Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose 20 1 2017

Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose tại các bãi rác tỉnh tiền giang Một trong những thành phần chủ yếu hiện diện trong phần lớn nguồn rác thải là Cellulose. Cellulose thường có mặt ở các dạng như: phụ phẩm nông nghiệp (rơm, rạ, lá cây, vỏ lạc, vỏ trấu, vỏ thân ngô, xác các loại cây lương thực,…), phụ phế phẩm công nghiệp thực phẩm (vỏ và xơ quả, bã mía, bã cà phê, bã sắn, hạt sơ ri,…), phụ phế phẩm trong công nghiệp chế biến gỗ (rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn, vỏ cây,…) và các chất thải gia đình (vải, giấy vụn, các loại thùng giấy,…).

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KHOA HỌC CÂY TRỒNG

ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY

CELLULOSE TỪ RÁC THẢI HỮU CƠ

Tiền Giang, tháng 12 năm 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KHOA HỌC CÂY TRỒNG

ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY

CELLULOSE TỪ RÁC THẢI HỮU CƠ

Tiền Giang, tháng 12 năm 2016

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

VÕ THỊ NGỌC BÍCH

SINH VIÊN THỰC HIỆN

ĐẶNG THỊ MỸ DUYÊN MSSV: 013142089

NGUYỄN DUY PHƯƠNG MSSV: 013142049

LỚP DHCNSH13

MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ KHÓA LUẬN ………

………

………

………

………

………

………

………

………

Tiền Giang, ngày tháng năm 2017

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về vấn đề môi trường 3

2.2 Sơ lược về các biện pháp xử lý rác thải 3

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 4

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 4

2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 5

2.4 Giới thiệu về cellulose 6

2.5 Tổng quan về phức hệ enzyme cellulase 7

2.6 Một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose 8

2.6.1 Vi khuẩn Bacillus sp 8

2.6.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp 9

2.6.3 Vi khuẩn Cellulomonas sp 10

2.6.4 Vi khuẩn Cytophara 11

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1.Phương tiện 12

3.1.1.Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose 12

3.1.2 Giả thuyết nghiên cứu 12

3.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 12

3.1.4 Vật liệu và hóa chất 12

3.2 Phương pháp nghiên cứu 13

3.2.1.Thí nghiệm 1: Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose. .13

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh phức hệ enzyme cellulase cao 15 3.2.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian nuôi ủ và pH môi trường ảnh hưởng đến khả năng phân hủy cellulose của vi khuẩn 16 3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng phân hủy giấy photocopy của các dòng vi khuẩn 17 3.2.5 Thí nghiệm 5: Nhận diện một số chủng vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự 17

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ DỰ KIẾN 18TÀI LIỆU THAM KHẢO 20

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subitilis 9

Hình 2.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp 10

Hình 2.3 Vi khuẩn Cellumonas sp 10

Hình 2.4 Vi khuẩn Cytophaga sp 11

Hình 3.1 Quy trình phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose 12

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn (Han và Srinivasan, 1968) 13

Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU1.1 Đặt vấn đề

Ô nhiễm môi trường đã và đang trở thành một trong những vấn đềcấp thiết và được quan tâm hàng đầu trên toàn thế giới nói chung và ViệtNam nói riêng Hằng ngày, một lượng lớn rác thải từ các nhà máy rác thải,

xí nghiệp, nông nghiệp, sinh hoạt gia đình không ngừng thải ra môi trường.Đến năm 2015 Việt Nam thải ra hơn 40 triệu tấn rác thải (Bộ Tài Nguyên vàMôi trường) Rác thải là một trong những nguyên nhân chính gây ra biếnđổi khí hậu, dịch bệnh, thủng tầng ozon… và đặc biệt ảnh hưởng trực tiếpđến nền kinh tế nước nhà và đời sống xã hội

Một trong những thành phần chủ yếu hiện diện trong phần lớnnguồn rác thải là Cellulose Cellulose thường có mặt ở các dạng như: phụphẩm nông nghiệp (rơm, rạ, lá cây, vỏ lạc, vỏ trấu, vỏ thân ngô, xác các loạicây lương thực,…), phụ phế phẩm công nghiệp thực phẩm (vỏ và xơ quả, bãmía, bã cà phê, bã sắn, hạt sơ ri,…), phụ phế phẩm trong công nghiệp chếbiến gỗ (rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn, vỏ cây,…) và các chất thải gia đình (vải,giấy vụn, các loại thùng giấy,…)

Cellulose là một hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kếtcác mắt xích -D- Glucose, thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thựcvật, khó phân hủy, việc xử lý cellulose từ rác thải hữu cơ gặp nhiều khókhăn Các nhà khoa học đã và đang không ngừng tìm cách xử lý tối ưulượng cellulose bằng các biên pháp vật lý, hóa học, sinh học nhằm giảmthiểu ô nhiễm môi trường

Hiện nay, để xử lý rác thải hữu cơ dùng nhiều phương pháp: chônlấp, ủ phân compost, đổ đống tự nhiên… Những phương pháp này cònnhiều hạn chế và tốn thời gian, không đạt hiệu quả cao

Vì thế việc xử lý cellulose bằng biện pháp sinh học đang đượcquan tâm và nghiên cứu nhiều nhất, phương pháp này sử dụng các vi sinhvật và các hệ enzyme trong vai trò là chất phân hủy rác thải thành các hợpchất đơn giản, ít độc hại, dễ xử lý, an toàn hơn Đồng thời có thể ứng dụngcác vi sinh vật để sản xuất phân bón hữu co Xuất phát từ thực tế này, chúngGVHD: Võ Th Ng c Bích ị Ngọc Bích ọc Bích Trang 1

Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang

tôi thực hiện đề tài “ Phân lập và tuyển chọn 1 số chủng vi khuẩn có khảnăng phân hủy cellulose từ rác thải hữu cơ”

Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về vấn đề môi trường

Một vấn đề nóng bỏng trên toàn thể giới hiện nay là tình trạng ônhiễm môi trường sinh thái Nguyên nhân chính là do các hoạt động sản xuất

và sinh hoạt của con người gây ra Ô nhiễm môi trường ngày càng trầmtrọng, đe dọa trực tiếp đến sự phát triển kinh tế - xã hội, sự tồn tại của cácthế hệ hiện tại và tương lai Đối tượng gây ô nhiễm môi trường chủ yếu làcác hoạt động sản xuất của nhà máy trong các khu công nghiệp, hoạt độnglàng nghề và sinh hoạt tại các đô thị lớn

Tại thành phố Hà Nội, khối lượng rác sinh hoạt tăng trung bình15% một năm, tổng lượng rác thải ra ngoài môi trường lên tới 5.000tấn/ngày Thành phố Hồ Chí Minh mỗi ngày có trên 7.000 tấn rác thải sinhhoạt, mỗi năm cần tới 235 tỉ đồng để xử lý

Ô nhiễm môi trường bao gồm 3 loại chính là: ô nhiễm đất, ô nhiễmnước và ô nhiễm không khí Giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trongthời kỳ đẩy mạnh công nghiệp hóa - hiện đại hóa hiện nay không chỉ đòi hỏi

sự cấp thiết đối với các cấp quản lý, các doanh nghiệp mà đó còn là tráchnhiệm của cả hệ thống chính trị và toàn xã hội

Để bảo vệ môi trường thoát khỏi các hiểm họa: thủng tầng ôzon,hiệu ứng nhà kính, ô nhiễm nguồn nước sạch, không khí, đất đai,…conngười cần phải nâng cao nhận thức gìn giữ vệ sinh môi trường và hiểu rõ vaitrò, vị trí của mình và xã hội trong hệ thống tự nhiên con người- xã hội Xâydựng ý thức và phát triển mọi phương pháp vật lý, hóa học, sinh học để xử

lý rác thải, nước thải môi trường Đồng thời kết hợp việc sử dụng, bảo vệcùng với việc tái chế nguồn tài nguyên thiên nhiên

2.2 Sơ lược về các biện pháp xử lý rác thải

Rác là hiểm họa của môi trường, nhưng rác cũng là vàng nếuchúng ta biết tận dụng, khai thác và tái sử dụng Trên thực tế, nhiều công tytrên thế giới đã và đang thu được những khoản lợi nhuận khổng lồ từ rác.Các nhà nghiên cứu khoa học hiện nay cũng như các trung tâm bảo vệ môitrường đã và đang không ngừng tìm hiểu, đưa ra các biện pháp xử lý và táiGVHD: Võ Th Ng c Bích ị Ngọc Bích ọc Bích Trang 3

Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang

chế nguồn rác thải một cách có hiệu quả nhất dựa trên cơ sở thực tế Tất cảứng dụng trong sinh học, hóa học, vật lý đến các kỹ thuật máy móc thô sơhay hiện đại đều được sử dụng để xử lý rác thải, bảo vệ môi trường xanhsạch đẹp

Tại Việt Nam, từ việc xử lý rác bằng biện pháp đơn giản là chônlấp rác, ủ thành phân trộn đến những biện pháp khoa học: lên men phụ phẩmrác thải thành cồn, tạo sinh khối nấm men… Những loại rác hữu cơ cũngđược sử dụng làm phân bón Các loại rác như nylon, bìa giấy, chai nhựa,…

sẽ được tái chế để dùng làm nguyên liệu Còn các loại rác vô cơ khác đượctái chế thành vật liệu xây dựng nhẹ cấp thấp được dùng cho các công trìnhcảnh quan đô thị

Trên thế giới, việc xử lý rác thải đều được các nước quan tâm vàthực hiện một cách nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối với môi trường Ở Đan

Mạch và Mỹ đang ngày đêm xây dựng các nhà máy lớn với mục đích xử lý

chất thải thành điện năng Ngoài ra, ở một số nước như: Anh, Mỹ, Nhật

Bản,… đưa ra các biện pháp tối ưu, áp dụng nhiều kỹ thuật khoa học tiêntiến để tái chể các loại rác thải thành sản phẩm có giá trị sử dụng thực tế

(https://vea.gov.vn )

Ngày nay, với sự phát triển ngày một nâng cao của ngành côngnghệ sinh học, đặc biệt là chuyên ngành vi sinh vật, các nhà nghiên cứu khoahọc đã ứng dụng thành công một số vi sinh vật trong việc xử lý môi trường.Các loại vi sinh vật được biết đến với khả năng tạo ra các hệ enzyme có thể

xử lý rác thải Các chất độc hại trong môi trường bao gồm các chất có vòngthơm như hợp chất phenol, các amin vòng, hợp chất phospho hữu cơ, Các

hệ enzyme có thể hoạt động trên các chất ô nhiễm đặc biệt khó xử lý để loại

bỏ chúng bằng cách kết tủa hoặc chuyển chúng thành dạng khác ít độc hại.Hơn thế nữa, chúng có thể làm thay đổi các đặc tính của chất thải về dạng dễ

xử lý hoặc chuyển thành sản phẩm có giá trị hơn Ví dụ: enzyme protease,lipase, cellulase,

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước.

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Bacillus sp là đối tượng có khả năng sản xuất enzyme cellulase có

hoạt tính cao, sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, phân bón,GVHD: Võ Th Ng c Bích ị Ngọc Bích ọc Bích Trang 4

Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang

xử lý môi trường và y học Trong khảo sát các điều kiện nuôi cấy và tách

chiết enzyme cellulase từ Bacillus subtilis, kết quả cho thấy ở 40oC, pH=7,0

và thời gian nuôi là 30 giờ thì lượng enzyme sinh ra là lớn nhất và có thểthủy phân mạnh mẽ nguồn cellulose (Trần Thị Ánh Tuyết và Trương QuốcHuy, 2010)

Theo Trần Cẩm Vân (2001), cellulose được phân hủy bởi cácenzyme ngoại bào cellulase Các nhóm vi khuẩn có khả năng phân hủy

cellulose là: Cytophaga, Cellulomonas, Clostridium, Pseudomonas Các

giống vi khuẩn này được nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến trong cácquá trình làm sạch sinh học Ngoài ra, chúng còn có khả năng tái khoáng hóanhiều chất bẩn hữu cơ (Kiều Hữu Anh và Ngô Tự Thành, 1985)

Cellulose là cơ chất khó bị phân hủy vì có cấu trúc rất bền và hoànhoàn không tan trong cả nước nóng lẫn nước lạnh Vi khuẩn có khả năngphân hủy cellulose vì chúng có thể tạo ra được 3 loại enzyme phân hủy đượccellulose Tuy nhiên không phải tất cả các vi khuẩn đều có khả năng cùngmột lúc tổng hợp ra 3 loại enzyme Có loài tổng hợp ra enzyme này nhiều,loài khác lại tổng hợp ra enzyme khác nhiều hơn Chính vì thế, sự phân hủycác hợp chất cellulose trong thiên nhiên đòi hỏi rất nhiều loài vi khuẩn khácnhau, thay phiên nhau phân hủy từng giai đoạn trong toàn bộ chuỗi chuyểnhóa các chất chứa cellulose (Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị ThùyDương, 2003)

Các chủng vi sinh vật phân hủy cellulose được phân lập từ đất, bùnmía Các chủng nấm phân lập trên môi trường Czaper-Dox có bổ sung bộtgiấy, các chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường Lemberk và Colmervới giấy lọc Bằng phương pháp xác định hoạt tính cellulase ngoại bào bằngkhuếch tán trên thạch và phương pháp xác định hoạt tính cellulase theoNelson- Somogyi, Nguyễn Thị Kim Cúc (2001) đã phân lập được 6 chủngnấm và 15 chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulose

2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Cellulase, đặc biệt là EGIII và CBHI thường được dùng làm sạchvải sợi (Clarksonet et al., 2000) Những cellulase thu nhận từ những chủng

nấm mốc: Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichoderma

harzianum, Humicola insolens,… hoạt động trong môi trường kiềm nhẹ

GVHD: Võ Th Ng c Bích ị Ngọc Bích ọc Bích Trang 5

Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang

thường được ứng dụng trong công nghiệp tẩy rửa (Kottwitz và Schambil,2005) Chúng thường được dùng kết hợp với bột giặt và chất tẩy (Uhlig,1998)

Bakare et al (2005) đã phân lập và định tính enzyme cellulase từ một chủng hoang dại và hai chủng đã được gây đột biến của Pseudomonas

fluorescens Động lực học enzyme của ba loại enzyme trên ở pH 6,5-7,0,

35oC lần lượt là 3,6; 3,1 và 5,3 mg/mL Othman et al (2011) đã tiến hànhthủy phân vỏ trái ca cao thành ethanol nhiên liệu Kết quả thủy phân caonhất khi thủy phân vỏ trái ca cao bằng acid HCl ở 75oC trong 4 giờ Lượngđường sinh ra sau quá trình thủy phân được lên men bằng nấm men

Saccharomyces cerevisiae ở 30oC Lượng ethanol thu được là 17,3% sauthời gian lên men là 26 giờ

Clostridium papyrosolvens cũng được phát hiện có khả năng tổng

hợp cellulase Clostridium papyrosolvens được nuôi cấy 48 giờ trong điều

kiện kỵ khí ở 35oC cho dịch trích có hoạt tính CMCase cao CMCase có nhiệt độ tối thích là 35oC và pH tối thích là 6,5 đến 7,5 (Rani.D.Swaroopa, 2004)

2.4 Giới thiệu về cellulose

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật Ngoài ra người tacòn thấy chúng có mặt nhiều ở một số tế bào của một số loài vi sinh vật

Ở tế bào thực vật và ở tế bào một số loài vi sinh vật chúng tồn tại ở dạngsợi Cellulose không có trong tế bào động vật, chúng là một homopolymermạch thẳng được cấu tạo bởi các đơn vị -D Glucose –Pyranose Cácthành phần này liên kết với nhau bởi các glucose không phân nhánh, cácglucose này liên kết bởi β-1,4glucosidases (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Cellulose thường chứa 10.000-14.000 đơn vị glucose/phân tử và

có trọng lượng phân tử khoảng 50.000- 2.500.000 Dalton Các phân tửcellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van Der War và liên kết hydro(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Cellulose không tan trong nước Khi đun nóng với acid sulfuric,celluolose bị thủy phân thành cellubiose rồi thành - Glucose

GVHD: Võ Th Ng c Bích ị Ngọc Bích ọc Bích Trang 6

Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang

Các phân tử glucose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng3nm Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi (microfibrin), các visợi thường tồn tại 2 vùng:

+Vùng kết tinh: Celllose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bềnvững Enzyme cellulase chỉ có tác dụng trên bề mặt hệ sợi này

+Vùng vô định hình: cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bịtác động bởi các yếu tố bên ngoài Enzyme cellulase có thể thủy phân vùngnày dễ dàng và làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng Chiều dài phân tửcellulose trong vùng này thường lớn gấp hàng chục lần so với vùng kết tinh(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.5 Tổng quan về phức hệ enzyme cellulase

Cellulose là định nghĩa chung để chỉ tất cả những enzyme có hoạttính thủy phân cellulose thành các đơn vị monomeric Một số nghiên cứu đãchỉ ra rằng hệ enzyme có khả năng thủy phân cellulose thì cũng có hoạt tínhtương tự như đối với hemicellulose (Howard et al., 2003; Lynd et al., 2002).Cellulase phân cắt các liên kết β-1,4glucosidases của mạng lưới cellulosetheo cơ chế thủy phân acid (cho và nhận proton) Hệ thống enzyme cellulaseđược chấp nhận rộng rãi hiện nay là sự đồng hoạt động của các loại enzymesau: endoglucanase (EC 3.2.1.4), exoglucanase hoặc cellobiohydrolase (EC3.2.1.91), β-glucosidase (EC 3.2.1.21), oxidative cellulose và cellulosePhosphorylase

Các loại enzyme trong hệ enzyme cellulase thay phiên nhau phânhủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Mỗi một loạienzyme chỉ tham gia thủy phân một phần phân tử cellulose

Endoglucanases : Các nhà khoa học chia chúng thành 2 loại EgI I

và EgI II EGI I chứa 418 amino acid , trọng lượng phân tử 48.212k Da Cácenzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao và tham gia phân hủy liênkết β-1,4- glycosidic trong cellulose, trong lichenin β-D-glucanase Tên gọikhác và thủy phân các liên kết β-glucosidases của mạng lưới cellulose mộtcách ngẫu nhiên để sản xuất chuỗi mới Exoglucanases phân cắt những phân

tử cellulose được tổng hợp từ enzyme endoglucanases tại các vị trí đầu chuỗigiải phóng ra những phân tử glucose hoặc cellobiose β- glucosidases thủyphân các phân tửcellodextrins và cellobiose thành glucose (Lynd et al.,GVHD: Võ Th Ng c Bích ị Ngọc Bích ọc Bích Trang 7