ứng dụng KTPT trong chọn tạo giống lúa chịu mặn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG KHOA KTNN & CNTP Lớp ĐH CNSHK13 KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ  :TS Đoàn Thị Ngọc Thanh  SVTH: Nguyễn Duy Phương Nguyễn Duy Phương 013142050 Đặng Thị Mỹ Duyên 013142089 Trần Minh Phúc 013142023 Lê Quang Tuân 013142018 Lê Thị Hồng Hiệp 013142035   013142049 ĐỀ TÀI Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Bấm để sửa kiểu văn bản Bản cái Mức hai Mức ba Mức bốn Mức năm I II NỘI DUNG TỔNG QUAN Chỉ thị SSR Giải pháp QUY TRÌNH CHUNG Cơ chế hình thành Cách xác định Nguyên lý Hóa chất Phương pháp Điều kiện III PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN IV QUY TRÌNH BÀI BÁO Lý chọn đề tài Quy trình V ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM VI KẾT LUẬN I TỔNG QUAN Chỉ thị SSR a Lịch sử: Kể từ thị DNA phát triển ứng dụng cuối năm 90 kỷ XX, hàng loạt thị DNA hay gọi thị phân tử đời thị chuỗi trình tự lặp lại đơn giản - Chỉ thị phân tử SSR ứng dụng thành công từ 1990 đến 1995: Trong lúa, có 185 marker xác định 12 NST 1996: dùng để phát gen có ích thực vật, liên hệ huyết thống 1997: Những marker phân tử dùng để xác định đánh dấu gen mong muốn I TỔNG QUAN Chỉ thị SSR b Khái niệm: Microsatellite (hay thị vi vệ tinh= Simple Sequence Repeates SSR) chuỗi mã di truyền lặp lại đơn giản, thường xảy cách ngẫu nhiên hầu hết genomic thực vật, gồm đơn vị lặp lại từ 2-6 nucleotid, kiểu lặp lại ngắn vài chục lần Do SSR khuyếch đại ống nghiệm phương pháp PCR Kỹ thuật thị phân tử SSR nghiên cứu lần người đến tìm thấy hầu hết Eukaryota khác I TỔNG QUAN Chỉ thị SSR c Các loại SSR: SSRs vào cấu tạo đơn vị lặp lại (2-6 lần – dinucleotide repeat) có trinucleotide hay dinucleotide tìm thấy nhiều động vật có vú chủ yếu GT/AC, thực vật AA/TT, AT/TA Chúng ta phân làm loại: • Hoàn hảo ngắt quãng trình tự phối hợp: • Ngắt quãng bao gồm kết hợp nhiều loại lặp lại • Ngắt quãng bị chèn hay nhiều base CACACACACACA CACACACAGAGAGA CACATTCACACATTCATT I TỔNG QUAN Giải pháp: - Chỉ thị phân tử có chất: đa hình DNA - Phát đoạn SSR liên kết với gen chịu mặn  biết có hay gen chịu mặn  nhà chọn giống chủ động việc chọn lựa tổ hợp lai hiệu  chọn tạo giống chống chịu mặn nhanh II QUY TRÌNH CHUNG Cơ chế hình thành SSR Cơ chế đột biến hình thành Microsatellites chưa hiểu biết cách đầy đủ Tuy nhiên có hai giả thuyết nhiều người chấp nhận do: a/ Sự bắt chéo lỗi trình giảm phân b/ Sự trượt lỗi trình mã III PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Tóm tắt quy trình Quy trình gồm giai đoạn bản: • Giai đoạn 1: Sử dụng thị phân tử liên kết chặt với locus hay gen đích để chọn lọc trực tiếp locus hay gen quy định tính trạng mong muốn từ cá thể quần thể • Giai đoạn (chọn lọc tái tổ hợp): Sử dụng thị phân tử quanh vùng locus gen, chọn lọc cá thể tái tổ hợp mang gen đích, giảm tối thiểu locus gen không mong muốn quang vùng gen đích • Giai đoạn 3: Sử dụng thị phân tử đa hình, không liên kết với gen đích 12 nhiễm sắc thể để chọn lọc cá thể có di truyền lớn giống nhận gen Bằng phương pháp giảm chí hệ lai lại so với chọn lọc lai lại truyền thống Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực Bước 1: Lai tạo F1 Phân tích đa hình di truyền hai giống bố mẹ nhận gen cho locus gen Saltol thị phân tử SSR Xác định cặp mồi đa hình phục vụ phân tích di truyền, chọn lọc cá thể quần thể phân ly Bước 2: Tạo BC1 F1, sử dụng thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể quần thể Bước 3: Lai tạo đánh giá kiểu gene BC2 F1 Quy trình chọn giống kết thúc Nếu ta chưa chọn BC2 F1 mang gần 100% gen di truyền nhận gen, ta phải tiếp tục bước Bước 4: Lai tạo đánh giá kiểu gen BC3 F1 Bước 5: Tự thụ cá thể BC3F1 Sử dụng thị phân tử liên kết gene xác định cá thể mang locus gen đích đồng hợp Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực Quy trình thực bước 1: - Xác định SSR - Xác định giống cho gen (Saltol) giống Fl478 giống lúa Bắc Thơm ( giống lúa trồng phổ biến ĐBSH làm nguồn gen nhận Thời kỳ lúa hoa, tiến hành chọn sinh trưởng khỏe, không sâu bệnh để tiến hành lai - Tách chiết DNA tổng số - Kiểm tra nồng độ độ tinh DNA tách chiết phương pháp điện di gel agarose - Khuyếch đại DNA kỹ thuật SSR-PCR Thiết kế mồi SSR nằm đầu gần kề với đoạn lặp lại - Điện di sản phẩm PCR gel polyacrylamide - Xác định thị phân tử liên kết Saltol đa hình giống lúa Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực  BƯỚC Sau chạy điện di ta thấy đa hình SSR Ta dựa vào kết chạy điện di xác định cá thể lai mang gen di hợp, đồng hợp Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực  BƯỚC Đoạn gen Saltol NST số lúa, vị trí xác định SSR marker Các thị đa hình vị trí locus gen Saltol Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực  BƯỚC Lai tao lai F1 với tổ hợp lai BT7 Fl478 Kết lai tạo thu 20 hạt lai F1 Hạt trồng nhà lưới Khi lúa tuần cá thể lai F1 đem lấy mẫu phân tích DNA Xác định xác lai F1 để phát triển tạo quần thể BC1F1 Sử dụng thị đa hình RM7643 để kiểm tra cá thể lai F1 Kết chạy điện di với RM7643 thu 17/20 cá thể F1 cho dị hợp tử (điểm H) cá thể ký hiệu: số 1, 2, 3, 4, 6, 7, , 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực  BƯỚC Sau chọn 17 cá thể lai F1 mang kiểu gen dị hợp giống Fl478 BT7 có băng DNA gel trùng với giống Fl478 BT7 , cá thể lai trở lại với giống BT7 để tạo quần thể BC1F1 Sử dụng hai thị phân tử liên kết chặt với gen đích RM493 (nằm phần Saltol) RM3412b (nằm phần Saltol) ,chọn lọc cá thể mang locus gen Saltol Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực  BƯỚC Các cá thể mang QTL Saltol ký hiệu H mang số thứ tự (điểm H): số 5, 6, 7, 10, 11, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 28, 29, 30, 32, 35, 36, 38, 41, 42, 45, 50, 54, 63, 64, 65, 70, 71, 73, 74, 75, 78, 80, 82, 83, 84, 88, 90, 94 Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực  BƯỚC - Lai tạo đánh giá kiểu gen BC2F1 - Những cá thể BC1F1 chọn lọc mang locus gen Saltol tiến hành lai trở lại với BT7 tạo quần thể BC2F1 - Có 141 cá thể BC2F1 lai tạo Để xác định cá thể mang locus gen Saltol quần thể BC2F1, hai thị phân tử liên kết chặt với Saltol RM493 RM3412 tiếp tục sử dụng để chọn lọc cá thể mang gen đích Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực  BƯỚC Kiểm tra kết chọn lọc cá thể tái tổ hợp quần thể BC2F1 Sử dụng thị là: RM1287, RM10694, RM562 RM7075 34 để kiểm tra xác định cá thể tái tổ hợp Xác định cá thể tái tổ hợp 34 cá thể mang locus gen Saltol Cá thể tái tổ hợp cá thể đồng hợp tử với giống nhận gen giống có vạch băng đồng hợp với băng giống nhận gen ký hiệu A Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực  BƯỚC Kết đánh giá di truyền cá thể mang locus gen Saltol quần thể BC2F1 Kết xác định cá thể mang locus gen Saltol có di truyền BT7 cao hệ BC2F1, thực với 43 thị cho đa hình không liên kết với vùng locus gen Saltol nhiễm sắc để lựa chọn di truyền nhận gen Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực  BƯỚC Đánh giá khả chịu mặn nhân tạo khả sinh trưởng phát triển dòng chịu mặn chọn tạo • Câu hỏi • Để chọn lọc khả chịu mặn, khả chịu hạn, khả kháng, sở khoa học cần biết gì? • Nêu quy trình chung cần thực để chọn lúa chịu mặn thị phân tử • Trình bày quy trình thực nhằm phân tích đa dạng di truyền xác định dòng mang gen chịu mặn Cần chuẩn bị hóa chất thiết bị để thực quy trình này? • ssr gì? Ý nghĩa đa hình gen? [...]... chọn nền di truyền của cây nhận gen Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện  BƯỚC 4 Đánh giá khả năng chịu mặn nhân tạo và khả năng sinh trưởng phát triển của các dòng chịu mặn được chọn tạo • Câu hỏi • Để chọn lọc được khả năng chịu mặn, khả năng chịu hạn, khả năng kháng, cơ sở khoa học đầu tiên cần biết là gì? • Nêu quy trình chung cần thực hiện để chọn. .. dụng sự đa hình này để chọn giống lúa chịu mặn trên nền di truyền Bắc Thơm 7 III PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Tóm tắt quy trình Quy trình gồm 3 giai đoạn cơ bản: • Giai đoạn 1: Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với locus hay gen đích để chọn lọc trực tiếp locus hay gen quy định... gen chịu mặn 6 Các điều kiện cần có : • • Mẫu lấy từ giống lúa thuần mang locus gen Saltol chịu mặn Thiết bị chuyên dụng cho phòng sinh học phân tử: máy PCR system 9700, máy đo pH, máy ly tâm, máy điện di,… III PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Dựa vào sự đa hình của SSR giữa các cá thể trong cùng một loài Ta áp dụng sự đa hình này để chọn giống lúa. .. đa hình giữa các giống lúa Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện  BƯỚC 1 Sau khi chạy điện di ta thấy sự đa hình của SSR Ta dựa vào kết quả chạy điện di có thể xác định được cá thể lai mang gen di hợp, đồng hợp Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện  BƯỚC 1 Đoạn gen Saltol trên NST số 1 của lúa, vị trí xác... với chọn lọc lai lại truyền thống Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện Bước 1: Lai tạo cây F1 Phân tích đa hình di truyền giữa hai giống bố mẹ nhận gen và cho locus gen Saltol bằng chỉ thị phân tử SSR Xác định các cặp mồi đa hình phục vụ phân tích di truyền, chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly Bước 2: Tạo cây BC1 F1, sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn. .. 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện  BƯỚC 2 Sau khi chọn được 17 cá thể lai F1 mang kiểu gen dị hợp giữa giống Fl478 và BT7 có 2 băng trên DNA trên gel trùng với giống Fl478 và BT7 , các cá thể này được lai trở lại với giống BT7 để tạo quần thể BC1F1 Sử dụng hai chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen đích... Saltol) ,chọn lọc cá thể mang locus gen Saltol Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện  BƯỚC 2 Các cá thể mang QTL Saltol ký hiệu H mang số thứ tự (điểm H): số 5, 6, 7, 8 10, 11, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 28, 29, 30, 32, 35, 36, 38, 41, 42, 45, 50, 54, 63, 64, 65, 70, 71, 73, 74, 75, 78, 80, 82, 83, 84, 88, 90, 94 Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống. .. định cá thể mang locus gen đích đồng hợp Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện Quy trình thực hiện bước 1: - Xác định SSR - Xác định được giống cho gen (Saltol) là giống Fl478 và giống lúa Bắc Thơm 7 ( giống lúa trồng phổ biến ở ĐBSH làm nguồn gen nhận Thời kỳ cây lúa ra hoa, tiến hành chọn cây sinh trưởng khỏe, không sâu bệnh để tiến hành lai - Tách chiết... gen đích Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện  BƯỚC 3 Kiểm tra kết quả chọn lọc các cá thể tái tổ hợp trong quần thể BC2F1 Sử dụng 4 chỉ thị là: RM1287, RM10694, RM562 và RM7075 34 để kiểm tra xác định cá thể tái tổ hợp Xác định cá thể tái tổ hợp của 34 cá thể mang locus gen Saltol Cá thể tái tổ hợp là cá thể đồng hợp tử với giống nhận gen là giống có... tại vị trí locus gen Saltol Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện  BƯỚC 2 Lai tao con lai F1 với tổ hợp lai BT7 và Fl478 Kết quả lai tạo đã thu được 20 hạt lai F1 Hạt này được trồng trong nhà lưới Khi lúa 2 tuần các cá thể lai F1 được đem lấy mẫu phân tích DNA Xác định chính xác con lai F1 để phát triển tạo quần thể BC1F1 Sử dụng chỉ thị đa hình RM7643 ... HIỆN Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Dựa vào đa hình SSR cá thể loài Ta áp dụng đa hình để chọn giống lúa chịu mặn di truyền Bắc Thơm III PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN Ứng dụng. .. thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Ứng dụng thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Tóm tắt quy trình Quy trình gồm giai đoạn bản: • Giai đoạn 1: Sử dụng thị phân... DNA - Phát đoạn SSR liên kết với gen chịu mặn  biết có hay gen chịu mặn  nhà chọn giống chủ động việc chọn lựa tổ hợp lai hiệu  chọn tạo giống chống chịu mặn nhanh II QUY TRÌNH CHUNG Cơ chế