thực hành sinh học phân tử

MỤC LỤC BÀI PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN ĐẬU NÀNH I Mục đích thí nghiệm 1.1 Mục đích Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA khỏi cấu trúc bao bọc tế bào Điều quan trọng thu nhận phân tử DNA trạng thái nguyên nguyện không bị phân hủy Ly trích DNA tổng số từ đậu nành có độ tinh cao, hàm lượng đủ lớn Đánh giá đa dạng di truyền giống đậu phương pháp RAPD từ ứng dụng việc lựa chọn bố mẹ lai tạo giống 1.2 Đối tượng: Lá đậu nành II Quy trình Nguyên tắc tách chiết DNA từ tế bào thực vật Tùy loại mẫu , tùy mục đích nghiên cứu điều kiện phòng thí nghiệm sử dụng kỹ thuật tách chiết với loại hóa chất dung môi khác Các phương pháp tách chiết DNA thường dùng gồm: +Phương pháp CTAB +Phương pháp PVP +Phương pháp phenol/chloroform + Phương pháp Silica +Phương pháp Guannidine-chloroform Trong phạm vi thực hành ta thực cách tách chiết DNA tổng số từ đậu nành theo phương pháp CTAB (Cetyl threemetyl ammonium bromide) Nguyên tắc phương pháp dựa sở sử dụng kết hợp học nghiền hóa chất để phá vỡ màng nhân, tạo thành hỗn hợp đựng ống Ependorp Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, hóa chất loại bỏ thành phần không mong muốn, từ thu nhận DNA Quy trình ly trích DNA tổng số Mục đích: Phân lập DNA tổng số có độ tinh cao, hàm lượng đủ lớn, bị đứt gãy để phục vụ cho nghiên cứu di truyền gen sinh vật Quy trình ly trích DNA cụ thể gồm bước sau: Bước 1: Mẫu đậu nành lau cồn 70%, gói giấy bạc Bước 2: Ngâm mẫu chối chày nitơ lỏng 10’ để tế bào giòn, dễ vỡ Tạo nhiệt độ lạnh làm hạn chế enzyme nuclease hoạt động, đồng thời bảo vệ DNA phóng thích từ nhân không bị tiêu hủy protease tế bào Tế bào thực vật có vách cellulose khó vỡ tế bào động vật vi sinh vật Bước 3: Nghiền nhanh tránh mẫu bị hút ẩm trở lại Trong trình nghiền ta thêm nitơ lỏng vào nhằm mục đích ức chế enzyme gây biến tính DNA lá, mẫu nghiền thành bột mịn Bước 4: Chuyển khoảng 100mg bột mịn vào tube 1.5ml Bước 5: Thêm 1ml EB buffer Trong thành phần EB có EDTA pH=8 làm ezyme nuclease hoạt động Enzyme nuclease hoạt động phải có Mg 2+ mà EDTA có tác dụng gắn ion Mg2+ làm enzyme hạn chế hoạt động, DNA bảo vệ Cho vào thêm 50 SDS 10% ( SDS có bổ sung có tác dụng ngăn cản enzyme polyphenol oxidase bảo vệ DNA Polyphenol enzyme polyphenol Oxidase Quinon (liên kết DNA làm DNA) Bước 6: Đem ủ mẫu 65oC 30 phút ( để tế bào hoàn toàn bị phá vỡ), khoảng phút đảo nhẹ để trộn mẫu Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút để tủa protein mảnh vỡ tế bào ta thu dịch Bước 8: Chuyển 700 phần vào tube thêm 700 isopropanol (isopropanol giúp tủa DNA) Bước 9: Tiếp tục đem ủ -20oC khoảng 30 phút (có thể ủ đến 2h) khay nước đá để tủa DNA (Isopropanol tủa lạnh nhanh hơn) Bước 10: Ly tâm 13000 vòng/ phút 10 phút thu kết tủa Bước 11:Hòa tan kết tủa 400 TE buffer ( làm tan tủa giúp DNA không bị biến tính, bất hoạt enzyme nuclease Trong thành phần TE có Tris EDTA pH=8 tạo môi trường kiềm bảo vệ DNA) Bước 12: Thêm 1enzyme RNAase 10mg/ml ủ 37 oC 10 phút ( để loại RNA cần thiết bỏ qua bước này) Bước 13: Thêm 400 CTAB buffer ủ 65 oC 15 phút, đảo ngược tube phút để trộn mẫu ( thu DNA loại polysaccharide) CTAB: Chất tẩy rửa dùng để phá vỡ màng tế bào, bào mòn màng tế bào Màng tế bào lớp kép phospholipid, CTAB làm biến tính protein, phospholipid bị hòa tan CTAB: có khả liên kết thuận nghịch với DNA polysaccharide Ở nồng độ muối > 1,4 M phức hợp CTAB-DNA trạng thái hòa tan Phức hợp CTAB-polysaccharide kết tủa, phức loại bước ly tâm Ở nồng độ muối < 0,7M phức CTAB-DNA kết tủa, cho phép thu hồi lại DNA bước tủa cồn Ở nồng độ muối thấp phức CTAB-DNA tách Phức tách gần hoàn toàn bước rửa cồn 70o Bước 14: Thêm 800 Chloroform/ Isoamylalcohol (24:1) lắc trộn Chloroform không tan nước, loại bỏ tạp chất không mong muốn dung dịch protein, làm biến tính protein, không hòa tan nucleic acid Isoamylalcohol ancohol với có mặt cation hóa trị (Na +, K+, NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA, tạo thành lớp màng ngăn pha Bước 15: Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút Sau ly tâm dung dịch chia thành lớp: Lớp thứ phần dịch có chứa DNA, lớp thứ lớp protein, lớp có chứa chloroform tất thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…) Bước 16: Chuyển cẩn thận từ từ 500 dung dịch phía qua tube 1,5ml mới, thêm 1ml Ethanol 96% dùng để tủa DNA bảo vệ chúng khỏi phân hủy enzyme (bước không dùng isopropanol isopropanol tủa muối) Bước 17: Sau đem ủ nhiệt độ phòng 15 phút Ủ để tủa DNA thực cách tốt Bước 18: Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút, đổ bỏ phần rửa phần cặn với 400 ethanol 70%, rửa lặp lại lần để loại muối khỏi DNA, CTAB DNA tách hoàn toàn Bước 19: Ly tâm lần để loại bỏ ethanol Phơi khô DNA 37 oC 15 phút tránh trường hợp mẫu DNA chứa ethanol ảnh hưởng tới kết Bước 20: DNA sau phơi khô hòa tan 100 TE buffer,để hòa tan tủa bảo vệ DNA Hút 30 cho vào tube để trữ lại Còn 70 lại đo OD * Giải thích hóa chất Tris-HCl: nhằm ổn định pH EDTA: Có lực cao với ion kim loại hóa trị II hấp thụ kim loại nặng, bảo vệ DNA khỏi phân hủy enzyme DNase, enzyme nội bào hấp thụ Ca 2+, Mg2+ cạnh tranh với emzyme làm enzyme không hoạt động Khi bổ sung CTAB ủ 65 oC 15 phút, CTAB hoạt động mạnh hiệu nhiệt độ khoảng 60-70oC, mạnh có lực học tác động vào ( CTAB hoạt động trường hợp có NaCl) + Chloroform/ Isoamyalcohol bổ sung để tách chiết DNA, loại bỏ Protein thành phần khác không mong muốn + Isoamyalcohol: Hỗ trợ phân pha ( pha) -Pha : DNA -Pha giữa: Protein -Pha cuối: chứa xác cặn tế bào dung dịch chloroform Rửa tủa cồn 70% không sử dụng nước cất để rửa DNA bị hòa tan nước không hòa tan cồn Nếu tủa lẫn muối: Muối hòa tan cồn 70% , cồn 100% muối không tan, cồn kết tủa protein rửa tủa cồn xong hút hết cồn làm bay hết cồn Nếu cồn làm biến tính enzyme không thực phản ứng sinh học Hòa tan DNA TE 1X hòa tan tủa DNA, rửa tủa TE 1X hiệu bảo quản lâu, TE bảo quản tốt có chứa EDTA lực với ion kim loại hóa trị II, bảo vệ DNA khỏi phân hủy enzyme giúp bảo quản lâu Hạn chế TE có có mặt EDTA ức chế enzyme phản ứng sinh học phân tử sau Cho nên sử dụng TE nồng độ loãng, không ức chế phản ứng sinh học sau III/ Phân tích DNA ly trích Đo OD Đo OD bước sóng 260nm 280nm với hệ số pha loãng 10 lần Nhằm kiểm tra chất lượng DNA có tinh chưa, định lượng nồng độ DNA DNA xem tỉ số OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1,82 OD260nm 0,4177 0,1584 0,0064 OD280nm 0,0746 0,1078 0,3622 OD260/OD280 5,60 1,47 0,018 10 có tác dụng gắn ion Mg2+ làm enzyme hạn chế hoạt động, DNA bảo vệ Cho vào thêm 50 SDS 10% ( SDS có bổ sung có tác dụng ngăn cản enzyme polyphenol oxidase bảo vệ DNA Polyphenol enzyme polyphenol Oxidase Quinon (liên kết DNA làm DNA) Bước 6: Đem ủ mẫu 65oC 30 phút ( để tế bào hoàn toàn bị phá vỡ), khoảng phút đảo nhẹ để trộn mẫu Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút để tủa protein mảnh vỡ tế bào ta thu dịch Bước 8: Chuyển 700 phần vào tube thêm 700 isopropanol (isopropanol giúp tủa DNA) Bước 9: Tiếp tục đem ủ -20 oC khoảng 30 phút (có thể ủ đến 2h) khay nước đá để tủa DNA (Isopropanol tủa lạnh nhanh hơn) 19 Bước 10: Ly tâm 13000 vòng/ phút 10 phút thu kết tủa Bước 11:Hòa tan kết tủa 400 TE buffer ( làm tan tủa giúp DNA không bị biến tính, bất hoạt enzyme nuclease Trong thành phần TE có Tris EDTA pH=8 tạo môi trường kiềm bảo vệ DNA) Bước 12: Thêm 1enzyme RNAase 10mg/ml ủ 37 oC 10 phút ( để loại RNA cần thiết bỏ qua bước này) Bước 13: Thêm 400 CTAB buffer ủ 65 oC 15 phút, đảo ngược tube phút để trộn mẫu ( thu DNA loại polysaccharide) CTAB: có khả liên kết thuận nghịch với DNA polysaccharide Ở nồng độ muối > 1,4 M phức hợp CTAB-DNA trạng thái hòa tan Phức hợp CTAB-polysaccharide kết tủa, phức loại bước ly tâm Ở nồng độ muối < 0,7M phức CTAB-DNA kết tủa, cho phép thu hồi lại DNA bước tủa cồn Ở nồng độ muối thấp phức CTAB-DNA tách Phức tách gần hoàn toàn bước rửa cồn 70o 20 Bước 14: Thêm 800 Chloroform/ Isoamylalcohol (24:1) lắc trộn Chloroform không tan nước, loại bỏ tạp chất không mong muốn dung dịch protein, làm biến tính protein, không hòa tan nucleic acid Isoamylalcohol ancohol với có mặt cation hóa trị (Na +, K+, NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA, tạo thành lớp màng ngăn pha Bước 15: Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút Sau ly tâm dung dịch chia thành lớp: Lớp thứ phần dịch có chứa DNA, lớp thứ lớp protein, lớp có chứa chloroform tất thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…) 21 Bước 16: Chuyển cẩn thận từ từ 500 dung dịch phía qua tube 1,5ml mới, thêm 1ml Ethanol 96% dùng để tủa DNA bảo vệ chúng khỏi phân hủy enzyme (bước không dùng isopropanol isopropanol tủa muối) Bước 17: Sau đem ủ nhiệt độ phòng 15 phút Ủ để tủa DNA thực cách tốt 22 Bước 18: Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút, đổ bỏ phần rửa phần cặn với 400 ethanol 70%, rửa lặp lại lần để loại muối khỏi DNA, CTAB DNA tách hoàn toàn Bước 19: Ly tâm lần để loại bỏ ethanol Phơi khô DNA 37 oC 15 phút tránh trường hợp mẫu DNA chứa ethanol ảnh hưởng tới kết Bước 20: DNA sau phơi khô hòa tan 100 TE buffer,để hòa tan tủa bảo vệ DNA III/ Phân tích DNA ly trích Đo OD Đo OD bước sóng 260nm 280nm với hệ số pha loãng 10 lần Nhằm kiểm tra chất lượng DNA có tinh chưa, định lượng nồng độ DNA DNA xem tỉ số OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1,82 OD260nm OD280nm OD260/OD280 0,1531 0,1513 0,0645 0,0789 Hàm lượng DNA mẫu sau pha loãng [DNA]= Giá trị mật độ quang x 50 x hệ số pha loãng (ng/ml) *OD260nm 23 1,01 0,81 Mẫu 1: [DNA]= 0,1531.50.10=76,55(ng/ml) Mẫu 2: [DNA]= 0,0645.50.10=32,25(ng/ml) *OD280nm Mẫu 1: [DNA]=0,1513.50.10=75,65(ng/ml) Mẫu 2: [DNA]=0,0789.50.10=39,45(ng/ml) Nồng độ DNA thu thấp *Nhận xét: Mẫu 1: Tỉ lệ OD260nm/OD280nm >1,8 nhiễm protein Mẫu 2: Tỉ lệ OD260nm/OD280nm [...]... cây phát sinh loài cho thấy, các giống đậu khảo sát chia thành 2 nhóm với mức tương đồng gen biến thiên từ 0,69 đến 0,98 Điều này cho thấy các giống đậu có sự đa dạng cao về mặt di truyền Nhóm I gồm giống L18, nhóm II gồm các giống còn lại Trong đó mức tương đồng gen giữa nhóm I và nhóm II là 0,69 Điều này cho thấy giữa giống L18 và các giống còn lại có sự khác biệt tương đối xa Nhóm II phân thành 2... protease trong tế bào Tế bào thực vật có vách cellulose khó vỡ hơn tế bào động vật và vi sinh vật Bước 3: Nghiền lá nhanh tránh mẫu bị hút ẩm trở lại Trong quá trình nghiền ta thêm nitơ lỏng vào nhằm mục đích ức chế các enzyme gây biến tính DNA của lá, mẫu được nghiền cho đến khi thành bột mịn Bước 4: Chuyển khoảng 100mg bột mịn vào tube 1,5 ml Bước 5: Thêm 1ml EB buffer Trong thành phần của EB có EDTA... không thành công 24 3.Phản ứng PCR a) Mục đích của phản ứng PCR PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích gen vì nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu từ bất kì cơ thể nào Mục đích phản ứng PCR của thí nghiệm nhằm phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh trên cây bưởi Khuếch đại vùng OI của vi khuẩn để chuẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh trên cây bưởi b) Chuẩn bị hóa chất Thành... là ở 39,9 oC nên ta chỉnh nhiệt độ bắt mồi xuống 40oC (chứ không phải ở nhiệt độ 32oC) Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di Mục đích điện di Điện di DNA trong gel agarose là kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng và hàm lượng DNA Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của axit nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một diện trường chúng... mặt của cation hóa trị 1 (Na +, K+, NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA, tạo thành lớp màng ngăn pha Bước 15: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút Sau khi ly tâm dung dịch chia ra thành 3 lớp: Lớp thứ nhất là phần dịch trong ở trên cùng có chứa DNA, lớp thứ 2 là một lớp protein, lớp kế tiếp có chứa chloroform và tất cả những thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…) 21 Bước 16: Chuyển cẩn... quả bị giảm đi Phân tích bằng Blast trên NCBI đã làm rõ nguyên nhân gây bệnh vàng lá Greening do vi khuẩn Liberobacter asiaticum sống trong mạch dẫn libe của cây, do rầy chổng cánh (Diaphorina citri) làm vetor lan truyền bệnh, ngoài ra còn lây qua mắt ghép ( trong quá trình cắt ghép cây) Vi khuẩn gây xáo trộn sinh lý, làm tắt nghẽn quá trình vận chuyển dinh dưỡng Do đó làm thiệt hại đến sinh trưởng của... kỳ sau Nhiệt độ (oC ) 92 Thời gian 5:00 92 0:30 72 72 55 1:30 (Phút: giây) 5:00 4oC 0:30 Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di Mục đích điện di Điện di DNA trong gel agarose là kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng và hàm lượng DNA Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của axit nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một diện trường chúng... thận trong thao tác: hút dịch nổi, hút hóa chất, thực hiện trong điều kiện lạnh… 27 Cần loại bỏ tạp chất kỹ, tránh nhiễm protein, chloroform… Cần có mẫu đối chứng nội Bài 3 CHUẨN ĐOÁN BỆNH BETA-THALASSMESIA Ở NGƯỜI BẰNG AMRS-PCR I/ Giới thiệu bệnh Beta-THALASSMESIA 1.Giới thiệu Thalassemia là bệnh thiếu máu di truyền (trong y học gọi là tan máu bẩm sinh) , bệnh gây vỡ hồng cầu, thiếu oxy trong cơ thể... kì phản ứng Nhiệt độ (oC ) 94 Thời gian 94 1:00 72 72 60 1:30 (Phút: giây) 3:00 4oC 1:00 2 Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di a.Mục đích Điện di DNA trong gel agarose là kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng và hàm lượng DNA Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của axit nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một diện trường chúng sẽ... 70oC Biện pháp khắc phục Cần nghiên cứu với lượng mẫu lớn hơn 14 Cẩn thận trong thao tác: hút dịch nổi, hút hóa chất, thực hiện trong điều kiện lạnh… Cần loại bỏ tạp chất kỹ, tránh nhiễm protein, chloroform… Cần có mẫu đối chứng nội IV/ Đánh giá đa dạng di truyền bằng RADP Mục đích Phân tích đa dạng di truyền để xem mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu xa hay gần Mối quan hệ xa nhau sẽ tạo ưu thế ... Hạn chế TE có có mặt EDTA ức chế enzyme phản ứng sinh học phân tử sau Cho nên sử dụng TE nồng độ loãng, không ức chế phản ứng sinh học sau III/ Phân tích DNA ly trích Đo OD Đo OD bước sóng 260nm... enzyme không thực phản ứng sinh học Hòa tan DNA TE 1X hòa tan tủa DNA, rửa tủa TE 1X hiệu bảo quản lâu, TE bảo quản tốt có chứa EDTA lực với ion kim loại hóa trị II, bảo vệ DNA khỏi phân hủy enzyme... Trong phạm vi thực hành ta thực cách tách chiết DNA tổng số từ đậu nành theo phương pháp CTAB (Cetyl threemetyl ammonium bromide) Nguyên tắc phương pháp dựa sở sử dụng kết hợp học nghiền hóa