Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose 20 1 2017

Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH TRƢỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KHOA HỌC CÂY TRỒNG ĐỀ CƢƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE TỪ RÁC THẢI HỮU CƠ Tiền Giang, tháng 12 năm 2016 Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH TRƢỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KHOA HỌC CÂY TRỒNG ĐỀ CƢƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE TỪ RÁC THẢI HỮU CƠ CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ĐẶNG THỊ MỸ DUYÊN VÕ THỊ NGỌC BÍCH MSSV: 013142089 NGUYỄN DUY PHƢƠNG MSSV: 013142049 LỚP DHCNSH13 Tiền Giang, tháng 12 năm 2016 Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN Võ Thị[A1] Ngọc Bích Duyên[A2][A3] SINH VIÊN THỰC HIỆN Đặng Thị Mỹ DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ KHÓA[A4] LUẬN ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Tiền Giang, ngày tháng [A5]năm 2017 CHỦ[A6] TỊCH HỘI ĐỒNG Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH MỤC LỤC[A7] CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc vấn đề môi trƣờng 2.2 Sơ lƣợc biện pháp xử lý rác thải 2.3 Tình hình nghiên cứu nƣớc nƣớc 2.3.1 Tình hình nghiên cứu nước 2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 2.4 Giới thiệu cellulose 2.5 Tổng quan phức hệ enzyme cellulase 2.6 Một số dòng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose 2.6.1 Vi khuẩn Bacillus sp 2.6.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp 2.6.3 Vi khuẩn Cellulomonas sp 10 2.6.4 Vi khuẩn Cytophara 11 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1.Phƣơng tiện 12 3.1.1.Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn có khả phân hủy cellulose 12 3.1.2 Giả thuyết nghiên cứu 12 3.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 12 3.1.4 Vật liệu hóa chất 12 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH 3.2.1.Thí nghiệm 1: Phân lập chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose 14 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh phức hệ enzyme cellulase cao 16 3.2.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian nuôi ủ pH môi trường ảnh hưởng đến khả phân hủy cellulose vi khuẩn 17 3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả phân hủy giấy photocopy dòng vi khuẩn 18 3.2.5 Thí nghiệm 5: Nhận diện số chủng vi khuẩn phương pháp giải trình tự 18 CHƢƠNG KẾT QUẢ DỰ KIẾN 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 22 Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH DANH SÁCH[A8] HÌNH Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subitilis Hình 2.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp[A9] .10 Hình 2.3 Vi khuẩn Cellumonas sp 10 Hình 2.4 Vi khuẩn Cytophaga sp 11 Hình 3.1 Quy trình phân lập vi khuẩn có khả phân hủy cellulose 12 Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Môi trƣờng phân lập nuôi cấy vi khuẩn CMC .13 Luận văn tốt nghiệp ĐH [A10] Chuyên ngành CNSH Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ô nhiễm môi trƣờng trở thành vấn đề cấp thiết đƣợc quan tâm hàng đầu tồn giới nói chung Việt Nam nói riêng Hằng ngày, lƣợng lớn rác thải từ nhà máy rác thải, xí nghiệp, nơng nghiệp, sinh hoạt gia đình khơng ngừng thải mơi trƣờng Đến năm 2015 Việt Nam thải 40 triệu rác thải (Bộ Tài Nguyên Môi trƣờng) Rác thải nguyên nhân gây biến đổi khí hậu, dịch bệnh, thủng tầng ozon… đặc biệt ảnh hƣởng trực tiếp đến kinh tế nƣớc nhà đời sống xã hội Một thành phần chủ yếu diện phần lớn nguồn rác thải Cellulose Cellulose thƣờng có mặt dạng nhƣ: phụ phẩm nông nghiệp (rơm, rạ, cây, vỏ lạc, vỏ trấu, vỏ thân ngô, xác loại lƣơng thực,…), phụ phế phẩm công nghiệp thực phẩm (vỏ xơ quả, bã mía, bã cà phê, bã sắn, hạt sơ ri,…), phụ phế phẩm công nghiệp chế biến gỗ (rễ cây, mùn cƣa, gỗ vụn, vỏ cây,…) chất thải gia đình (vải, giấy vụn, loại thùng giấy,…) Cellulose hợp chất cao phân tử đƣợc cấu tạo từ liên kết mắt xích -D- Glucose, thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật, khó phân hủy, việc xử lý cellulose từ rác thải hữu gặp nhiều khó khăn Các nhà khoa học khơng ngừng tìm cách xử lý tối ƣu lƣợng cellulose biên pháp vật lý, hóa học, sinh học nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng Hiện nay, để xử lý rác thải hữu dùng nhiều phƣơng pháp: chôn lấp, ủ phân compost, đổ đống tự nhiên… Những phƣơng pháp cịn nhiều hạn chế tốn thời gian, khơng đạt hiệu cao Vì việc xử lý cellulose biện pháp sinh học đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất, phƣơng pháp sử dụng vi sinh vật hệ enzyme vai trò chất phân hủy rác thải thành hợp chất đơn giản, độc hại, dễ xử lý, an tồn Đồng thời ứng dụng vi sinh vật để sản xuất phân bón hữu co Xuất phát từ thực tế này, chúng GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang thực đề tài “ Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose từ rác thải hữu cơ” 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập đƣợc số chủng vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác thải hữu Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn có khả sinh phức hệ enzyme cellulase cao Nhận diện số vi khuẩn có khả phân hủy cellulose từ rác thải hữu GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang -glucosidase nhóm enzyme phức tạp, chúng có khả hoạt động pH rộng (pH 4,4-4,8), trọng lƣợng phân tử 50-98kDa pI 8,4 hoạt động nhiệt độ cao Tên gọi khác -D-glucoside glucohydrolase, cellobiase Enzyme tham gia phân hủy cellobiose tạo thành glucose, khơng có khả phân hủy cellulose nguyên thủy 2.6 Một số dịng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose 2.6.1 Vi khuẩn Bacillus sp Đa số dòng vi khuẩn Bacillus sp có khả sinh nội bào tử hiếu khí, Gram dƣơng Đặc biệt Bacillus subtlis vi khuẩn khơng gây bệnh, có sức sống cao, dễ ni cấy có khả hình bào tử chịu nhiệt cao Ở điều kiện thích hợp, chúng có khả sản xuất lƣợng lớn enzyme cellulase Bacillus subtilis có khả phân hủy chất hữu lắng động đáy ao, tác động làm giảm đáng kể lớp bùn nhớt ao (Trần Thị Ánh Tuyết Trƣơng Quốc Huy, 2010) Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguồn: http://anabio.vn/gioi-thieu-loi-khuan-bacillus-subtilis) 2.6.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp Dòng vi khuẩn Pseudomonas sp vi khuẩn Gram âm, đa số hình que, chuyển động roi, khơng sinh bào tử, hơ hấp hiếu khí, có sinh độc tố toxin có khả tổng hợp enzyme cellulase mơi GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang trƣờng thích hợp Một số loài thƣờng gặp là: Pseudomonas aeruginosa, P putida, P fluorescens, P syringae,… Hình 2.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp (Nguồn: https://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas) 2.6.3 Vi khuẩn Cellulomonas sp Là vi khuẩn Gram dƣơng, hình que Chúng thƣờng phân hủy cellulose cách tiết enzyme endoglucanase exoglucanase (Trần Đình Toại) Quá trình trao đổi chất chúng hơ hấp, Cellulomonas thƣờng sử dụng glucose cellulase để làm nguồn dinh dƣỡng sản sinh GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 10 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang acid Hình 2.3.Vi khuẩn Cellulomonas sp (Nguồn: http://coryneforms.weebly.com/cellulomonas.html) 2.6.4 Vi khuẩn Cytophara Các giống vi khuẩn Cytophaga có tế bào đầu nhọn, khơng sinh vi kén, sống đất acid, trung tính kiềm Cytophaga vi khuẩn Gram âm, hình que , sinh trƣởng điều kiện hiếu khí, có khả phân hủy cellulose cao nhanh Vi khuẩn thƣờng đƣợc tìm thấy đất (Nguồn: https://voer.edu.vn) Hình 2.4 Vi khuẩn Cytophaga sp (Nguồn: https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Cytophaga_Flavobacterium) GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 11 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Phƣơng tiện 3.1.1.Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn có khả phân hủy cellulose 3.1.2 Giả thuyết nghiên cứu Nếu đề tài thành công phân lập đƣợc chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose từ rác thải hữu xác định đƣợc mật độ vi khuẩn thích hợp phân hủy cellulose điều kiện thí nghiệm 3.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu -Thời gian thực hiện: 1/2017 – 5/2017 -Địa điểm thực hiện: Tại phịng thí nghiệm khoa NN&CNTP 3.1.4 Vật liệu hóa chất -Vật liệu: +Rác thải hữu (rau, củ) huyện khác tỉnh Tiền Giang -Thiết bị, vật liệu, hóa chất +Thiết bị: Tủ cấy vi sinh vật vô trùng, tủ ủ vi sinh vật, nồi khử trùng nhiệt ƣớt, máy lắc mẫu, máy đo quang phổ, máy đo pH, cân điện tử, máy ly tâm, micropipette, ống nghiệm, đĩa petri… Một số dụng cụ khác nhƣ: que cấy, bình tam giác, que trải thủy tinh, ống đong, đèn cồn… GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 12 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang *Môi trƣờng: Bảng 1: Môi trƣờng phân lập nuôi cấy vi khuẩn (Han Srinivasan, 1968) Thành phần Khối lƣợng (g) CaCl2 0,05 MgSO4 0,1 KH2PO4 0,5 K2HPO4 0,5 (NH4)SO4 1,0 NaCl 6,0 CMC (Carbon Mymethyl Cellulose) 20 Agar 20 Nƣớc cất lít + Mơi trƣờng M: Mơi trƣờng M gồm: 0,4g KH2PO4, 0,4g K2HPO4, 1gNH4Cl, 0,1g MCl2, 0,2g Yeast extract, 6g NaHCO3, 0,5g Cysteine-HCl, 0,25g Na 2S, 0,001g Resazarin, 10ml dung dịch khoáng, 10ml dung dịch vitamin, 20g Agar, thêm nƣớc đến thể tích 1lít điều chỉnh pH7 (Lee et al., 2002) · Dung dịch khoáng gồm: 4,5g Nitrilotriacetic, 0,4g FeCl 2, 0,12g CoCl 2, 0,01g Al(SO4)2, 1g NaCl, 0,02g CaCl2, 0,01g Na 2MoO 4, 0,1g MnCl2, 0,1g ZnCl2, 0,01g H3PO3, 0,01g CuSO 4, 0,02g NiCl2, thêm nƣớc đến thể tích 1lít Dung dịch vitamin gồm: 2mg Biotin, 2mg Folic acid, 10mg Pyridoxine hydrochloride, 5mg Thiamine, 5mg Riboflavin, 5mg Nicotinic, 5mg Dl-calcium pantothenate, 0,1mg B12, 5mg D-amilobenzoic, 5mg Lipoic, thêm nƣớc đến thể tích 1lít +Hóa chất:  Thuốc thử Congo Red  Hóa chất nhuộm Gam: Crystal Violet, Cồn 70o, Iod, Fushin GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 13 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang  Hóa chất chạy PCR, chạy điện di 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1.Thí nghiệm 1: Phân lập chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose  Mục tiêu: Phân lập đƣợc số chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose có dịch rác thải  Các bước tiến hành: - Chuẩn bị môi trường phân lập: Môi trƣờng phân lập vi khuẩn (Han Srinivasan, 1968) sau đƣợc pha theo thành phần khối lƣợng chất khử trùng nhiệt ƣớt 121oC, áp suất atm 20 phút Sau khử trùng, tiến hành phân phối môi trƣờng vào đĩa petri khử trùng chiếu xạ tia UV(10 phút).Trữ mẫu vào tủ lạnh chƣa sử dụng - Trải mẫu cấy chuyển: Sau lấy mẫu trực tiếp từ bãi rác Tiến hành pha loãng mẫu Mẫu đƣợc phân lập theo quy trình: GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 14 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang Thu mẫu Trộn Pha loãng mẫu 10-0-10-4 Hút 100 l Cấy trãi môi trƣờng CMC Ủ 48 giờ, 30oC điều kiện hiếu khí kỵ khí Chọn khuẩn lạc rời Cấy chuyển đến vi khuẩn lạc Kiểm tra độ Trữ mẫu Hình 3.1 Quy trình phân lập vi khuẩn có khả phân hủy cellulose Mỗi nồng độ pha loãng cấy trải đĩa, hai đĩa ủ điều kiện hiếu khí (một đĩa 30oC, đĩa 55oC), hai đĩa lại ủ điều kiện kỵ khí (một đĩa 30oC, đĩa 55oC) Chọn khuẩn lạc đặc trƣng, cấy chuyền vi khuẩn rịng đƣợc cấy sang ống nghiệm môi trƣờng đặc tƣơng ứng để trữ mẫu 4oC đƣợc xem nhƣ chủng Sau phân lập ta tiến hành quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc, đo kích thƣớc khuẩn lạc sau 24 ni cấy Đồng thời quan sát hình dạng tế bào dƣới kính hiển vi khả chuyển động vi khuẩn GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 15 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang * Các bước nhuộm Gram vi khuẩn: (Nguồn: Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2009) Chuẩn bị tiêu : - Nhỏ giọt nƣớc cất khử trùng lên lame - Dùng que cấy lấy vi khuẩn cho vào giọt nƣớc - Hơ nóng mặt dƣới lame lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn Nhuộm tiêu bản: - Nhỏ 1-2 giọt Crystal Violet từ mẫu cố định, để phút Rửa nƣớc từ 2-3 giây, chậm nhẹ cho khô bớt nƣớc Nhỏ dung dịch Iod, để phút Rửa nƣớc cất, chậm nhẹ Rửa cồn 70° thật nhanh để tẩy màu giọt cồn cuối khơng cịn màu tím Rửa nƣớc vài giây, chậm nhẹ giấy thấm Nhỏ 1-2 giọt Fushin, để phút Rửa nƣớc vài giây, chậm nhẹ giấy thấm Quan sát dƣới kính hiển vi Quan sát dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 40 lần ghi nhận Gram vi khuẩn Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh Crystal violet mẫu Gram dƣơng, có màu hồng đỏ Fushin mẫu Gram âm * Thử nghiệm catalase: - Lấy khuẩn lạc 18-24h tuổi đặt lên lam kính Nhỏ giọt H2O2 3% phủ lên vi khuẩn quan sát tạo thành bọt khí - Kết quả: Bọt khí sủi mạnh nhanh catalase (+) Một số vi khuẩn catalase nhƣng có khả phân hủy H2O2 tạo thành bọt khí nhỏ chậm 30 giây, khơng phải catalase (-) 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh phức hệ enzyme cellulase cao  Mục tiêu: Bƣớc đầu đánh giá khả phân hủy cellulose chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ dịch rác thải Chọn số chủng có hoạt tính enzyme cellulase cao làm sở khảo sát cho thí nghiệm sau  Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí cách ngẫu nhiên, nhân tố chủng vi khuẩn, lần lặp lại GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 16 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang  Các bước tiến hành: Sử dụng phƣơng pháp đục lỗ thạch đĩa môi trƣờng thử hoạt tính enzyme cellulose Dùng dụng cụ đục lỗ thạch khử trùng có đƣờng kính 5mm đục lỗ môi trƣờng, đĩa lỗ Sau 48 đƣợc nuôi tăng sinh 10 ml môi trƣờng lỏng ( Han Srinivasan) vi khuẩn hiếu khí máy lắc, 150 vòng/ phút gần 20ml dịng vi khuẩn điều kiện kỵ khí, mức nhiệt độ 30oC 55oC, tiến hành đếm mật số tế bào vi khuẩn * Kiểm tra hoạt tính enzyme cellulase Song song với q trình đếm mật số, tiến hành thử hoạt tính enzyme cellulase phƣơng pháp đục lỗ thử với thuốc thử Congo Red Hút 40μl dung dịch môi trƣờng nuôi vi khuẩn, nhỏ vào đĩa thạch đƣợc đục lỗ Ủ khoảng 24 30oC 55oC tƣơng ứng với chủng phân lập điều kiện thí nghiệm 1; mẫu kỵ khí đƣợc ủ bình kỵ khí Sau nhuộm thuốc thử Congo Red đo đƣờng kính vịng trịn thủy phân (Trần Thị Ánh Tuyết Trƣơng Quốc Huy, 2010) Quan sát ghi nhận đƣờng kính vịng trịn thủy phân, chọn chủng có hoạt tính enzyme cellulase cao :4 chủng vi khuẩn hiếu khí (2 chủng bình nhiệt chủng ƣa nhiệt), chủng kỵ khí (2 chủng bình nhiệt chủng ƣa nhiệt) Các chủng đƣợc chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.Chỉ tiêu quan sát: đƣờng kính vịng trịn thủy phân sau nhuộm với Congo Red 3.2.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian nuôi ủ pH môi trường ảnh hưởng đến khả phân hủy cellulose vi khuẩn  Mục tiêu: Xác định thời gian nuôi ủ pH môi trƣờng thích hợp cho tổng hợp enzyem cellulase cao  Bố trí thí nghiệm - Thời gian: Thí nghiệm đƣợc bố trí cách ngẫu nhiên, theo thể thức nhân tố dòng vi khuẩn thời điểm 24; 36; 48; 60 giờ, lần lặp lại Tiến hành: Chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase cao qua thí nghiệm để khảo sát thời gian, pH tối ƣu Cấy mẫu vào đĩa chứa môi trƣờng CMC Ủ mẫu điều kiện thích hợp.Thí GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 17 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang nghiệm đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch tƣơng tự nhƣ thí nghiệm 2, tƣơng ứng với nghiệm thức thời gian nuôi ủ - pH: Thí nghiệm đƣợc bố trí cách ngẫu nhiên, theo thể thức nhân tố dòng vi khuẩn pH với mức độ 6,5; 7; 7,5; 8; lần lặp lại Tiến hành:Chọn dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase cao qua thí nghiệm để khảo sát pH tối ƣu Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch tƣơng tự nhƣ thí nghiệm 2, tƣơng ứng với nghiệm thức thời gian nuôi ủ Sau khảo sát điều kiện thời gian pH nuôi cấy ta chọn chủng vi khuẩn để làm thí nghiệm 3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả phân hủy giấy photocopy dòng vi khuẩn  Mục tiêu:Đánh giá khả phân hủy chủng vi khuẩn với co chất giấy photocopy  Tiến hành: Chọn chủng nuôi 50ml môi trƣờng Mfp lỏng (0,1g giấy photocopy xay mịn/ 50ml môi trƣờng M) Nguồn giống chủng đƣợc nuôi môi trƣờng CMC lỏng ngày, chủng với tỉ lệ 1% Sau ngày đánh giá khả phân giải dựa khối lƣợng khô giấy photocopy Cơng thức tính khả phân giải: (Khối lƣợng ban đầu – Khối lƣợng lúc sau)/Khối lƣợng ban đầu x 100 3.2.5 Thí nghiệm 5: Nhận diện số chủng vi khuẩn phương pháp giải trình tự Sau đánh giá khả phân hủy chủng vi khuẩn chọn chủng để giải trình tự nhận diện  Mục tiêu: Nhận diện đƣợc số chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme cenllulase cao từ thí nghiệm  Tiến hành: Chọn dịng vi khuẩn,tiến hành ly trích DNA dịng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn khuếch đại DNA kỹ thuật PCR với cặp mồi: 27f: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’; GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 18 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang 1492r: 5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’ (Akasaka et al., 2002[A12]) Sản phẩm sau đƣợc khuếch đại đƣợc điện di agarose gel 1,2% điện di chiều có bổ sung thêm SYBR-GREEN để kiểm tra sản phẩm Cuối giải trình tự đoạn DNA đƣợc khuếch đại Đƣợc kết quả, dùng chƣơng trình BLAST N để so sánh trình tự đoạn DNA dịng vi khuẩn với trình tự DNA lồi vi khuẩn có ngân hàng liệu NCBI, nhận diện dòng vi khuẩn GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 19 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang CHƢƠNG KẾT QUẢ DỰ KIẾN - Phân lập đƣợc số chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose từ rác thải hữu -Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn có khả sinh phức hệ enzyme cellulase cao ổn định - Nhận diện số vi khuẩn có khả phân hủy cellulose từ rác thải hữu GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 20 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang KẾ HOẠCH THỰC HIỆN STT Nội dung, công việc Viết báo cáo đề cƣơng Thu mẫu rác thải hữu Mẫu rác hữu có chứa bãi rác (Mỹ Tho, Từ 15-2 đến 18vi sinh vật phân hủy Nhị Bình, Thị xã Gị 2-2017 cellulose Cơng) Phân lập Thí nghiệm Tuyển chọn vi khuẩn phân hủy cellulose[A13] Thí nghiệm 2, Định danh dịng vi khuẩn phân lập đƣợc Sản phẩm Thời gian Từ 7-12 đến 7-2 Phân lập đƣợc chủng VK (nhận diện khuẩn lạc, hình dạng tế bào, nhuộm Gram) Chọn đƣợc chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose cao Nhận diện đƣợc số (Lý trích DNA, thực chủng vi khuẩn phân phản ứng PCR) hủy cellulose Từ 15/2/17 – 31/3/17 Từ 21/4/17 – 15/5/17[A14] Từ 16/5/17 – 20/5/17 Gửi mẫu giải trình tự 20/5/17-31/5/17 Xử lý số liệu, viết báo cáo Từ 1-6 đến 306-2017 GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 21 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tài liệu tiếng việt Hoàng Hải Dƣ Ngọc Thành, 2008 Giáo trình vi sinh vật đại cƣơng Đại học Thái Nguyên NXB Hà Nội Nguyễn Đức Lƣợng Nguyễn Hữu Phúc 1996 Công nghệ vi sinh vật tập sinh học công nghiệp Nhà xuất Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh, trang 189 Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền Nguyễn Ánh Tuyết 2003 Thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học T2 Thí nghiệm Vi sinh vật học NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lƣợng 2004 Công nghệ enzyme Nhà xuất Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, trang 34-45 Võ Văn Phƣớc Quệ Cao Ngọc Điệp 2011 Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose Tạp chí khoa học 2011:18a 177-184 Trần Đình Toại , Trần Thị Hồng 2007 Tƣơng lai ứng dụng Enzyme xử lý phế thải Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23 (2007) 75-85 Nguyễn Thị Thanh Trúc 2010 Tuyển chọn khảo sát điều kiện nuôi cấy dịng vi khuẩn hiếu khí có khả thủy phân bã mía Luận văn tốt nghiệp Đại học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Cần thơ Trần Thị Ánh Tuyết Trƣơng Quốc Huy 2010 Khảo sát điều kiện nuôi cấy chiết tách enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis Tuyển tập báo cáo hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học lần thứ 7, Đà Nẵng, 378-384 *Tài liệu tiếng anh Awais, M., A.A Shah, A Hameed and F Hasan 2007 “Isolation, identification and optimization of bacitracin produced by Bacillus sp” Pak J Bot 39, pp.1303-1312 Chung, S., H Kong, J.S Buyer, D.K Lakshman, J Lydon, S.D.Kim and D.P.Roberts 2008 “Isolation and partial characterization of GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 22 Luận văn tốt nghiệp ĐH Trƣờng ĐH Tiền Giang Bacillus subtilis ME488 for suppression of soilborne pathogens of cucumber and pepper” Appl Microbiol Biotechnol 80, pp.115–123 Deschemps F and M.C Huet 1985 “Xylanase production in solidstate fermenttation: A study of its properties” Appl Microb Biotechnol 22, pp.177-180 Hyungjae, L and H.Y Kim 2011 “Lantibiotics, Class I Bacteriocins from the Genus Bacillus” J Microbiol Biotechnol 21, pp.229–235 Han,Y.Z and V.R Srinivasan 1968 “Isolation and Characteration of a Cellulose Utilizing Bacterium” Applied Microbiology 36, pp.11401145 Hedricks, C.W., J.D.Doyle and B Hugley 1995 “A New Solid Medium for Enumerating Cellulose Utilizing Bacteria in Soil” Applied and Environmental Microniol 61, pp.2016-2019 Lutzen N.V and M H Nielson 1983 “Cellulose and their application in the forming converson of lignocellulose to fermentable surgurs” Phil Trans R Soc., London 300, pp.283-291 GVHD: Võ Thị Ngọc Bích Trang 23 ... khuẩn phân phản ứng PCR) hủy cellulose Từ 15 /2 /17 – 31/ 3 /17 Từ 21/ 4 /17 – 15 /5 /17 [A14] Từ 16 /5 /17 – 20/ 5 /17 Gửi mẫu giải trình tự 20/ 5 /17 - 31/ 5 /17 Xử lý số liệu, vi? ??t báo cáo Từ 1- 6 đến 306 -2 01 7 GVHD:... lập đƣợc số chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose từ rác thải hữu -Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn có khả sinh phức hệ enzyme cellulase cao ổn định - Nhận diện số vi khuẩn có khả phân hủy cellulose. .. đến 1 8vi sinh vật phân hủy Nhị Bình, Thị xã Gị 2 -2 01 7 cellulose Cơng) Phân lập Thí nghiệm Tuyển chọn vi khuẩn phân hủy cellulose[ A13] Thí nghiệm 2, Định danh dòng vi khuẩn phân lập đƣợc Sản phẩm