nuôi cấy mô tế bào thực vật

Bài 1 CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬTI/ CÁC CÔNG VIỆC CẦN CHUẨN BỊ TRƯỚC KHI TIẾN HÀNH PHA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ THAO TÁC CẤY MẪU VÀO MÔI TRƯỜNG:1.Các công việc cầ

Bài 1 CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬTI/ CÁC CÔNG VIỆC CẦN CHUẨN BỊ TRƯỚC KHI TIẾN HÀNH PHA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ THAO TÁC CẤY MẪU VÀO MÔI TRƯỜNG:

1.Các công việc cần thiết trước khi pha môi trường:

Hình 3 Dụng cụ cấy

+ Dao, kẹp, giấy cấy, cốc thủy tinh, đèn cồn, ống nghiệm, lọ,

Các dụng cụ phải được hấp khử trùng trước khi sử dụng

- Chuẩn bị hóa chất khử trùng: cồn 700, dd NACLO,

- Chuẩn bị hóa chất pha môi trường

- Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy:

Trước khi đưa vào sử dụng, phòng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do Đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde còn thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng trong 24h Bề mặt nơi chuẩn bị cấy,

bề mặt bên trong và ngoài tủ cấy phải được khử trùng trước khi cấy bằng cách lau sạch các

bề mặt này bằng cồn 90% Bật tia UV trong 15 phút trước khi cấy để diệt mầm vi sinh trên

+ Chất khử trùng

+ Nồng độ chất khử trùng

-Thao tác: khử trùng tại vị trí làm việc, tay, dụng cụ cấy, dụng cụ chứa môi trường nuôi như chai, lọ.

II CÁCH PHA MÔI TRƯỜNG:

Môi trường nuôi cấy phù hợp là thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Thành phần của môi trường dinh dưỡng thay đổi tùy theo loài, bộ phận nuôi cấy, tùy theo sự phát triển và phân hóa của mô cấy, tùy theo việc muốn duy trì mô ở trạng thái callus, tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh Tuy vậy tất cả môi trường nuôi cấy bao giờ cũng gồm 5 thành phần chính

Đường cung cấp nguốn carbon.

Các muối khoáng đa lượng

Các muối khoáng vi lượng

Các vitamin

Các chất điều hòa sinh trưởng

Bảng 2 Thành phần môi trường MS (1962) và cách pha stock

Macro MS

Hóa chất g/l Stock x 10 g/lMgSO4.7H2O 0.37 3.7

Na2MoO4.2H2O 0.25 0.25

CuSO4.5H2O 0.025 0.025CoCl2.6H2O 0.025 0.025

1.Cách pha stock đa lượng:

Stock đa lượng có 5 thành phần (MgSO4.7H2O, KH2PO4, KNO3, NH4NO3, CaCl2.2H2O)Mỗi lần cho một loại khoáng vào phải khuấy tan hoàn toàn và bổ sung thêm 100ml nước cất hai lần trước khi bổ sung thêm các khoáng khác vào ( phương pháp pha thể tích tăng dần)

Chú ý: do CaCl2.2H2O có thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO4.7H2O nên hai chất này phải pha tách rời nhau theo đúng trình tự , cho CaCl2 vào sau cùng Cho tất cả vào bình đựng, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng thể tích cần pha.

- Cách pha stock vi lượng:

Stock vi lượng có 7 thành phần ( H3BO3, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, KI, CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O)

Cân đủ số mg/l của từng thành phần, làm tan hoàn toàn Cuối cùng thêm nước cho đủ thể tích cần pha như stock đa lượng

- Cách pha stock sắt EDTA:

Sắt EDTA có 2 thành phần ( Na2EDTA, CaCl2.2H2O)

Nồng độ là 10ml/l môi trường

Chuẩn bị 2 becher 250ml (mỗi becher chứa 100ml nước cất hai lần) đun ở 800C

Hình 4 Stock vi lượng

Cho lần lượt FeSO4.7H20 và Na2EDTA vào hai becher riêng biệt Cho becher chứa FeSO4.7H2O vào Na2EDTA khuấy đều, bổ sung thêm nước cho đủ thể tích cần pha Bảo quản trong chai màu ở 4-100C.

Cách pha vitamin:

Vitamin thường dùng là Pirydoxine (B6), Nicotinic Acid (P.P), Thiamin-HCl (B1) cần dùng bao nhiêu thể tích thì tính toán rồi hút cho đủ thể tích

+ Cách pha chất điều hòa sinh trưởng thực vật:

Nhóm cytokynin cân đủ mg cytokinin hòa tan trong 5 ml NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ thể tích cần pha

Hình 5 Stock FeEDTA

Hình 6 Vitamin

Nhóm auxin cân đủ mg auxin hòa tan trong 5 ml NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ thể tích cần pha.

Bài 2 PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MẪU CẤYI/Nguyên tắc

Ở đa số các loài thực vật, mỗi nách lá đều mang một chồi ngủ Các chồi ngủ này có đặc tính hoàn toàn giống với các đỉnh sinh trưởng, có khả năng tăng trưởng phát triển thành một cơ thể thực vật toàn vẹn Các chồi ngủ này đa số bị ức chế bởi sự phát triển các chồi đỉnh (tính ưu thế ngọn) Nếu tách riêng một đoạn thân có mang chồi nách này ra khỏi cơ thể thực vật, dưới tác động của các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh như cytokinin, auxin thì từ một chồi nách có thể tạo ra nhiều chồi mới

Cấy mẫuQuan sát

TH1: Khử trùng đoạn thân cành chứa mầm ngủ phía trên mặt đất

Rửa dưới vòi nước máy (10p)Cành,củ chứa chồi ngủ

Ngâm, trong

Ngâm trong javen/nước tỷ lệ 1:1 (25p)Rửa nước cất vô trùng (4lần)Cho vào tủ cấy lắc với cồn 700(1p)Rửa nước cất vô trùng (3lần)

Cấy mẫuQuan sát

Hình 7,8 Khử trùng mẫu phía trên mặt đất

TH2: Khử trùng đoạn thân cành chứa mầm ngủ phía dưới mặt đất

Hình 9,10 Khử trùng mẫu phía dưới mặt đất

Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn Nếu mô non thì thời gian xử lý ngắn hơn

Đối với các bộ phận cây có nhiếu bụi đất, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng dưới vòi nước chảy Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng(3-5 lần)

Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường

Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn Lớp cuối cùng sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường

Chú ý không ngâm mô trong cồn 90oC

Nhận xét: Mẫu cấy chứa chồi ngủ đoạn thân cành ở phía trên mặt đất ít nhiễm hơn mẫu phía dưới mặt đất vì mẫu dưới mặt đất nhiều vi vinh vật hơn, mẫu lớn khó khử trùng

Kết quả sau1,2 tuần nuôi cấy:

Hình 11 Mẫu sống

Hình 12.Mẫu chết do nhiễm khuẩn và nấm mốc

BÀI 3 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẠO MÔ SẸO Ở THỰC VẬT

I/ Nguyên tắc

Trong các đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về mặt vật lý (những vết cắt trên cơ thể, những tổn thương do côn trùng tấn công) thực vật có khả năng hình thành những tế bào mới để hàn kín những chỗ tổn thương đó Những tế bào mới được hình thành đó là mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, hiện diện trong các giai đoạn hóa ligin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng thượng tầng ( vùng phân sinh) như thượng tầng liber- mộc, thượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành Những tế bào mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện với các loài thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Những mô của thực vật có thể dùng nuôi cấy tạo

mô sẹo là: thượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế bào diệp nhục, lá, trụ bì rễ,

tử diệp,… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Mô sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ tạo mô sẹo Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo Sự tạo

mô sẹo ở thực vật xảy ra khi môi trường nuôi cấy được bổ sung một lượng auxin thích hợp

Hình 13 Mô sẹo

Hình 14 Nhân giống thông qua giai đoạn tạo mô sẹo

A Mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy

B Mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy

C Tạo chồi từ mô sẹo

D Cây tái sinh từ mô sẹo

E Thu được từ cây con nuôi cấy mô thông qua tạo mô sẹo

II/ Mẫu vật, hóa chất, dụng cụ

Củ cà rốt sạch bệnh

Cồn 700C, 96oC

Xà phòng bột, Javen, nước cất vô trùng

Cốc thủy tinh khử trùng, kẹp cấy, dao mổ, đèn cồn, bông gòn thấm

Hình 15 Dụng cụ III/ Tiến hành nuôi cấy

+ Chuẩn bị môi trường

Môi trường MS đối chứng có sucrose 20g/l và agar 8g/l

Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, NAA 10mg/l

Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, NAA 10mg/l, BA 1mg/l

TH1: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng kích thích tạo mô sẹo

Hình 18 Mẫu carot sống

• Tỉ lệ sống chết sau khi nuôi cấy

Tổng số mẫu nuôi cấy 25 mẫu:

Có 6 mẫu sống đạt 24%

Có 19 mẫu chết chiếm 76%, trong đó:

+ 10 mẫu chết do nấm mốc 52,63%

+ 9 mẫu chết do nhiễm khuẩn 47,36%

• Nguyên nhân mẫu bị chết : Trong quá trình khử mẫu đã làm mẫu chết, mẫu

đã bị nhiễm trước khi cấy

Các mẫu bị nhiễm nấm mốc do thao tác cấy chưa chính xác và điều kiện

vô trùng chưa đảm bảo tốt, que cấy quá nóng làm mẫu bị chết, môi trường nuôi cấy khộng đảm bảo.Dụng cụ thủy tinh, dụng cụ cấy cũng chưa được vô trùng tuyệt đối

Điều kiện nuôi cấy, thời gian lấy mẫu của ảnh hưởng đến sức sống của mẫu

• Trong 6 mẫu sống chưa có mẫu nào phát sinh callus nên chưa lựa chọn được môi trường thích hợp cho sự phát sinh callus

• Theo lý thuyết môi trường thích hợp tạo callus là môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, NAA 10mg/l, BA 1mg/l

• Sự tạo mô sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình:

+ Sự phản phân hóa của tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi + Sự phân chia của tế bào tượng tầng

+ Sự xáo trộn của mô phân sinh sơ khởi ( chồi hay rễ)

Bài 4 NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ TRONG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

I/ Nguyên tắc

Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào invitro được gọi là vi

nhân giống

Nhân giống invitro: Sử dụng mô nuôi cấy có kích thước nhỏ, duy trì và nhân nhanh

các kiểu gen hiếm, làm vật liệu cho chọn giống, hiệu quả kinh tế cao

Có nhiều phương pháp vi nhân giống khác nhau để tạo chồi từ đó tạo cây con invitro

hoàn chỉnh Tùy từng đối tượng khác nhau mà sử dụng phương pháp phù hợp

Nuobvgf Nuôi cấy cơ quan

Cây

Chồi

Nuôi cấy callus

Cây trưởng thành

II/ Mẫu vật, hóa chất dụng cụ

Mẫu chồi bài thực hành 2,3

HÌnh 19 Mẫu lan nuôi cấy mô

Kẹp cấy, dao mổ và môi trường bài 3

III/ Tiến hành thí nghiệm

TH1: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi

Mẫu cấy là phần gốc chứa chồi ngủ, nguyên cây hoặc chồi ngọn

CâyPhôi

Tế bào đơnCallus

Nuôi cấy phôi

Chồi, cụm chồi, phôi củ nhỏ

Cây Nuôi cấy tế bào

Mẫu được cấy vào môi trường MS và môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA.

Môi trường nhân chồi

Môi trường MS đối chứng có sucrose 20g/l và agar 8g/l

Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, BA 2mg/l, NAA 1mg/l

TH2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ

Mẫu cấy là cụm chồi được tách ra từng chồi riêng rẽ và được cấy vào môi trường MS có chứa than hoạt tính và môi trường MS có than hoạt tính và bổ sung NAA

Môi trường tạo rễ

Môi trường MS đối chứng có sucrose 20g/l và agar 8g/l, than hoạt tính 2g/l Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, NAA 1mg/l và than hoạt tính 2g/l

IV/ Nhận xét kết quả

Hình 20 Mẫu lan bị nhiễm sau khi cấy chuyền

Nhận xét ảnh hưởng của BA và NAA lên quá trình kích thích nhân chồi, tạo rễ hoa lan

Từ kết quả nuôi cấy sau 1 đến 2 tuần tỉ lệ mẫu chết là 100%

Theo lý thuyết cho thấy sự kết hợp giữa môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và NAA 1mg/l ảnh hưởng tích cực lên sự hình thành chồi và sinh trưởng chồi

Môi trường MS có bổ sung NAA 1mg/l và than hoạt tính thích hợp cho sự tạo rễ invitro hoa lan

BÀI 5 PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG

I/ Nguyên tắc

Đỉnh sinh trưởng là phần chóp của búp là hoặc thân cây nơi có thể sinh ra những phần mới Đỉnh sinh trưởng thường mềm yếu rất mẫn cảm với ánh sáng, chứa rất nhiều auxin nơi diễn ra trao đổi chất mạnh

Phương pháp tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được sử dụng trong nuôi cấy invitro với mục đích chính nhằm phục hồi giống cây trồng bị nhiễm bệnh và tạo ra cây con hoàn toàn sạch bệnh Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3-4 tiền phát khởi lá có kích thước từ 0,1-0,15mm tính từ chóp sinh trưởng Kỹ thuật này khá phức tạp, phải thực hiện dưới kính hiển vi và khả năng sống sót của mẫu có kích thước nhỏ như vậy thường không cao, do đó đòi hỏi thao tác thật tỉ mỉ, chính xác và lựa chọn môi trường thích hợp nhất

Có 2 phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy:

Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu ở cây 2 lá mầm (dicotyledon) như cây khoai tây, thuốc

lá, cam chanh, hoa cúc…

Đỉnh sinh trưởng→ Chồi nách→ Cây

Phát triển cây gián tiếp: Chủ yếu gặp ở các đối tượng 1 lá mầm (monocotyledon) như phong lan, dứa, huệ, … đỉnh sinh trưởng tạo protocorm từ protocorm phát triển thành cây hoàn chỉnh

Đỉnh sinh trưởng→ Protocorm→ Cây

II/ Mẫu vật, hóa chất dụng cụ

Hình21.Hoa huệ trắngCồn 70oC, 90oC, xà phòng bột, Javen, nước cất vô trùng, dao cấy, lưỡi dao cấy, đèn cồn, kính lúp, đĩa petri

III/ Tiến hành thí nghiệm

Chọn chồi cây huệ sạch, cắt bỏ lá

Hình 22,23 Đỉnh sinh trưởng trên kính hiển vi

IV/ Kết luận

*Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng:

Phục hồi giống cây trồng bị nhiễm bệnh, tạo cây con hoàn toàn sạch bệnh ít nhiễm virus

Nhân nhanh số lượng cây giống sạch virus

Những cây bị nhiễm virus cũng có thể tạo ra cây sạch bệnh nhờ nuôi cấy dỉnh sinh trưởng

Trạng thái vật lý của môi trường có ý nghĩa quan trọng trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

* Để loại bỏ virus ở cây trồng thường có những phương pháp:

Kết hợp xử lý nhiệt và xử lý hóa chất với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chọn lọc bằng phương pháp thử virus

*Nếu đặt đỉnh sinh trưởng không ngay ngắn lên môi trường (mặt cắt không tiếp xúc được với

bề mặt môi trường) đỉnh sinh trưởng sẽ không lên Vì mặt cắt không tiếp xúc được với môi trường sẽ không tiếp xúc và hấp thu được các chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng Vì vậy phần đỉnh sinh trưởng sẽ không sống và phát triển được

Bài 6 THUẦN DƯỠNG CÂY CON RA VƯỜN ƯƠMI/Nguyên tắc

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá trình

nhân giống invitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này tron thực tiễn sản xuất Đây là giai đoạn chuyển con invitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng

Sự thành công của một kỹ thuật nhân giống thực vật thể hiện qua số cây con sống được ngoài vườn ươm Tỉ lệ cây nuôi cấy sống được ngoài vườn ươm phụ thuộc nhiều vào kĩ thuật thuần hóa Do đó, việc thuần hóa cây nhằm mục đích cho cây nuôi cấy thích nghi được với những điều kiện của môi trường tự nhiên: Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, chế độ dinh dưỡng, dịch bệnh,

II Vật liệu, dụng cụ

Các mẫu cây vitro đã tái sinh hoàn chỉnh đủ lá, rễ

Hình 24 mẫu lan nuôi cấy mô

Giá thể hỗn hợp để ươm cây (xơ dừa, tro trấu,…), khay ươm

Hình 24 Giá thể ươm cây III Cách tiến hành

Thực hành 1: Chuẩn bị giá thể ươm cây con

Chuẩn bị giá thể:

50% đất+ 50% tro trấu, xơ dừa+ phân ủ hoai mụcĐiều chỉnh ẩm độ giá thể: 70%

Tiệt trùng giá thể:

Hấp hay hóa chất (24 giờ trước khi

trồng)

Giá thể hoàn thiện

Sơ đồ: chuẩn bị giá thể ươm cây con

Thực hành 2: Ươm cây con invitro vào giá thể trồng

*Phương pháp thuần hóa cây con và chuyển cây con ra vườn ươm

Cây được lấy từ trong các lọ đã đủ tiêu chuẩn cấy

Rửa bằng nước sạch, sao cho hết phần thạch, không cho dính lại ở cây dù rất nhỏ Phân loại ra thành các dạng đã ghi rõ trong lọ cấy

Nhúng vào dung dịch chống nấm

+Đất được lấy là đất cát nhỏ, không lẫn các hạt sạn lớn

+Được trải trong sọt một lớp khoảng 4-5 cm

Bình nuôi cấy mô để điều kiện vườn

ươm (trước 1- 2 tuần)

Dùng kẹp gắp cây ra khỏi bình nuôi cấy (tránh làm tổn thương lá và rễ)

Rửa sạch agar, để ráo nước

Ngâm cây trong hóa chất tiệt trùng 5