Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose tại các bãi rác tỉnh tiền giang Một trong những thành phần chủ yếu hiện diện trong phần lớn nguồn rác thải là Cellulose. Cellulose thường có mặt ở các dạng như: phụ phẩm nông nghiệp (rơm, rạ, lá cây, vỏ lạc, vỏ trấu, vỏ thân ngô, xác các loại cây lương thực,…), phụ phế phẩm công nghiệp thực phẩm (vỏ và xơ quả, bã mía, bã cà phê, bã sắn, hạt sơ ri,…), phụ phế phẩm trong công nghiệp chế biến gỗ (rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn, vỏ cây,…) và các chất thải gia đình (vải, giấy vụn, các loại thùng giấy,…).
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KHOA HỌC CÂY TRỒNG ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE TỪ RÁC THẢI HỮU CƠ Tiền Giang, tháng 12 năm 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KHOA HỌC CÂY TRỒNG ĐỀ CƯƠNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE TỪ RÁC THẢI HỮU CƠ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN VÕ THỊ NGỌC BÍCH SINH VIÊN THỰC HIỆN ĐẶNG THỊ MỸ DUYÊN MSSV: 013142089 NGUYỄN DUY PHƯƠNG MSSV: 013142049 LỚP DHCNSH13 Tiền Giang, tháng 12 năm 2016 MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Võ Thị Ngọc Bích Đặng Thị Mỹ Duyên DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ KHÓA LUẬN ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Tiền Giang, ngày tháng năm 2017 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG CHƯƠNG GIỚI THIỆU .1 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài .2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược vấn đề môi trường .3 2.2 Sơ lược biện pháp xử lý rác thải 2.3 Tình hình nghiên cứu nước ngồi nước 2.3.1 Tình hình nghiên cứu nước .4 2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 2.4 Giới thiệu cellulose 2.5 Tổng quan phức hệ enzyme cellulase .7 2.6 Một số dòng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose 2.6.1 Vi khuẩn Bacillus sp 2.6.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp .9 2.6.3 Vi khuẩn Cellulomonas sp .10 2.6.4 Vi khuẩn Cytophara .11 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1.Phương tiện 12 3.1.1.Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn có khả phân hủy cellulose 12 3.1.2 Giả thuyết nghiên cứu 12 3.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 12 3.1.4 Vật liệu hóa chất .12 3.2 Phương pháp nghiên cứu .13 3.2.1.Thí nghiệm 1: Phân lập chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose .13 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh phức hệ enzyme cellulase cao 15 3.2.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian nuôi ủ pH môi trường ảnh hưởng đến khả phân hủy cellulose vi khuẩn .16 3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả phân hủy giấy photocopy dòng vi khuẩn 17 3.2.5 Thí nghiệm 5: Nhận diện số chủng vi khuẩn phương pháp giải trình tự .17 CHƯƠNG KẾT QUẢ DỰ KIẾN 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO .20 DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subitilis Hình 2.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp 10 Hình 2.3 Vi khuẩn Cellumonas sp .10 Hình 2.4 Vi khuẩn Cytophaga sp 11 Hình 3.1 Quy trình phân lập vi khuẩn có khả phân hủy cellulose 12 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn (Han Srinivasan, 1968) 13 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ơ nhiễm mơi trường trở thành vấn đề cấp thiết quan tâm hàng đầu toàn giới nói chung Việt Nam nói riêng Hằng ngày, lượng lớn rác thải từ nhà máy rác thải, xí nghiệp, nơng nghiệp, sinh hoạt gia đình khơng ngừng thải môi trường Đến năm 2015 Việt Nam thải 40 triệu rác thải (Bộ Tài Nguyên Môi trường) Rác thải nguyên nhân gây biến đổi khí hậu, dịch bệnh, thủng tầng ozon… đặc biệt ảnh hưởng trực tiếp đến kinh tế nước nhà đời sống xã hội Một thành phần chủ yếu diện phần lớn nguồn rác thải Cellulose Cellulose thường có mặt dạng như: phụ phẩm nơng nghiệp (rơm, rạ, cây, vỏ lạc, vỏ trấu, vỏ thân ngô, xác loại lương thực,…), phụ phế phẩm cơng nghiệp thực phẩm (vỏ xơ quả, bã mía, bã cà phê, bã sắn, hạt sơ ri,…), phụ phế phẩm công nghiệp chế biến gỗ (rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn, vỏ cây,…) chất thải gia đình (vải, giấy vụn, loại thùng giấy,…) Cellulose hợp chất cao phân tử cấu tạo từ liên kết mắt xích -D- Glucose, thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật, khó phân hủy, việc xử lý cellulose từ rác thải hữu gặp nhiều khó khăn Các nhà khoa học khơng ngừng tìm cách xử lý tối ưu lượng cellulose biên pháp vật lý, hóa học, sinh học nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường Hiện nay, để xử lý rác thải hữu dùng nhiều phương pháp: chôn lấp, ủ phân compost, đổ đống tự nhiên… Những phương pháp nhiều hạn chế tốn thời gian, khơng đạt hiệu cao Vì việc xử lý cellulose biện pháp sinh học quan tâm nghiên cứu nhiều nhất, phương pháp sử dụng vi sinh vật hệ enzyme vai trò chất phân hủy rác thải thành hợp chất đơn giản, độc hại, dễ xử lý, an tồn Đồng thời ứng dụng vi sinh vật để sản xuất phân bón hữu co Xuất phát từ thực tế này, chúng GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang thực đề tài “ Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose từ rác thải hữu cơ” 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập số chủng vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác thải hữu Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh phức hệ enzyme cellulase cao Nhận diện số vi khuẩn có khả phân hủy cellulose từ rác thải hữu GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang Các phân tử glucose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm Các sợi sơ cấp kết hợp với tạo thành vi sợi (microfibrin), vi sợi thường tồn vùng: +Vùng kết tinh: Celllose có cấu trúc trật tự cao bền vững Enzyme cellulase có tác dụng bề mặt hệ sợi +Vùng vơ định hình: cellulose có cấu trúc khơng chặt dễ bị tác động yếu tố bên ngồi Enzyme cellulase thủy phân vùng dễ dàng làm thay đổi toàn cấu trúc chúng Chiều dài phân tử cellulose vùng thường lớn gấp hàng chục lần so với vùng kết tinh (Nguyễn Đức Lượng, 2004) 2.5 Tổng quan phức hệ enzyme cellulase Cellulose định nghĩa chung để tất enzyme có hoạt tính thủy phân cellulose thành đơn vị monomeric Một số nghiên cứu hệ enzyme có khả thủy phân cellulose có hoạt tính tương tự hemicellulose (Howard et al., 2003; Lynd et al., 2002) Cellulase phân cắt liên kết β-1,4glucosidases mạng lưới cellulose theo chế thủy phân acid (cho nhận proton) Hệ thống enzyme cellulase chấp nhận rộng rãi đồng hoạt động loại enzyme sau: endoglucanase (EC 3.2.1.4), exoglucanase cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), β-glucosidase (EC 3.2.1.21), oxidative cellulose cellulose Phosphorylase Các loại enzyme hệ enzyme cellulase thay phiên phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối glucose Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân phần phân tử cellulose Endoglucanases : Các nhà khoa học chia chúng thành loại EgI I EgI II EGI I chứa 418 amino acid , trọng lượng phân tử 48.212k Da Các enzyme hoạt động nhiệt độ cao tham gia phân hủy liên kết β-1,4- glycosidic cellulose, lichenin β-D-glucanase Tên gọi khác thủy phân liên kết β-glucosidases mạng lưới cellulose cách ngẫu nhiên để sản xuất chuỗi Exoglucanases phân cắt phân tử cellulose tổng hợp từ enzyme endoglucanases vị trí đầu chuỗi giải phóng phân tử glucose cellobiose β- glucosidases thủy phân phân tửcellodextrins cellobiose thành glucose (Lynd et al., 2002; GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang Howard et al., 2003; Miyamoto, 1997) Oxidative cellulose cắt phân tử cellulose phản ứng tạo gốc tự Cellulose phosphorylase phân cắt phân tử cellulose thành monomer cách sử dụng phosphate thay sử dụng nước Hệ enzyme ngoại bào gồm nhóm (Nguyễn Đức Lượng, 2004): Cellobiohydrolase (Cbh) gồm hai loại: Cbh I Cbh II Enzyme có tên khoa học khác như: 1,4β-D-glucan cellobiohydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase hay avicelase Enzyme cắt đầu không khử chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose giải phóng đơn vị glucose (glucanohydrolases) cellulobiose (cellobiohydrolase) + Cbh I có trọng lượng phân tử 65k Da, điểm đẳng điện 4,4 (PI= 4,4) chứa khoảng 496 amino acid Enzyme tác động lên cellulose vô định hình cellulose kết tinh Nhưng lại khơng tác động lên cellulose biến tính carboxymethyl-cellulose (CMC) hay hydroxyethycellulose, cellohexaose -nitrophenyl, -glucosidie hay -glucan +Cbh II có trọng lượng phân tử 53kDa, PI= 5,0, chứa khoảng 471 amino acid Enzyme không tác động đến CMC, có khả tác động đến cellulose hòa tan cellulose khơng hòa tan Endoglucanase (Egl): Các nhà khoa học chia chúng làm loại Egl I Egl II Egl I chứa 418 amino acid, trọng lượng phân tử 48212kDa Egl II chứa 418 amino acid, trọng lượng phân tử 42,2kDa Các enzyme hoạt động nhiệt độ cao tham gia phân hủy liên kết -1,4-glycosidic cellulose, -D-glucanase Tên gọi khác 1,4-D-glucan-4- glucanohydrolase, endo 1,4- -glucanase, C-cellulase, CMCase -glucosidase nhóm enzyme phức tạp, chúng có khả hoạt động pH rộng (pH 4,4-4,8), trọng lượng phân tử 50-98kDa pI 8,4 hoạt động nhiệt độ cao Tên gọi khác GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang -D-glucoside Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang glucohydrolase, cellobiase Enzyme tham gia phân hủy cellobiose tạo thành glucose, khơng có khả phân hủy cellulose nguyên thủy 2.6 Một số dòng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose 2.6.1 Vi khuẩn Bacillus sp Đa số dòng vi khuẩn Bacillus sp có khả sinh nội bào tử hiếu khí, Gram dương Đặc biệt Bacillus subtlis vi khuẩn không gây bệnh, có sức sống cao, dễ ni cấy có khả hình bào tử chịu nhiệt cao Ở điều kiện thích hợp, chúng có khả sản xuất lượng lớn enzyme cellulase Bacillus subtilis có khả phân hủy chất hữu lắng động đáy ao, tác động làm giảm đáng kể lớp bùn nhớt ao (Trần Thị Ánh Tuyết Trương Quốc Huy, 2010) Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguồn: http://anabio.vn/gioi-thieu-loi-khuan-bacillus-subtilis) 2.6.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp Dòng vi khuẩn Pseudomonas sp vi khuẩn Gram âm, đa số hình que, chuyển động roi, không sinh bào tử, hô hấp hiếu khí, có sinh độc tố toxin có khả tổng hợp enzyme cellulase mơi trường thích hợp Một số loài thường gặp là: Pseudomonas aeruginosa, P putida, P fluorescens, P syringae,… GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang Hình 2.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp (Nguồn: https://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas) 2.6.3 Vi khuẩn Cellulomonas sp Là vi khuẩn Gram dương, hình que Chúng thường phân hủy cellulose cách tiết enzyme endoglucanase exoglucanase Quá trình trao đổi chất chúng hô hấp, Cellulomonas thường sử dụng glucose cellulase để làm nguồn dinh dưỡng sản sinh acid (Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Cellulomonas) Hình 2.3.Vi khuẩn Cellulomonas sp (Nguồn: http://coryneforms.weebly.com/cellulomonas.html) GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 10 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang 2.6.4 Vi khuẩn Cytophara Các giống vi khuẩn Cytophaga có tế bào đầu nhọn, khơng sinh vi kén, sống đất acid, trung tính kiềm Cytophaga vi khuẩn Gram âm, hình que , sinh trưởng điều kiện hiếu khí, có khả phân hủy cellulose cao nhanh Vi khuẩn thường tìm thấy đất (Nguồn: https://voer.edu.vn) Hình 2.4 Vi khuẩn Cytophaga sp (Nguồn: https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Cytophaga_Flavobacterium) GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 11 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Phương tiện 3.1.1.Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn có khả phân hủy cellulose 3.1.2 Giả thuyết nghiên cứu Nếu đề tài thành công phân lập chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose từ rác thải hữu xác định mật độ vi khuẩn thích hợp phân hủy cellulose điều kiện thí nghiệm 3.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu -Thời gian thực hiện: 1/2017 – 5/2017 -Địa điểm thực hiện: Tại phòng thí nghiệm khoa NN&CNTP 3.1.4 Vật liệu hóa chất -Vật liệu: +Rác thải hữu (rau, củ) huyện khác tỉnh Tiền Giang -Thiết bị, vật liệu, hóa chất +Thiết bị: Tủ cấy vi sinh vật vô trùng, tủ ủ vi sinh vật, nồi khử trùng nhiệt ướt, máy lắc mẫu, máy đo quang phổ, máy đo pH, cân điện tử, máy ly tâm, micropipette, ống nghiệm, đĩa petri… Một số dụng cụ khác như: que cấy, bình tam giác, que trải thủy tinh, ống đong, đèn cồn … GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 12 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang *Môi trường: Bảng 1: Môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn (Han Srinivasan, 1968) Thành phần Khối lượng (g) CaCl2 0,05 MgSO4 0,1 KH2PO4 0,5 K2HPO4 0,5 (NH4)SO4 1,0 NaCl 6,0 CMC (Carbon Mymethyl Cellulose) 20 Agar 20 Nước cất lít +Hóa chất: Thuốc thử Congo Red Hóa chất nhuộm gram: Crystal Violet, Cồn 70o, Iod, Fushin Hóa chất chạy PCR, chạy điện di 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1.Thí nghiệm 1: Phân lập chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose Mục tiêu: Chọn lọc dòng vi khuẩn có khả phân hủy nguồn cellulose có dịch rác thải Các bước tiến hành: - Chuẩn bị môi trường phân lập: Môi trường phân lập vi khuẩn (Han Srinivasan, 1968) sau pha theo thành phần khối lượng chất khử trùng nhiệt ướt 121oC, áp suất atm 20 phút Sau GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 13 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang khử trùng, tiến hành phân phối môi trường vào đĩa petri khử trùng chiếu xạ tia UV(10 phút).Trữ mẫu vào tủ lạnh chưa sử dụng - Trải mẫu cấy chuyển: Sau lấy mẫu trực tiếp từ bãi rác Tiến hành pha loãng mẫu Mẫu phân lập theo quy trình: Thu mẫu Trộn Pha lỗng mẫu 10-0-10-4 Hút 100 l Cấy trãi mơi trường CMC Ủ 48 giờ, 30oC điều kiện hiếu khí kỵ khí Chọn khuẩn lạc rời Cấy chuyển đến vi khuẩn lạc Kiểm tra độ Trữ mẫu Hình 3.1 Quy trình phân lập vi khuẩn có khả phân hủy cellulose Mỗi nồng độ pha loãng cấy trải đĩa, hai đĩa ủ điều kiện hiếu khí (một đĩa 30oC, đĩa 55oC), hai đĩa lại ủ điều kiện kỵ khí (một đĩa 30oC, đĩa 55oC) Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy chuyền vi khuẩn ròng cấy sang ống nghiệm mơi trường đặc tương ứng để trữ mẫu 4oC xem chủng Sau phân lập ta tiến hành quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc, đo kích thước khuẩn lạc sau 24 ni cấy Đồng thời quan sát hình dạng tế bào kính hiển vi khả chuyển động vi khuẩn * Các bước nhuộm Gram vi khuẩn: (Nguồn: Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2009) Chuẩn bị tiêu : GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 14 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang - Nhỏ giọt nước cất khử trùng lên lame - Dùng que cấy lấy vi khuẩn cho vào giọt nước - Hơ nóng mặt lame lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn Nhuộm tiêu bản: - Nhỏ 1-2 giọt Crystal Violet từ mẫu cố định, để phút Rửa nước từ 2-3 giây, chậm nhẹ cho khô bớt nước Nhỏ dung dịch Iod, để phút Rửa nước cất, chậm nhẹ Rửa cồn 70° thật nhanh để tẩy màu giọt cồn cuối khơng màu tím Rửa nước vài giây, chậm nhẹ giấy thấm Nhỏ 1-2 giọt Fushin, để phút Rửa nước vài giây, chậm nhẹ giấy thấm Quan sát kính hiển vi Quan sát kính hiển vi có độ phóng đại 40 lần ghi nhận Gram vi khuẩn Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh Crystal violet mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ Fushin mẫu Gram âm * Thử nghiệm catalase: - Lấy khuẩn lạc 18-24h tuổi đặt lên lam kính Nhỏ giọt H2O2 3% phủ lên vi khuẩn quan sát tạo thành bọt khí - Kết Bọt khí sủi mạnh nhanh catalase (+) Một số vi khuẩn khơng có catalase có khả phân hủy H2O2 tạo thành bọt khí nhỏ chậm 30 giây, khơng phải catalase (+) 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh phức hệ enzyme cellulase cao Mục tiêu: Bước đầu đánh giá khả phân hủy cellulose chủng vi khuẩn phân lập từ dịch rác thải Chọn số chủng có hoạt tính enzyme cellulase cao làm sở khảo sát cho thí nghiệm sau Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí cách ngẫu nhiên, nhân tố chủng vi khuẩn, lần lặp lại Các bước tiến hành: Sử dụng phương pháp đục lỗ thạch đĩa môi trường thử hoạt tính enzyme cellulase (Hendrick et.al 1995) Dùng dụng cụ GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 15 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang đục lỗ thạch khử trùng có đường kính 5mm đục lỗ mơi trường, đĩa lỗ Sau 48 nuôi tăng sinh 10 ml môi trường lỏng ( Han Srinivasan) vi khuẩn hiếu khí máy lắc, 150 vòng/ phút gần 20ml dòng vi khuẩn điều kiện kỵ khí, mức nhiệt độ 30oC 55oC, tiến hành đếm mật số tế bào vi khuẩn * Kiểm tra hoạt tính enzyme cellulase Song song với trình đếm mật số, tiến hành thử hoạt tính enzyme cellulase phương pháp đục lỗ thử với thuốc thử Congo Red Hút 40μl dung dịch môi trường nuôi vi khuẩn, nhỏ vào đĩa thạch đục lỗ Ủ khoảng 24 30oC 55oC tương ứng với chủng phân lập điều kiện thí nghiệm 1; mẫu kỵ khí ủ bình kỵ khí Sau nhuộm thuốc thử Congo Red đo đường kính vòng tròn thủy phân (Trần Thị Ánh Tuyết Trương Quốc Huy, 2010) Quan sát ghi nhận đường kính vòng tròn thủy phân, chọn chủng có hoạt tính enzyme cellulase cao :4 chủng vi khuẩn hiếu khí (2 chủng bình nhiệt chủng ưa nhiệt), chủng kỵ khí (2 chủng bình nhiệt chủng ưa nhiệt) Các chủng chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.Chỉ tiêu quan sát: đường kính vòng tròn thủy phân sau nhuộm với Congo Red 3.2.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian nuôi ủ pH môi trường ảnh hưởng đến khả phân hủy cellulose vi khuẩn Mục tiêu: Xác định thời gian nuôi ủ pH môi trường thích hợp cho sinh enzyem cellulase cao Bố trí thí nghiệm - Thời gian: Thí nghiệm bố trí cách ngẫu nhiên, theo thể thức nhân tố dòng vi khuẩn thời điểm 24; 36; 48; 60 giờ, lần lặp lại Tiến hành: Chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase cao qua thí nghiệm để khảo sát thời gian, pH tối ưu Cấy mẫu vào đĩa chứa môi trường CMC Ủ mẫu điều kiện thích hợp (2 mẫu hiếu khí bình nhiệt, mẫu hiếu khí ưa nhiệt, mẫu kỵ khí làm tương tự) Sau 24; 36; 48; 60 ta tiến hành thử hoạt tính enzyme cellulase.Thí GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 16 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang nghiệm tiến hành theo phương pháp khuếch tán giếng thạch tương tự thí nghiệm 2, tương ứng với nghiệm thức thời gian nuôi ủ - pH: Thí nghiệm bố trí cách ngẫu nhiên, theo thể thức nhân tố dòng vi khuẩn pH với mức độ 6,5; 7; 7,5; 8; lần lặp lại Tiến hành:Chọn dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase cao qua thí nghiệm để khảo sát pH tối ưu Tương tự với thí nghiệm khảo sát thời gian Ta điều chỉnh pH môi trường tương ứng mức độ: 6,5; 7; 7,5; Ủ điều kiện thích hợp 36 Sau khảo sát điều kiện thời gian pH nuôi cấy ta chọn chủng vi khuẩn để làm thí nghiệm 3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả phân hủy giấy photocopy dòng vi khuẩn Mục tiêu:Đánh giá khả phân hủy chủng vi khuẩn với co chất giấy photocopy Tiến hành: Chọn chủng nuôi 50ml môi trường Mfp lỏng (0,1g giấy photocopy xay mịn/ 50ml môi trường M) Nguồn giống chủng nuôi môi trường CMC lỏng ngày, chủng với tỉ lệ 1% Sau ngày đánh giá khả phân giải dựa khối lượng khô giấy photocopy Công thức tính khả phân giải: (Khối lượng ban đầu – Khối lượng lúc sau)/Khối lượng ban đầu x 100 3.2.5 Thí nghiệm 5: Nhận diện số chủng vi khuẩn phương pháp giải trình tự Sau đánh giá khả phân hủy chủng vi khuẩn ta chòn chủng để giải trình tự nhận diện Mục tiêu: Nhận diện số chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme cenllulase cao Tiến hành: Chọn dòng vi khuẩn,tiến hành ly trích DNA dòng vi khuẩn tuyển chọn khuếch đại DNA kỹ thuật PCR với cặp mồi: 27f: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’; GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 17 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang 1492r: 5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’ (Akasaka et al., 2002) Sản phẩm sau khuếch đại điện di agarose gel 1,2% điện di chiều có bổ sung thêm SYBR-GREEN để kiểm tra sản phẩm Cuối giải trình tự đoạn DNA khuếch đại Được kết quả, dùng chương trình BLAST N để so sánh trình tự đoạn DNA dòng vi khuẩn với trình tự DNA lồi vi khuẩn có ngân hàng liệu NCBI, nhận diện dòng vi khuẩn CHƯƠNG KẾT QUẢ DỰ KIẾN - Phân lập số chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose từ rác thải hữu -Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh phức hệ enzyme cellulase cao ổn định - Nhận diện số vi khuẩn có khả phân hủy cellulose từ rác thải hữu GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 18 Luận văn tốt nghiệp ĐH CHƯƠNG 5: KẾ HOẠCH THỰC HIỆN STT Nội dung, công việc Viết báo cáo đề cương Thu mẫu rác thải hữu bãi rác (Mỹ Tho, Nhị Bình, Thị xã Gò Cơng) Phân lập Thí nghiệm Tuyển chọn vi khuẩn phân hủy cellulose Thí nghiệm 2, Định danh dòng vi khuẩn phân lập Trường ĐH Tiền Giang (Lý trích DNA, thực phản ứng PCR) Sản phẩm Thời gian Từ 7-12 đến 7-2 Mẫu rác hữu có Từ 15-2 đến 18chứa vi sinh vật 2-2017 phân hủy cellulose Chọn khuẩn lạc đặc trưng Từ 18-2 đến 203-2017 15/2/17 – 31/3/17 Chọn chủng vi Từ 1-4 đến 15khuẩn có khả 5-2017 phân hủy cellulose 1/4/17 – 15/5/17 cao Nhận diện số chủng vi khuẩn phân hủy cellulose Từ 15-5 đến 305-2017 16/5/17 – 20/5/17 Gửi mẫu giải trình tự 20/5/17-31/5/17 Xử lý số liệu, viết báo cáo Từ 1-6 đến 306-2017 GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 19 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tài liệu tiếng việt Hoàng Hải Dư Ngọc Thành, 2008 Giáo trình vi sinh vật đại cương Đại học Thái Nguyên NXB Hà Nội Nguyễn Đức Lượng Nguyễn Hữu Phúc 1996 Công nghệ vi sinh vật tập sinh học công nghiệp Nhà xuất Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh, trang 189 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền Nguyễn Ánh Tuyết 2003 Thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học T2 Thí nghiệm Vi sinh vật học NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng 2004 Cơng nghệ enzyme Nhà xuất Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, trang 34-45 Võ Văn Phước Quệ Cao Ngọc Điệp 2011 Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose Tạp chí khoa học 2011:18a 177-184 Tâm 2000 Công nghệ vi sinh ứng dụng Nhà xuất nơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, trang 57-59 Nguyễn Thị Thanh Trúc 2010 Tuyển chọn khảo sát điều kiện ni cấy dòng vi khuẩn hiếu khí có khả thủy phân bã mía Luận văn tốt nghiệp Đại học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Cần thơ Trần Thị Ánh Tuyết Trương Quốc Huy 2010 Khảo sát điều kiện nuôi cấy chiết tách enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis Tuyển tập báo cáo hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học lần thứ 7, Đà Nẵng, 378384 *Tài liệu tiếng anh Awais, M., A.A Shah, A Hameed and F Hasan 2007 “Isolation, identification and optimization of bacitracin produced by Bacillus sp” Pak J Bot 39, pp.1303-1312 Chung, S., H Kong, J.S Buyer, D.K Lakshman, J Lydon, S.D.Kim and D.P.Roberts 2008 “Isolation and partial characterization of Bacillus GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 20 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang subtilis ME488 for suppression of soilborne pathogens of cucumber and pepper” Appl Microbiol Biotechnol 80, pp.115–123 Deschemps F and M.C Huet 1985 “Xylanase production in solidstate fermenttation: A study of its properties” Appl Microb Biotechnol 22, pp.177-180 Hyungjae, L and H.Y Kim 2011 “Lantibiotics, Class I Bacteriocins from the Genus Bacillus” J Microbiol Biotechnol 21, pp.229–235 Han,Y.Z and V.R Srinivasan 1968 “Isolation and Characteration of a Cellulose Utilizing Bacterium” Applied Microbiology 36, pp.1140-1145 Hedricks, C.W., J.D.Doyle and B Hugley 1995 “A New Solid Medium for Enumerating Cellulose Utilizing Bacteria in Soil” Applied and Environmental Microniol 61, pp.2016-2019 Lutzen N.V and M H Nielson 1983 “Cellulose and their application in the forming converson of lignocellulose to fermentable surgurs” Phil Trans R Soc., London 300, pp.283-291 GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 21 ... Từ 18 -2 đến 203 -2 01 7 15 /2 /17 – 31/ 3 /17 Chọn chủng vi Từ 1- 4 đến 1 5khuẩn có khả 5 -2 01 7 phân hủy cellulose 1/ 4 /17 – 15 /5 /17 cao Nhận diện số chủng vi khuẩn phân hủy cellulose Từ 15 -5 đến 305 -2 01 7... 2.4 Vi khuẩn Cytophaga sp 11 Hình 3 .1 Quy trình phân lập vi khuẩn có khả phân hủy cellulose 12 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn (Han Srinivasan, 19 68) 13 ... 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2 .1. Thí nghiệm 1: Phân lập chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose Mục tiêu: Chọn lọc dòng vi khuẩn có khả phân hủy nguồn cellulose có dịch rác thải Các bước tiến