thực hành sinh học phân tử

Bước 2: Ngâm mẫu lá cả chối và chày trong nitơ lỏng 10’ để tế bào giòn, dễ vỡ.Tạo nhiệt độ lạnh làm hạn chế enzyme nuclease hoạt động, đồng thời bảo vệ DNA phóngthích từ nhân không bị ti

Trang 1

MỤC LỤC

Trang 2

Ly trích DNA tổng số từ lá cây đậu nành có độ tinh sạch cao, hàm lượng đủ lớn.Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu bằng phương pháp RAPD từ đóứng dụng trong việc lựa chọn các cây bố mẹ trong lai tạo giống mới.

1.2 Đối tượng: Lá đậu nành.

II Quy trình

Nguyên tắc tách chiết DNA từ tế bào thực vật là như nhau Tùy từng loại mẫu , tùy từngmục đích nghiên cứu và điều kiện phòng thí nghiệm có thể sử dụng các kỹ thuật táchchiết với các loại hóa chất và dung môi khác nhau

1 Các phương pháp tách chiết DNA thường dùng gồm:

+Phương pháp CTAB

+Phương pháp PVP

+Phương pháp phenol/chloroform

Trang 3

+ Phương pháp Silica.

+Phương pháp Guannidine-chloroform

Trong phạm vi bài thực hành ta thực hiện cách tách chiết DNA tổng số từ lá câyđậu nành theo phương pháp CTAB (Cetyl threemetyl ammonium bromide) Nguyên tắccủa phương pháp dựa trên cơ sở sử dụng kết hợp cơ học là nghiền và các hóa chất để phá

vỡ màng nhân, tạo thành hỗn hợp đựng trong các ống Ependorp Đồng thời kết hợp lytâm để tách, các hóa chất và loại bỏ những thành phần không mong muốn, từ đó thu nhậnDNA

2 Quy trình ly trích DNA tổng số

Mục đích: Phân lập được DNA tổng số có độ tinh sạch cao, hàm lượng đủ lớn, ít bị đứtgãy để phục vụ cho các nghiên cứu về di truyền bộ gen của sinh vật

Quy trình ly trích DNA cụ thể gồm các bước sau:

Bước 1: Mẫu lá đậu nành được lau bằng cồn 70%, gói giấy bạc

Bước 2: Ngâm mẫu lá cả chối và chày trong nitơ lỏng 10’ để tế bào giòn, dễ vỡ.Tạo nhiệt độ lạnh làm hạn chế enzyme nuclease hoạt động, đồng thời bảo vệ DNA phóngthích từ nhân không bị tiêu hủy bởi các protease trong tế bào Tế bào thực vật có váchcellulose khó vỡ hơn tế bào động vật và vi sinh vật

Trang 4

Bước 3: Nghiền lá nhanh tránh mẫu bị hút ẩm trở lại Trong quá trình nghiền tathêm nitơ lỏng vào nhằm mục đích ức chế các enzyme gây biến tính DNA của lá, mẫuđược nghiền cho đến khi thành bột mịn.

Bước 4: Chuyển khoảng 100mg bột mịn vào tube 1.5ml

Bước 5: Thêm 1ml EB buffer Trong thành phần của EB có EDTA pH=8 làmezyme nuclease hoạt động ít nhất Enzyme nuclease hoạt động phải có Mg2+ mà EDTA

có tác dụng gắn ion Mg2+ làm enzyme này hạn chế hoạt động, DNA được bảo vệ Chovào thêm 50 SDS 10% ( trong SDS có bổ sung có tác dụng ngăn cản enzyme polyphenoloxidase bảo vệ được DNA

Polyphenol Quinon (liên kết DNA làm mất DNA).enzyme polyphenol Oxidase

Trang 5

Bước 6: Đem ủ mẫu ở 65oC trong 30 phút ( để tế bào hoàn toàn bị phá vỡ), khoảng 5phút đảo nhẹ để trộn đều mẫu.

Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút để tủa protein và mảnh vỡ tế bào ta thudịch trong

Bước 8: Chuyển 700 phần trong vào tube mới và thêm 700 isopropanol (isopropanol giúptủa DNA)

Bước 9: Tiếp tục đem ủ ở -20oC khoảng 30 phút (có thể ủ đến 2h) bằng khay nước đá đểtủa DNA (Isopropanol tủa lạnh sẽ nhanh hơn)

Bước 10: Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút thu kết tủa

Trang 6

Bước 11:Hòa tan kết tủa trong 400 TE buffer ( làm tan tủa giúp DNA không bị biến tính,bất hoạt enzyme nuclease Trong thành phần của TE có Tris và EDTA pH=8 tạo môitrường kiềm bảo vệ DNA).

Bước 12: Thêm 1enzyme RNAase 10mg/ml ủ ở 37oC trong 10 phút ( để loại RNA nếucần thiết có thể bỏ qua bước này)

Bước 13: Thêm 400 CTAB buffer và ủ ở 65oC trong 15 phút, đảo ngược tube 5 phút đểtrộn mẫu ( thu DNA và loại polysaccharide)

CTAB: Chất tẩy rửa dùng để phá vỡ màng tế bào, bào mòn màng tế bào.Màng tế bào là lớp kép phospholipid, CTAB làm biến tính protein, phospholipid bị hòatan

CTAB: có khả năng liên kết thuận nghịch với DNA và polysaccharide

Ở nồng độ muối > 1,4 M phức hợp CTAB-DNA ở trạng thái hòa tan Phứchợp CTAB-polysaccharide kết tủa, phức này sẽ được loại đi ở bước ly tâm đầu tiên

Ở nồng độ muối < 0,7M phức CTAB-DNA kết tủa, sẽ cho phép thu hồi lạiDNA ở bước tủa cồn

Ở nồng độ muối rất thấp phức CTAB-DNA sẽ tách nhau ra Phức này sẽtách ra gần như hoàn toàn trong bước rửa cồn bằng 70o

Trang 7

Bước 14: Thêm 800 Chloroform/ Isoamylalcohol (24:1) và lắc trộn đều.

Chloroform không tan trong nước, loại bỏ các tạp chất không mong muốntrong dung dịch như protein, làm biến tính protein, không hòa tan nucleic acid

Isoamylalcohol là một ancohol với sự có mặt của cation hóa trị 1 (Na+, K+,

NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA, tạo thành lớp màng ngăn pha

Bước 15: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

Sau khi ly tâm dung dịch chia ra thành 3 lớp: Lớp thứ nhất là phần dịch trong ở trên cùng

có chứa DNA, lớp thứ 2 là một lớp protein, lớp kế tiếp có chứa chloroform và tất cảnhững thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…)

Trang 8

Bước 16: Chuyển cẩn thận từ từ 500 dung dịch phía trên qua tube 1,5ml mới, thêm 1mlEthanol 96% dùng để tủa DNA và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme (bướcnày không dùng isopropanol được vì isopropanol sẽ tủa luôn muối).

Bước 17: Sau đó đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Ủ để sự tủa DNA được thực hiệnmột cách tốt nhất

Trang 9

Bước 18: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, đổ bỏ phần trong và rửa phần cặn với

400 ethanol 70%, rửa lặp lại 2 lần để loại muối ra khỏi DNA, CTAB và DNA tách rahoàn toàn

Bước 19: Ly tâm lần nữa để loại bỏ ethanol Phơi khô DNA ở 37oC trong 15 phút tránhtrường hợp mẫu DNA còn chứa ethanol sẽ ảnh hưởng tới kết quả

Bước 20: DNA sau khi phơi khô được hòa tan trong 100 TE buffer,để hòa tan tủa và bảo

Trang 10

Khi bổ sung CTAB ủ ở 65oC trong 15 phút, CTAB hoạt động mạnh hiệu quả ởnhiệt độ khoảng 60-70oC, mạnh hơn khi có ái lực cơ học tác động vào ( CTAB hoạt độngtrong trường hợp có NaCl)

+ Chloroform/ Isoamyalcohol bổ sung để tách chiết DNA, loại bỏ Protein và cácthành phần khác không mong muốn

+ Isoamyalcohol: Hỗ trợ sự phân pha ( 3 pha)

-Pha trên : DNA-Pha giữa: Protein-Pha cuối: chứa xác cặn tế bào và dung dịch chloroform

Rửa tủa bằng cồn 70% không sử dụng nước cất để rửa vì DNA bị hòa tan trongnước không hòa tan trong cồn Nếu tủa lẫn muối: Muối hòa tan trong cồn 70% , cồn100% muối không tan, cồn kết tủa cả protein vì vậy khi rửa tủa bằng cồn xong thì hút hếtcồn và làm bay hơi hết cồn Nếu còn cồn sẽ làm biến tính enzyme không thực hiện đượccác phản ứng sinh học tiếp theo

Hòa tan DNA bằng TE 1X có thể hòa tan tủa DNA, rửa tủa bằng TE 1X hiệu quảhơn có thể bảo quản được lâu, TE bảo quản tốt nhất vì có chứa EDTA ái lực với ion kimloại hóa trị II, bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của enzyme giúp bảo quản được lâu Hạnchế của TE là khi có sự có mặt của EDTA ức chế các enzyme các phản ứng sinh họcphân tử sau này Cho nên sử dụng TE ở nồng độ loãng, nếu không sẽ ức chế các phảnứng sinh học sau này

III/ Phân tích DNA ly trích

Đo OD

Đo OD ở bước sóng 260nm và 280nm với hệ số pha loãng 10 lần

Nhằm kiểm tra chất lượng DNA có tinh sạch chưa, định lượng được nồng độ DNA.DNA được xem là sạch nếu tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,82

Trang 11

4 0,5024 4 0,1166 4,31

Hàm lượng DNA trong mẫu sau khi pha loãng

[DNA]= Giá trị mật độ quangx 50 x hệ số pha loãng (ng/ml)

Mẫu 1: Tỉ lệ OD260nm/OD280nm >2 nhiễm chloroform

Mẫu 2: Tỉ lệ OD260nm/OD280nm <1,8 nhiễm protein

Mẫu 3: Tỉ lệ OD260nm/OD280nm < 1,8 nhiễm protein

Mẫu 4: Tỉ lệ OD260nm/OD280nm >2 nhiễm chloroform

Do đó: trong tất cả các mẫu không có mẫu nào chứa DNA tinh sạch

Nguyên nhân:

Trang 12

Mẫu bị nhiễm là do ở giai đoạn mẫu sau khi ly tâm bị tách ra thành 3 lớp, một lớpdịch trong rồi tới một lớp protein và cuối cùng là lớp có chứa chloroform; sau đó hútphần dịch trong ở phía trên cho qua một ống tube mới, nhưng trong thao tác này chúng ta

đã để đầu côn chạm đến màng protein hay làm vỡ màng protein nên đã có một lượngprotein nhiễm vào mẫu DNA

Hay do trong quá trình tủa DNA bằng isopropanol ở -20oC protein cũng tủa theolàm cho mẫu DNA bị nhiễm protein

Do quá trình loại bỏ protein, tủa protein không sạch

Quá trình ly trích DNA không đạt: phá vỡ tế bào, màng nhân không đạt yêu cầu,tủa DNA không hoàn toàn

DNA có thể bị biến tính không bảo vệ tốt do thao tác

Kết quả: Quá trình trích ly DNA không thành công

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

Chuẩn bị hóa chất

Mục đích

Khuếch đại trình từ DNA sau quá trình tách chiết, sử dụng đoạn mồi RADP để kiểm tra

sự đa hình của cây đậu nành (ngoài những băng giống nhau có xuất hiện những băngkhác), kiểm tra cấu trúc, trạng thái của đoạn DNA trong genome

Sau khi pha trộn 3 chất trên vào một tube, trộn đều hỗn hợp trên Mỗi nhóm hút ra 23 và

2 DNA mẫu của nhóm cho vào một PCR tube để chạy PCR

Trang 13

Cho từng tube vào mỗi các giếng trên máy PCR Thiết lập chương trình chạy 30 chu kỳsau.

Do nhiệt độ gắn mồi của RADP được thiết kế là ở 39,9oC nên ta chỉnh nhiệt độ bắt mồixuống 40oC (chứ không phải ở nhiệt độ 32oC)

Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di

Mục đích điện di

Điện di DNA trong gel agarose là kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng và hàm lượngDNA Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của axit nucleic là đạiphân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một diệntrường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường

Trang 14

Lượng DNA quá ít, DNA bị đứt gãy, không nguyên vẹn nên vạch không nhìn thấyquá mờ

DNA không tinh sạch bị lẫn tạp protein, chloroform

*Giải thích:

+ Do thiếu mồi

+Do quá trình thao tác làm mất DNA

+ Không thấy được thang chuẩn để so sánh

+ Do thời gian kéo dài không lâu mồi bắt cặp không đầy đủ

+ Bước 19: Sau khi tủa để khô DNA màu trắng đục, thêm TE vẫn trắng đụcnhiễm polysaccharide

+ Quá trình ly trích DNA không tốt: DNA bị nhiễm Protein, Chloroform,polysaccharide; quá trình tủa DNA không hoàn toàn

+ Quá trình phá vỡ tế bào, phá vỡ màng nhân có thể không xảy ra hoàn toàn làmDNA không được giải phóng

+ DNA có thể bị biến tính do thao tác, quá trình bảo vệ không tốt trước DNAse.+ DNA có thể bị đứt gãy trong quá trình ly trích, dẫn đến quá trình PCR tạo ra sảnphẩm ít (có thể bị đứt gãy tại vị trí gắn mồi, vị trí Taq polymerase bám vào, đứt gãy trênđoạn DNA mục tiêu cần khuếch đại)

Thiếu bước rửa muối bằng cồn 70oC

Biện pháp khắc phục

Cần nghiên cứu với lượng mẫu lớn hơn

Trang 15

Cẩn thận trong thao tác: hút dịch nổi, hút hóa chất, thực hiện trong điều kiệnlạnh…

Cần loại bỏ tạp chất kỹ, tránh nhiễm protein, chloroform…

Cần có mẫu đối chứng nội

IV/ Đánh giá đa dạng di truyền bằng RADP

Mục đích

Phân tích đa dạng di truyền để xem mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu xa hay gần.Mối quan hệ xa nhau sẽ tạo ưu thế lai cao hơn từ đó ứng dụng trong việc lựa chọn cáccây bố, mẹ trong lai tạo giống mới

Sơ đồ cây phát sinh loài cho thấy, các giống đậu khảo sát chia thành 2 nhóm với mức tương đồng gen biến thiên từ 0,69 đến 0,98 Điều này cho thấy các giống đậu có sự đa dạng cao về mặt di truyền

Nhóm I gồm giống L18, nhóm II gồm các giống còn lại Trong đó mức tương đồng gen giữa nhóm I và nhóm II là 0,69 Điều này cho thấy giữa giống L18 và các giống còn lại

có sự khác biệt tương đối xa

Nhóm II phân thành 2 nhóm nhỏ Nhóm 2A gồm 2 giống L14 và MĐ7 Nhóm 2B là 2 giống còn lại

2B

2 A Nhóm II

Nhóm I

Trang 16

Mức độ tương đồng gen giữa nhóm 2A và 2B này khoảng 0,85 đều này chứng tỏ 2 nhánhnày có cùng nguồn gốc, nhưng do sự biến đổi gen cũng như yếu tố môi trường sống khiến chúng có sự khác biệt.

Trong nhánh 2A có 2 giống L14 và MD97 có mức tương đồng 0,99 chứng tỏ 2 giống này là cùng một loài Nhánh 2B gồm giống DBG và LVT có mức tương đồng 0,91, với mức tương đồng cao chúng có cùng nguồn gốc và có thể chung loài

Kết luận giống L18 có thể lai với giống DBG và LVT để cho kết quả ưu thế lai cao nhất

Phân tích bằng Blast trên NCBI đã làm rõ nguyên nhân gây bệnh vàng lá Greening

do vi khuẩn Liberobacter asiaticum sống trong mạch dẫn libe của cây, do rầy chổng cánh

(Diaphorina citri) làm vetor lan truyền bệnh, ngoài ra còn lây qua mắt ghép ( trong quátrình cắt ghép cây) Vi khuẩn gây xáo trộn sinh lý, làm tắt nghẽn quá trình vận chuyểndinh dưỡng Do đó làm thiệt hại đến sinh trưởng của cây, đế năng suất, phẩm chất trái

Vì vậy dựa trên tính cấp thiết đó bệnh vàng lá gân xanh được phát hiện nhanhbằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu được tiến hành trên các loại cây có múi

2.Mục đích

Chuẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh trên cây bưởi

Trang 17

Trích DNA tổng số ( DNA lá bưởi và vi khuẩn gây bệnh) Đo OD kiểm tra độ tinhsạch và tính được nồng độ DNA Sử dụng kỹ thuật PCR để khuyếch đại đoạn DNA của

vi khuẩn gây bệnh Điện di kiểm tra chất lượng, hàm lượng DNA

II/ Quy trình ly trích DNA tổng số

Bước 1: Mẫu lá đậu nành được lau bằng cồn 70%, gói giấy bạc

Bước 2: Ngâm mẫu lá cả chối và chày trong nitơ lỏng 10’ để tế bào giòn, dễ vỡ.Tạo nhiệt độ lạnh làm hạn chế enzyme nuclease hoạt động, đồng thời bảo vệ DNA phóng

Trang 18

thích từ nhân không bị tiêu hủy bởi các protease trong tế bào Tế bào thực vật có váchcellulose khó vỡ hơn tế bào động vật và vi sinh vật.

Bước 3: Nghiền lá nhanh tránh mẫu bị hút ẩm trở lại Trong quá trình nghiền tathêm nitơ lỏng vào nhằm mục đích ức chế các enzyme gây biến tính DNA của lá, mẫuđược nghiền cho đến khi thành bột mịn

Bước 4: Chuyển khoảng 100mg bột mịn vào tube 1,5 ml

Bước 5: Thêm 1ml EB buffer Trong thành phần của EB có EDTA pH=8 làmezyme nuclease hoạt động ít nhất Enzyme nuclease hoạt động phải có Mg2+ mà EDTA

Trang 19

có tác dụng gắn ion Mg2+ làm enzyme này hạn chế hoạt động, DNA được bảo vệ Chovào thêm 50 SDS 10% ( trong SDS có bổ sung có tác dụng ngăn cản enzyme polyphenoloxidase bảo vệ được DNA

Polyphenol Quinon (liên kết DNA làm mấtDNA)

Bước 6: Đem ủ mẫu ở 65oC trong 30 phút ( để tế bào hoàn toàn bị phá vỡ),khoảng 5 phút đảo nhẹ để trộn đều mẫu

Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút để tủa protein và mảnh vỡ tế bào

ta thu dịch trong

Bước 8: Chuyển 700 phần trong vào tube mới và thêm 700 isopropanol(isopropanol giúp tủa DNA)

Bước 9: Tiếp tục đem ủ ở -20oC khoảng 30 phút (có thể ủ đến 2h) bằng khay nước

đá để tủa DNA (Isopropanol tủa lạnh sẽ nhanh hơn)

enzyme polyphenol Oxidase

Trang 20

Bước 10: Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút thu kết tủa

Bước 11:Hòa tan kết tủa trong 400 TE buffer ( làm tan tủa giúp DNA không bịbiến tính, bất hoạt enzyme nuclease Trong thành phần của TE có Tris và EDTA pH=8tạo môi trường kiềm bảo vệ DNA)

Bước 12: Thêm 1enzyme RNAase 10mg/ml ủ ở 37oC trong 10 phút ( để loại RNAnếu cần thiết có thể bỏ qua bước này)

Bước 13: Thêm 400 CTAB buffer và ủ ở 65oC trong 15 phút, đảo ngược tube 5phút để trộn mẫu ( thu DNA và loại polysaccharide)