ứng dụng KTPT trong chọn tạo giống lúa chịu mặn

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Dựa vào sự đa hình của SSR giữa các cá thể trong cùng một loài.. Quy trình gồm 3 giai đoạn cơ bản:• Giai đoạn 1: Sử dụn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG

KHOA KTNN & CNTP

Lớp ĐH CNSHK13

 :TS Đoàn Thị Ngọc Thanh

 SVTH: Nguyễn Duy Phương 013142049

Nguyễn Duy Phương 013142050 Đặng Thị Mỹ Duyên 013142089 Trần Minh Phúc 013142023

Lê Quang Tuân 013142018

Lê Thị Hồng Hiệp 013142035

 

KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo

giống lúa Bắc Thơm chịu mặn

ĐỀ TÀI

III PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

IV QUY TRÌNH BÀI BÁO

1 Lý do chọn đề tài

2 Quy trình

V ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM

VI KẾT LUẬN

a Lịch sử:

Kể từ khi chỉ thị DNA đầu tiên được phát triển và ứng dụng cho đến cuối những năm 90 của thế kỷ XX, hàng loạt chỉ thị DNA hay còn gọi là chỉ thị phân tử được ra đời đó là chỉ thị các chuỗi trình tự lặp lại đơn giản

- Chỉ thị phân tử SSR được ứng dụng thành công từ 1990 đến nay

- 1995: Trong cây lúa, có 185 marker đã được xác định trên 12 NST

- 1996: dùng để phát hiện gen có ích trong thực vật, sự liên hệ về huyết thống

- 1997: Những marker phân tử đã được dùng để xác định và đánh dấu các gen mong muốn

I TỔNG QUAN

1 Chỉ thị SSR.

b Khái niệm:

Microsatellite (hay chỉ thị vi vệ

tinh= Simple Sequence Repeates SSR)

là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn

giản, thường xảy ra một cách ngẫu nhiên

trong hầu hết genomic trên thực vật, gồm

những đơn vị lặp lại từ 2-6 nucleotid, các

kiểu lặp lại ngắn chỉ vài chục lần Do đó

SSR có thể khuyếch đại trong ống nghiệm

bằng phương pháp PCR

Kỹ thuật chỉ thị phân tử SSR được

nghiên cứu lần đầu tiên trên người và đến

nay nó được tìm thấy trong hầu hết các

Eukaryota khác.

1 Chỉ thị SSR.

I TỔNG QUAN

c Các loại SSR:

SSRs căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần – dinucleotide repeat) chúng ta có

trinucleotide hay dinucleotide được tìm thấy nhiều ở động vật có vú chủ yếu là GT/AC, ở

thực vật là AA/TT, AT/TA

Chúng ta có thể phân ra làm 3 loại:

• Hoàn hảo không có sự ngắt quãng trong trình tự phối hợp:

• Ngắt quãng bao gồm kết hợp nhiều loại lặp lại

• Ngắt quãng bị chèn bởi 1 hay nhiều base

I TỔNG QUAN

2 Giải pháp:

- Chỉ thị phân tử có bản chất: đa hình DNA.

- Phát hiện đoạn SSR liên kết với gen chịu mặn  biết được sự có hay không có gen chịu mặn  nhà chọn giống chủ động trong việc chọn lựa các tổ hợp lai hiệu quả  chọn tạo giống chống chịu mặn nhanh

1 Cơ chế hình thành SSR.

Cơ chế đột biến hình thành Microsatellites vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy

đủ Tuy nhiên có hai giả thuyết được nhiều người chấp nhận là do:

a/ Sự bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân.

1 Cơ chế hình thành SSR.

a Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân:

Cơ chế này giải thích cho những thay đổi lớn hơn trong số lần lặp lại

Nhiễm sắc thể B có nhiều sự lặp lại, và nhiễm sắc thể A thì có ít sự lặp lại do sự trao đổi chéo.

II QUY TRÌNH CHUNG

b Sự trượt lỗi trong

quá trình sao mã.

Sự trượt lỗi của enzyme

DNA polymerase trong

2 Cách xác định SSR.

1.Cắt nhỏ ADN genome bằng các enzym giới hạn

2.Phân tách các đoạn ADN bằng điện di trên gel agarose 1%, phân tách các đoạn từ 300- 500bp

3 Chuyển lên màng lai (nylon membral) theo nguyên tắc southernblot.

4 Dùng các mẫu dò là các đoạn ADN (tương ứng với trình tự Microsatellite) đã được đánh

dấu cho lai ghép với màng lai,

5 So sánh và khôi phục các vạch AND tương ứng với Microsatellite mà chúng ta quan tâm.

6 Chuyển vào một vector giải trình tự

7 Giải trình tự và xác định SSR cũng như trình tự ADN nằm ngoài trình tự SSR, đây là vùng để

thiết kế mồi.

8 Tổng hợp mồi và kiểm tra sự đa hình của Microsatellite Kích thước của các alen chỉ khác nhau từ hai nucleotide trở lên mặt khác trong quá trình tổng hợp PCR, polymeraza có thể tạo thêm hoặc có thể bỏ sót một đơn vị lặp lại một nucleotide.

II QUY TRÌNH CHUNG

Phương pháp nhuộm huỳnh quang và giải trình tự tự động

II QUY TRÌNH CHUNG

2 Cách xác định SSR.

Dựa vào hai đầu (vùng sườn)

của các đoạn lặp lại có trình tự rất đặc

biệt và giống nhau ở tất cả cá thể

trong cùng một loài,

II QUY TRÌNH CHUNG

3 Nguyên lý của SSR MARKER

Nhưng giữa các cá thể trong cùng một loài số lần lặp lại của đơn vị lặp lại

là khác nhau

Do đó, kích thước sản phẩm PCR cho phép phân biệt được sự giống và

khác nhau giữa các cá thể trong cùng loài.

II QUY TRÌNH CHUNG

3 Nguyên lý của SSR MARKER

+ EDTA 0,5M, pH = 8+ Nước cất

Dung dịch SDS Ethanol 96%

Ethanol 70%

Isopropanol alcoholChloroform: isomyl alcohol (24:1)Rnase

II QUY TRÌNH CHUNG

4 Hóa chất sử dụng

• Phản ứng SSR-PCR

Thành phần SSR – PCR

+ Nước cất+ Buffer 10X+ dNTP

+MgCl+ Primer +Taq- polymerase

Bind SilaneTEMED (tetramethylethylenediamine)Glacial acetic acid 5%

TBE 1X

II QUY TRÌNH CHUNG

• Mẫu lấy từ giống lúa thuần mang locus gen Saltol chịu mặn.

• Thiết bị chuyên dụng cho phòng sinh học phân tử: máy PCR system 9700, máy đo

pH, máy ly tâm, máy điện di,…

II QUY TRÌNH CHUNG

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo

giống lúa Bắc Thơm chịu mặn

Dựa vào sự đa hình của SSR giữa các cá thể trong cùng một loài Ta áp dụng sự đa hình này để chọn giống lúa chịu mặn trên nền di truyền Bắc Thơm 7

III PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo

giống lúa Bắc Thơm chịu mặn

III PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

Quy trình gồm 3 giai đoạn cơ bản:

• Giai đoạn 1: Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với locus hay gen đích để chọn lọc trực tiếp locus hay gen quy định tính trạng mong muốn từ các cá thể trong quần thể

• Giai đoạn 2 (chọn lọc tái tổ hợp): Sử dụng chỉ thị phân tử quanh vùng locus gen, chọn lọc cá thể tái tổ hợp mang gen đích, giảm tối thiểu các locus gen không mong muốn quang vùng gen đích

• Giai đoạn 3: Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình, không liên kết với gen đích trên 12 nhiễm sắc thể để chọn lọc cá thể có nền di truyền lớn nhất của giống nhận gen Bằng phương pháp này có thể giảm ít nhất là 2 nhưng có thể 3 thậm chí là 4 thế hệ lai lại so với chọn lọc lai lại truyền thống

Tóm tắt quy trình

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo

giống lúa Bắc Thơm chịu mặn

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo

giống lúa Bắc Thơm chịu mặn

Bước 1: Lai tạo cây F1 Phân tích đa hình di truyền giữa hai giống bố mẹ nhận gen và

cho locus gen Saltol bằng chỉ thị phân tử SSR Xác định các cặp mồi đa hình phục vụ

phân tích di truyền, chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly

Bước 2: Tạo cây BC1 F1, sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể trong quần thể Bước 3: Lai tạo và đánh giá kiểu gene các cây BC2 F1 Quy trình chọn giống kết thúc ở

đây Nếu ta chưa chọn được cây BC2 F1 mang gần 100% nền gen di truyền của cây nhận gen, ta phải tiếp tục bước 4

Bước 4: Lai tạo và đánh giá kiểu gen các cây BC3 F1.

Bước 5: Tự thụ các cá thể BC3F1 Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết gene xác định cá thể

mang locus gen đích đồng hợp

Các bước thực hiện

Quy trình thực hiện bước 1:

- Xác định SSR

- Xác định được giống cho gen (Saltol) là giống Fl478 và giống lúa Bắc Thơm 7 ( giống lúa trồng phổ biến ở ĐBSH làm nguồn gen nhận Thời kỳ cây lúa ra hoa, tiến hành chọn cây sinh trưởng khỏe, không sâu bệnh để tiến hành lai

- Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide.

- Xác định được chỉ thị phân tử liên kết Saltol và đa hình giữa các giống lúa.

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo

giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện

 BƯỚC 1

Sau khi chạy điện di ta thấy sự đa hình của SSR Ta dựa vào kết quả chạy điện di

có thể xác định được cá thể lai mang gen di hợp, đồng hợp

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo

giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện

 BƯỚC 1

Đoạn gen Saltol trên NST số 1 của lúa,

vị trí xác định của các SSR marker Các chỉ thị đa hình tại vị trí locus gen Saltol

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo

giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện

 BƯỚC 2

Lai tao con lai F1 với tổ hợp lai BT7 và Fl478

Kết quả lai tạo đã thu được 20 hạt lai F1 Hạt này được trồng trong nhà lưới Khi lúa 2 tuần các cá thể lai F1 được đem lấy mẫu phân tích DNA Xác định chính xác con lai F1 để phát triển tạo quần thể BC1F1.

Sử dụng chỉ thị đa hình RM7643 để kiểm tra các cá thể lai F1 Kết quả chạy điện di với RM7643 thu được 17/20 cá thể F1 cho dị hợp tử (điểm H) các cá thể được ký hiệu: số 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16,

17, 18, 19.

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo

giống lúa Bắc Thơm chịu mặn Các bước thực hiện

 BƯỚC 3

- Lai tạo và đánh giá kiểu gen các cây BC2F1

- Những cá thể BC1F1 đã được chọn lọc mang locus gen Saltol được tiến hành lai trở lại

với BT7 tạo quần thể BC2F1

- Có 141 cá thể BC2F1 được lai tạo Để xác định cá thể mang locus gen Saltol trong quần thể BC2F1, hai chỉ thị phân tử liên kết chặt với Saltol là RM493 và RM3412 tiếp tục được

Kiểm tra kết quả chọn lọc các cá thể tái tổ hợp trong quần thể BC2F1

Sử dụng 4 chỉ thị là: RM1287, RM10694, RM562 và RM7075 34 để kiểm tra xác định cá thể tái tổ hợp.

Xác định cá thể tái tổ hợp của 34 cá thể mang locus gen Saltol Cá thể tái tổ hợp là cá thể đồng hợp tử với giống nhận gen là giống có vạch băng đồng hợp với băng của giống nhận gen ký hiệu A

 BƯỚC 3

Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang locus gen Saltol trong quần thể BC2F1

Kết quả xác định cá thể mang locus gen

Saltol và có nền di truyền của BT7 cao nhất

trong thế hệ BC2F1, đã thực hiện với 43 chỉ thị

cho đa hình không liên kết với vùng locus gen

Saltol trên các nhiễm sắc để lựa chọn nền di

truyền của cây nhận gen

Các bước thực hiện

Ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo

giống lúa Bắc Thơm chịu mặn

• Câu hỏi

• Để chọn lọc được khả năng chịu mặn, khả năng chịu hạn, khả năng

kháng, cơ sở khoa học đầu tiên cần biết là gì?

• Nêu quy trình chung cần thực hiện để chọn lúa chịu mặn bằng chỉ thị phân tử.

• Trình bày quy trình thực hiện nhằm phân tích đa dạng di truyền và xác định dòng mang gen chịu mặn Cần chuẩn bị hóa chất và thiết bị gì để thực hiện quy trình này?

• ssr là gì? Ý nghĩa của sự đa hình gen?