử dụng erythromycin, streptomycin, rifamycin gentamycin, sản phẩm phân lập từ xạ khuẩn đất [3] Trong đó, chất kháng sinh tổng hợp từ Streptomyces chiếm khoảng 80% tổng sản phẩm kháng sinh [4] Mặt khác, xạ khuẩn phân bố chủ yếu đất Số lượng xạ khuẩn đất không phụ thuộc vào loại đất mà phụ thuộc mức độ canh tác đất khả bao phủ thực vật Đất giàu chất dinh dưỡng hữu cơ, khoáng lớp đất bề mặt thường gặp số lượng xạ khuẩn lớn Sự phân bố xạ khuẩn cịn phụ thuộc nhiều vào độ pH mơi trường, chúng có nhiều lớp đất trung tính kiềm yếu axit yếu [5] Đất trồng trọt huyện Quốc Oai có lớp bề mặt tơi xốp, độ pH trung tính từ – 7.5, đất màu mỡ, có độ che phủ thực vật tương đối cao, thích hợp cho sinh trưởng phát triển xạ khuẩn Hiện nay, chưa có cơng trình nghiên cứu xạ khuẩn khu vực Bài báo nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh kháng sinh từ đất trồng trọt huyện Quốc Oai, Hà Nội Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Trong nghiên cứu sử dụng mẫu đất từ xã Nghĩa Hương, Đồng Quan, Ngọc Liệp, Thạch Thán, Ngọc Mỹ, Cấn Hữu huyện Quốc Oai, Hà Nội Các mẫu thu tầng mặt vị trí khác với đặc điểm sinh thái khác nhau, đánh giá đặc thù khu hệ thực vật đặc trưng bao gồm đất trồng hoa màu, đất trồng dược liệu, đất lâu ngày không canh tác Các chủng vi khuẩn sử dụng để thử hoạt tính sinh học gồm Escherichia coli JM109, Bacillus subtilis, Staphylococus aureus nhận từ sưu tập giống vi sinh vật Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội Các môi trường dùng để phân lập nghiên cứu hình thái xạ khuẩn bao gồm: Gause I (g/l): K2HPO4 0,5; MgSO4 0,5; KNO3 1; NaCl 0,5; FeSO4 0,01; tinh bột tan 20; agar 20 SAPEC – tinh bột tan (g/l): succrose 30; KH2PO4 1; NaNO3 2; KCl 0,5; MgSO4 0,5; FeSO4 0,01; tinh bột tan 10; agar 20 ISP1 (g/l): Tryptone 5; cao nấm men 3; agar 20; pH = ISP2 (g/l): Cao nấm men 4; dịch chiết malt 10; glucose 4; agar 20; pH= 7,3 ISP3 (g/l): Bột yến mạch 20; agar 20; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; pH= ISP4 (g/l): Tinh bột tan 10; K2HPO4 1; MgSO4.7H2O 1; NaCl 1; (NH4)2SO4 2; CaCO3 2; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; agar 20; pH = 7,5 ISP5 (g/l): Lasparagine 1; glycerin 10; K2HPO4; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; agar 20; pH= 7,0 ISP6 (g/l): Petone 10; cao nấm men 1; sắt amoni xitrat 0,5; agar 20; pH = 7,0 ISP7 (g/l): Glycerine 15; L- tyrosine 0,5; L- asparagine 1; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; NaCl 0,5; FeSO4.7H2O 0,01; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; agar 20; pH= 7,0 R2YE (g/l): Sucrose 10,3; K2SO4 0,025; MgCl2.6H2O 1,012; glucose 1,0; cao nấm men 0,5; dung dịch khoáng: KH2PO4 1,0 ml; TES 10,0 ml; CaCl2.2H2O 8,0 ml; dung dịch muối vi lượng 0,2 ml; L-proline 1,5 ml; NaOH 0,5 ml 100 ml nước cất chuẩn pH 7,2 NDYE (g/l): Cao nấm men 0,5; NaNO3 0,428; maltose 1,5; glucose 2,5; HEPES 0,477; MgSO4.7H2O 0,012; K2PO4 0,023; dung dịch khoáng: dung dịch muối vi lượng 200 μl; NaOH 1,0 ml 100 ml nước cất Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định môi trường LB (g/l): Triptone 1; cao nấm men 0,5; NaCl 1; agar 10 http://jst.tnu.edu.vn 259 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(05): 258 - 267 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập xạ khuẩn Mẫu đất mang phòng thí nghiệm, tiến hành phơi khơ ngày điều kiện tự nhiên Sau đó, nhặt bỏ sỏi, đá, xác hữu đem mẫu nghiền cối thủy tinh tiến hành sàng qua rây có đường kính mm Mẫu đất nghiền xong đựng túi nhựa PE kín bảo quản tủ đơng -20OC Phân lập theo phương pháp Vinogradkii (1952): pha loãng mẫu đất đến 10-3, dùng pipet hút 0,1 ml dung dịch huyền phù pha loãng 10-3 nhỏ lên bề mặt mơi trường thạch đĩa peptri có mơi trường phân lập đặc hiệu (Guase I, SAPEC- tinh bột tan, ISP-2, ISP4), sau dùng que trang dàn giọt dịch bề mặt mơi trường thạch, sau nuôi cấy xạ khuẩn nhiệt độ 28 – 30OC, từ 7-14 ngày tiến hành quan sát phân loại khuẩn lạc xạ khuẩn với khuẩn lạc loại vi sinh vật khác [6] 2.2.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phân lập Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh phương pháp cấy chấm điểm (Crawford, 1993): Dùng que cấy vô trungfcaays khuẩn lạc tinh lên đĩa thạch LB 1% agar cấy vi khuẩn kiểm định Các đĩa ni 28OC 48h sau đọc kết dựa vào đường kính vịng vơ khuẩn Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa thạch theo Dhanasekaran đtg (2012) để khảo sát khả kháng khuẩn: Xạ khuẩn nuôi cấy môi trường ISP2 lỏng, ni lắc 150 vịng/phút, 28OC Dịch xạ khuẩn thu sau ngày nuôi cấy được tra vào lỗ thạch đĩa peptri chứa môi trường LB 1% argar phủ vi sinh vật kiểm định Dịch xạ khuẩn có khả ức chế vi sinh vật kiểm định thể qua vòng sáng xuất quanh giếng thạch sau 18 - 24 2.2.3 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn tuyển chọn Đặc điểm hình thái: Được xác định dựa đặc điểm nuôi cấy bao gồm: màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), màu sắc khuẩn ty chất (KTCC), khả hình thành sắc tố tan [7] hình thành sắc tố melanin Chuỗi bào tử bề mặt bào tử nhuộm Gram quan sát kính hiển vi điện tử sau - 14 ngày nuôi cấy [8], [9] Đặc điểm sinh hóa: Quan sát khả đồng hóa nguồn cacbon nitơ xạ khuẩn mơi trường ISP9 (g/l: (NH4)2SO4 2,64; KH2PO4 2,38; K2HPO4 3H2O 5,65; MgSO4 7H2O 1,0; dung dịch B 1,0 ml; agar 20; pH = 7,0) có bổ sung 1,0% nguồn cacbon 0,1% nguồn nitơ tương ứng [8], [9] Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh trưởng xạ khuẩn, với yếu tố: nhiệt độ (20; 24; 28; 32; 36; 40OC), pH ban đầu (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 10) nồng độ NaCl (từ - 10%) môi trường ISP2 [9] 2.2.4 Phân loại dựa phân tích trình tự gen 16S rDNA Xạ khuẩn nuôi cấy môi trường R2YE lỏng, sau 72 tiến hành ly tâm 4000 vòng/phút 4OC 10 phút để thu tế bào DNA tổng số xạ khuẩn tách theo phương pháp Sambrook Rusell (2001) [10] gen 16S rDNA khuếch đại nhờ phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 27F 5’- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG - 3’ 1492R 5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT - 3’ (Genset) Phản ứng thực với chu trình nhiệt là: 94OC: phút, 25 chu kỳ ( 94OC: 30s, 55OC: 30s, 72OC: 60s), 72OC: 10 phút Sản phẩm phản ứng kiểm tra chạy điện di gel agarose 1% Kích thước đoạn DNA thu sau khuếch đại so sánh thang DNA chuẩn (1Kb Plus DNA labder Marker) Sản phẩm PCR tinh gửi giải trình tự Apical Scientific Sequencing, Malaysia So sánh trình tự gen tương ứng sở liệu Genbank nhờ công cụ BLAST http://jst.tnu.edu.vn 260 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(05): 258 - 267 (www.ncbi.nih.gov) Mức độ tương đồng di truyền chủng xây dựng dựa phần mềm Bioedit MegaX 2.2.5 Xác định hoạt tính kháng sinh Chủng xạ khuẩn tuyển chọn nuôi môi trường R2YE lỏng điều kiện 28OC, tốc độ lắc 150 vịng/phút, ngày sau ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút để thu dịch lên men Dịch lên men lắc với dung môi hữu ethyl acetate với tỷ lệ 1:1 nhiệt độ phịng, sau thu kháng sinh tan ethyl acetate quay cô thu nhận kháng sinh thô Nhỏ kháng sinh thô vào mảnh giấy lọc thử hoạt tính với vi khuẩn kiểm định Sau 18 kiểm tra vòng kháng khuẩn Kết thảo luận 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn Từ mẫu đất phân lập từ xã huyện Quốc Oai, nhóm nghiên cứu tiến hành phân lập môi trường đặc hiệu thu 89 chủng xạ khuẩn với đặc điểm hình thái màu sắc khuẩn lạc khác Các chủng sau phân lập, bước đầu phân nhóm dựa vào màu sắc hệ sợi khí sinh xác định dựa bảng màu Tresner Buckus, chia chủng xạ khuẩn thành nhóm màu khác [8], [11] Trong số 89 chủng xạ khuẩn phân lập có nhóm màu xuất với số lượng tỷ lệ khác nhau: nhóm 1: KTKS có màu trắng, có 32 chủng (36,0%); nhóm 2: KTKS màu xám, có 31 chủng (34,8%); Nhóm 3: KTKS màu vàng, có 16 chủng (18,0%); Nhóm 4: KTKS màu nâu, có 10 chủng (11,2%) 3.2 Khảo sát khả kháng vi khuẩn kiểm định từ chủng xạ khuẩn phân lập Sau phân lập làm 89 chủng xạ khuẩn, để tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn, nhóm nghiên cứu tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Hình 1) Kết có 46/89 chủng sinh kháng sinh mức độ khác nhau, kí hiệu theo quy ước: chữ đầu viết tắt tên xã (NH: Nghĩa Hương, DQ: Đồng Quang, CH: Cấn Hữu, NM: Ngọc Mỹ, NL: Ngọc Liệp, TT: Thạch Thán), số thứ tự chủng phân lập Trong đó, có 44 chủng kháng vi khuẩn Gram (+), 11 chủng kháng vi khuẩn Gram (-) chủng CH 8.1, CH 8.4, CH 8.7, CH 9.4, CH 9.5, CH 9.7, NM 3.2, TT 8.2, TT 8.4 có hoạt tính kháng hai loại VSV Gram (+) Gram (-) chọn để thực bước (Bảng 1) Bảng Khả kháng vi khuẩn kiểm định chủng xạ khuẩn phân lập STT 10 11 12 13 14 15 Chủng xạ khuẩn NH 1.1 DQ 2.1 DQ 2.2 DQ 2.3 DQ 2.4 DQ 3.1 DQ 3.2 CH 8.1 CH 8.2 CH 8.3 CH 8.4 CH 8.5 CH 8.6 CH 8.7 CH 8.8 Đường kính vịng kháng khuẩn (D-d, mm) B subtilis (G+) E coli (G-) 10 20 25 31 27 21 10 20 10 - http://jst.tnu.edu.vn STT 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 261 Chủng xạ khuẩn CH 9.8 CH 9.9 NM 1.1 NM 1.2 NM 2.1 NM 3.1 NM 3.2 NM 3.3 NM 3.4 NM 3.5 NM 3.6 NL 4.1 NL 4.2 TT 7.1 TT 7.2 Đường kính vịng kháng khuẩn (D-d, mm) B subtilis (G+) E coli (G-) 21 10 12 12 13 8 16 14 15 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology STT 16 17 18 19 20 21 22 23 Chủng xạ khuẩn CH 8.9 CH 9.1 CH 9.2 CH 9.3 CH 9.4 CH 9.5 CH 9.6 CH 9.7 Đường kính vịng kháng khuẩn (D-d, mm) B subtilis (G+) E coli (G-) 15 35 20 15 13 26 12 STT 39 40 41 42 43 44 45 46 226(05): 258 - 267 Chủng xạ khuẩn TT 8.1 TT 8.2 TT 8.3 TT 8.4 TT 8.5 TT 8.6 TT 9.1 TT 9.2 Đường kính vịng kháng khuẩn (D-d, mm) B subtilis (G+) E coli (G-) 24 20 12 22 18 13 10 - Các chủng xạ khuẩn phân lập có khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn thu từ mẫu đất xã khác có tỷ lệ khác biểu thị bảng Bảng Số lượng chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp hoạt chất kháng khuẩn địa điểm lấy mẫu Địa điểm Loại đất Đất cát pha Đất sét pha cát Đất cát pha Đất sét pha cát Đất thịt Đất thịt Cấn Hữu Ngọc Mỹ Thạch Thán Đồng Quang Ngọc Liệp Nghĩa Hương Đặc điểm nơi lấy mẫu Độ ẩm pH Thảm thực vật 50% 6,5-7,0 Trồng rau, dược liệu 60% 6.0 Trồng rau 50% 6,5÷7,0 Trồng rau, dược liệu 65% 6,0 Trồng lúa 45% 7,0 Trồng lúa 45% 7,5 Bỏ hoang Số chủng 19 10 Tỷ lệ (%) 41,3 21,7 19,6 10,9 4,3 2,2 Số lượng 103CFU/1g 150 97 115 80 45 40 Như vậy, mẫu đất thu từ xã Cấn Hữu, Ngọc Mỹ, Thạch Thán đất trồng rau, trồng dược liệu, nhiều dinh dưỡng, độ ẩm phù hợp, độ pH trung tính nên có số lượng xạ khuẩn có khả kháng khuẩn nhiều (82,6%) Còn mẫu đất thu từ xã Đồng Quang Ngọc Liệp cho số lượng xạ khuẩn có khả kháng khuẩn thấp (15,2%) Số lượng xạ khuẩn phân lập từ xã Nghĩa Hương thấp (1 chủng chiếm 2,2%) mẫu đất thu từ đất bỏ hoang, chất dinh dưỡng, độ pH khơng thích hợp, độ ẩm thấp nên xạ khuẩn phát triển Kết phù hợp với nghiên cứu trước phân bố xạ khuẩn mơi trường đất [5] Mặt khác, 46 chủng phân lập có khả kháng khuẩn có chủng có khả kháng loại vi sinh vật kiểm định phân lập từ mẫu đất trồng dược liệu (Bảng 1) Điều bước đầu chứng tỏ mối quan hệ thảm thực vật đến phân bố xạ khuẩn Chọn lọc chủng CH 8.1 có khả kháng loại vi sinh vật kiểm định mạnh 31 mm vi khuẩn B subtilis 27 mm vi khuẩn E coli JM109 để làm nghiên cứu a c b Hình Hoạt tính kháng khuẩn số chủng phân lập a,c Với B subtilis; b,d Với E.coli JM109 d 3.3 Một số đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn tuyển chọn 3.3.1 Đặc điểm hình thái Màu sắc số chủng xạ khuẩn nuôi cấy môi trường ISP thường khác nhau, yếu tố để phân loại xạ khuẩn theo khóa định tên lồi xạ khuẩn ISP Nonomura [12] http://jst.tnu.edu.vn 262 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(05): 258 - 267 khóa phân loại Bergey [9] Khuẩn ty khí sinh khuẩn ty chất chủng xạ khuẩn CH8.1 so sánh với bảng màu Tresner Backus [11], với khả hình thành sắc tố tan hình thành sắc tố melanin yếu tố phân loại xạ khuẩn Bảng Đặc điểm hình thái xạ khuẩn CH8.1 môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi Màu sắc khuẩn ty Sắc tố cấy KTKS KTCC Sắc tố tan Sắc tố melanin ISP1 Trắng Vàng nhạt Vàng nhạt ISP2 Xám Vàng Vàng nhạt ISP3 Xám Trắng ISP4 Xám Vàng Vàng nhạt ISP5 Xám Vàng ISP6 Xám Vàng R2YE Xám Vàng đậm Vàng nhạt NDYE Xám Vàng đậm Vàng nhạt - Như chủng xạ khuẩn CH8.1 phát triển tốt môi trường ISP1 đến ISP6 môi trường R2YE NDYE Trên mơi trường ISP, thời gian hình thành bào tử chủng xạ khuẩn CH8.1 trung bình đến ngày; cịn mơi trường R2YE NDYE, chủng xạ khuẩn có thời gian sinh bào tử dài ngày Trên môi trường ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, R2YE NDYE, khuẩn ty khí sinh chủng xạ khuẩn CH8.1 có màu xám, màu trắng mơi trường ISP1 Chủng CH8.1 có khuẩn ty chất có màu vàng đến vàng sậm tất mơi trường thử nghiệm Chúng hình thành sắc tố tan môi trường ISP1, ISP2, ISP4, R2YE, NDYE không hình thành sắc tố melanin (Bảng 3, hình 2) a c e b d f Hình Màu sác KTCC KTKS chủng xạ khuẩn CH8.1 số môi trường nuôi cấy a.Trên ISP1; b Trên ISP3; c,d Trên ISP2; e,f Trên R2YE a b Hình Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn CH8.1 mơi trường ISP2 a.Khuẩn ty xạ khuẩn quan sát kính hiển vi 1000X; b Khuẩn lạc xạ khuẩn sau ngày nuôi cấy http://jst.tnu.edu.vn 263 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(05): 258 - 267 Chủng xạ khuẩn CH8.1 sau ngày nuôi cấy môi trường ISP2 lỏng, nhuộm Gram quan sát kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 1000X, cho thấy khuẩn ty dài, khơng đứt đoạn, từ sợi phân nhiều sợi nhánh, sợi mang bào tử cong (RF) bắt màu tím với thuốc nhuộm Gram (Hình 3) Chủng CH8.1 sau pha loãng 10-3 cấy môi trường ISP2 sau ngày nuôi cấy cho khuẩn kích thước khoảng - mm, có màu vàng nhạt, bề mặt lồi, có rãnh thẳng 3.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Khả đồng hóa nguồn cacbon nitơ khác đặc điểm sinh lý, sinh hóa quan trọng xạ khuẩn theo Nomomura ISP (1974) [12] Nuôi cấy chủng xạ khuẩn CH8.1 mơi trường ISP9 có bổ sung nguồn đường nguồn nitơ khác Kết cho thấy, chủng CH8.1 có khả đồng hóa đa dạng nguồn đường khác nhau, đặc biệt khả đồng hóa cao với glucose, maltose, galactose; đồng hóa với succrose, rafinose, cellulose; đồng hóa khơng đồng hóa lactose, mannitol, xylose; khơng có khả sinh trưởng môi trường không cung cấp nguồn cacbon (Bảng 4) Chủng CH8.1 có khả sử dụng đa số nguồn nitơ kiểm nghiệm như: L-asparagine, L-tyrosine, glycerine, tryptone, peptone, (NH4)2SO4 NH4NO3 (Bảng 4); không sinh trưởng môi trường không cung cấp nguồn nitơ Quá trình sinh trưởng, phát triển trao đổi chất vi sinh vật chịu ảnh hưởng mạnh mẽ yếu tố môi trường Chủng xạ khuẩn CH8.1 nuôi cấy môi trường ISP2 với điều kiện nhiệt độ, pH nồng độ NaCl khác Kết cho thấy, chủng xạ khuẩn sinh trưởng điều kiện nhiệt độ từ 26 - 36oC tốt 28oC; pH từ 6-10 tốt pH = 7,5; nồng độ NaCl từ - 5% tốt 4% Kết hoàn toàn phù hợp với Sirisha cộng (2013) [13] đa số chủng xạ khuẩn sinh trưởng mơi trường có nồng độ muối 10% Bảng Khả đồng hóa nguồn cacbon nitơ chủng xạ khuẩn CH8.1 Nguồn cacbon Khả sinh Nguồn nitơ (1,0%, w/v) trưởng (1,0%, w/v) D- Glucose + L- asparagin Succrose + L- tyrosin Mantose + Glycerin Lactose +/Tryptone D- mannitol +/Peptone D- galactose + (NH4)2SO4 D- xylose +/NH4NO3 D- cellobiose + Raffinose + Khơng có carbon Khơng có nitrogen Nhiệt độ thích hợp 28oC pH thích hợp 7,5 Nồng độ NaCl thích hợp 4% Ghi chú: (+): có khả năng; (-) khơng có khả năng; (+/-): không Khả sinh trưởng + + + + + + + - 3.4 Xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ khuẩn CH8.1 Chủng xạ khuẩn CH8.1 sau nuôi cấy 96 môi trường R2YE đem ly tâm thu tế bào Tế bào xạ khuẩn dùng để tách DNA tổng số theo phương pháp Sambrook Rusell [10] DNA tổng số xạ khuẩn hòa tan nước deion chạy điện di kiểm tra gel agarose 1% cho kết với băng DNA đậm đường chạy có kích thước 10 kb (Hình 4) Dùng DNA tổng số xạ khuẩn để làm khuôn cho phản ứng PCR đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR chạy điện di kiểm tra cho kết băng DNA có kích thước tương ứng khoảng 1,4 kb tương ứng với kết mong muốn thiết kế mồi (Hình http://jst.tnu.edu.vn 264 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(05): 258 - 267 5) Tinh đoạn 16S rDNA sau gửi giải trình tự xếp trình tự nucleotide gen phần mềm Bioedit, cho kết hình Hình Điện di sản phẩm DNA tổng số chủng xạ khuẩn CH8.1 Hình Điện di sản phẩm PCR 16S rDNA chủng xạ khuẩn CH8.1 Trình tự gen 16S rDNA chủng xạ khuẩn CH8.1 đưa lên phần mềm BLAST so sánh với trình tự gen cơng bố Genbank (NCBI), cho thấy có độ tương đồng cao (100%) với gen tương ứng chủng Streptomyces manipurensis Sắp xếp trình tự 16S chủng xạ khuẩn XH8.1 chủng xạ khuẩn có độ tương đồng cao Genbank phần mềm Bioedit xây dựng phát sinh chủng loại phần mềm MegaX, cho kết hình Chủng xạ khuẩn CH8.1 có quan hệ họ hàng gần gũi với chủng thuộc loài S manipurensis Kết hợp với kết so sánh đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa theo khóa phân loại ISP (Nomomura, 1974) [12] Bergey [8], chủng xạ khuẩn đặt tên Streptomyces manipurensis CH8.1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16SrDNA CH8.1 AGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACCACTCCTGTCCGCATGGGCAGGGGTTG 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16SrDNA CH8.1 AAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTG 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16SrDNA CH8.1 GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTG 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16SrDNA CH8.1 TAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGG 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16SrDNA CH8.1 AATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGAGGCTTAACCTCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGA 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16SrDNA CH8.1 GATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAG 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16SrDNA CH8.1 CGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGG 780 790 800 810 820 830 840 850 860 870 880 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16SrDNA CH8.1 GGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACA 890 900 910 920 930 940 950 960 970 980 990 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16SrDNA CH8.1 TATACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16SrDNA CH8.1 CAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCC 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 1210 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16SrDNA CH8.1 TTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAAC 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 1310 1320 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16SrDNA CH8.1 TCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACAC 1330 1340 1350 | | | | | | 16SrDNA CH8.1 CCGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGAGGGAG Hình Trình tự nucleotide gen 16S rDNA chủng xạ khuẩn CH8.1 sử dụng phần mềm Bioedit http://jst.tnu.edu.vn 265 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(05): 258 - 267 Streptomyces Streptomycesmanipurensis manipurensisS3A-09 S3A-0916S 16Sribosomal ribosomalRNA RNAgene geneMG719971.1:35-1387 MG719971.1:35-1387 Streptomyces Streptomycesmanipurensis manipurensisS3A-05 S3A-0516S 16Sribosomal ribosomalRNA RNAgene geneMG721543.1:34-1387 MG721543.1:34-1387 Streptomyces Streptomycesflavotricini flavotricinisubsp subsp.gene genefor for16S 16Sribosomal ribosomalRNA RNAAB862316.1:74-1426 AB862316.1:74-1426 Streptomyces Streptomycesmanipurensis manipurensisWJA2 WJA216S 16Sribosomal ribosomalRNA RNAgene geneKU877574.1:57-1409 KU877574.1:57-1409 16SrDNA 16SrDNACH8.1 CH8.1 Streptomyces Streptomycesmanipurensis manipurensisMBRL MBRL201 20116S 16Sribosomal ribosomalRNA RNANR NR118275.1:87-1438 118275.1:87-1438 Streptomyces Streptomycesmanipurensis manipurensisWJA3 WJA316S 16Sribosomal ribosomalRNA RNAgene geneKU877575.1:57-1409 KU877575.1:57-1409 Streptomyces Streptomycessp sp.X54 X5416S 16Sribosomal ribosomalRNA RNAgene geneKM078926.1:46-1398 KM078926.1:46-1398 Streptomyces Streptomycesmanipurensis manipurensisHME8691 HME869116S 16Sribosomal ribosomalRNA RNAgene geneKC157051.1:82-1434 KC157051.1:82-1434 Streptomyces Streptomycesvirginiae virginiaexsd08100 xsd0810016S 16Sribosomal ribosomalRNA RNAgene geneFJ481057.1:58-1411 FJ481057.1:58-1411 Streptomycetaceae Streptomycetaceaebacterium bacteriumAtecer2R Atecer2R16S 16Sribosomal ribosomalRNA RNAgene geneMT386128.1:35-1387 MT386128.1:35-1387 Streptomyces Streptomycessp sp.Mg66 Mg6616S 16Sribosomal ribosomalRNA RNAgene geneMN187455.1:64-1416 MN187455.1:64-1416 Hình Cây phát sinh loài chủng xạ khuẩn CH8.1 dựa trình tự gen 16S rDNA 3.5 Đánh giá hoạt tính kháng sinh thô tổng hợp từ chủng xạ khuẩn CH8.1 Chủng xạ khuẩn CH8.1 lên men môi trường R2YE sau tách chiết thu nhận kháng sinh thơ Kháng sinh thơ sau hịa tan methanol bảo quản -20oC Thử hoạt tính kháng sinh thơ phương pháp khoanh giấy lọc mơi trường có chứa loại vi sinh vật kiểm định, cho kết đường kính vịng kháng khuẩn với S aureus 30 mm, với E coli JM109 25 mm B subtilis 27 mm a b c Hình Kết thử hoạt tính kháng khuẩn kháng sinh thô vi khuẩn kiểm định a Vi khuẩn S aureus; b Vi khuẩn E.coli JM109; c Vi khuẩn B subtilis Kết luận Đã tuyển chọn chủng CH8.1 có khả ức chế loại vi sinh vật kiểm định cao Căn vào kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa phân tích trình tự gen 16S rDNA, chủng xạ khuẩn CH8.1 phân lập từ đất trồng trọt huyện Quốc Oai, Hà Nội đặt tên Streptomyces manipurensis CH8.1 Chủng có khả đồng hóa đa dạng nguồn cacbon, nguồn nitơ thử nghiệm sinh trưởng tốt 28OC, pH trung tính, nồng độ NaCl 4% Chủng Streptomyces manipurencis CH8.1 có khả kháng khuẩn mạnh với loài vi khuẩn kiểm định với đường kính vịng kháng khuẩn 30 mm (S aureus), 27 mm (B subtilis) 25 mm (E.coli JM109) TÀI LIỆU THAM KHẢO/ REFERENCES [1] G V Doern, M A Pfaller, and M E Erwin, “The prevalence of fluoroquinolone resistance among clinically significant respiratory tract isolates of Streptococcus pneumoniae in the United States and Canada—1997 results from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program,” Diagn Microbiol Infec Dis., vol 32, pp 313-316, 1998 http://jst.tnu.edu.vn 266 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(05): 258 - 267 [2] P Kekuda, K S Shobha, and R Onkarappa, “Fascinating diversity and potent biological activities of actinomycete metabolites,” Pharm Res., vol 3, pp 250-256, 2010 [3] D A Hopwood, “Cracking the Polyketide Code,” PloS Biology, vol 2, no 2, 2004, Art no e35 [4] D Dhanasekaran, N Thajuddin, and A Panneerselvam, Applications of Actinobacterial Fungicides in Agriculture and Medicine, Fungicides for Plant and Animal Diseases, 2012, pp 1-27 [5] X T Nguyen, D Nguyen, H Hoang, and T H Vu, Soil biology curriculum Vietnam Education Publishing House (in Vietnamese), 2007 [6] T D Nguyen, Microbial biology Vietnam Education Publishing House (in Vietnamese), 2000 [7] N Tariq, “Antimicrobial activity of Cinnamomum cassia against diverse microbial flora with its nutrional and medicinal impacts,” Pak J Bot, vol 38, pp 169-174, 2006 [8] E Shirling and G D Gottlieb, “Methods for characterization of Streptomyces species,” Int J Syst Bacteriol, vol 16, pp 313-340, 1966 [9] T Stanley, M G Williams, and J G Sharpe, “Bergey’s manual of systematic bacteriology,” Williams and Wilkins, vol 4, pp 2452-2492, 1989 [10] J Sambrook and D Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001 [11] H D Trerner and E J Buckus, “System of color wheels for Streptomyces taxonomy,” Appl Microbiol., vol 11, pp 335-338, 1963 [12] H Nonomura, “Key for classification and identification of species of rare actinomycetes isolated from soils in Japan,” Hakku Kogaku Zasshi, vol 52, pp 71-77, 1974 [13] B Sirisha, R Harith, J Mohan, K Siva, K S Kumar, and T Ramana, “Bioactive compounds from marine actinomycetes isolated from the sediments of bay of Bengal,” IJPCBS, vol 3, no 2, pp 257-264, 2013 http://jst.tnu.edu.vn 267 Email: jst@tnu.edu.vn ... nâu, có 10 chủng (11,2%) 3.2 Khảo sát khả kháng vi khuẩn kiểm định từ chủng xạ khuẩn phân lập Sau phân lập làm 89 chủng xạ khuẩn, để tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn, ... sinh trưởng phát triển xạ khuẩn Hiện nay, chưa có cơng trình nghiên cứu xạ khuẩn khu vực Bài báo nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh kháng sinh từ đất trồng trọt huyện Quốc. .. Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn Từ mẫu đất phân lập từ xã huyện Quốc Oai, nhóm nghiên cứu tiến hành phân lập môi trường đặc hiệu thu 89 chủng xạ khuẩn với đặc điểm hình thái màu sắc khuẩn