BÀI GIẢNG THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN QUỐC TRUNG | NGUYỄN ĐỨC BÁCH TRỊNH THỊ THU THỦY | TỐNG VĂN HẢI | PHẠM THỊ DUNG Chủ biên: NGUYỄN QUỐC TRUNG BÀI GIẢNG THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2020 MỤC LỤC MỤC LỤC BÀI LẮP RÁP MƠ HÌNH CẤU T RÚC PHÂN TỬ DNA VÀ CÁC LOẠI LIÊN KẾT HÓA HỌC 1.1 MỤC TIÊU 1.2 NGUYÊN LÝ 1.2.1 Lịch sử đời mơ hình phân tử DNA 1.3 NỘI DUNG THỰC HÀNH 1.3.1 Sinh viên quan sát mơ hình cấu trúc xoắn kép DNA 1.3.2 Nhóm sinh viên tháo rời mơ hình lắp ráp lại mơ hình xoắn kép DNA 1.3.3 Thảo luận kết thực hành .6 CÂU HỎI ÔN TẬP BÀI TÁCH CHIẾT VÀ QUAN SÁT TRỰC QUAN DNA PHƢƠNG PHÁP ĐƠN GIẢN TÁCH CHIẾT DNA TỪ THỰC VẬT 2.1 MỤC TIÊU 2.2 NGUYÊN LÝ 2.3 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.3.1 Vật liệu hóa chất 2.3.2 Thiết bị 2.4 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM .9 2.4.1 Chuẩn bị 2.4.2 Tiến hành .9 2.5 NHỮNG ĐIỂM CẦN LƢU Ý CÂU HỎI ÔN TẬP 11 BÀI TÍNH CHẤT VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC CỦA AXIT NUCLEIC .12 3.1 MỤC TIÊU 12 3.2 NGUYÊN LÝ 12 3.3 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 13 3.3.1 Vật liệu 13 3.3.2 Hóa chất .13 3.3.3 Thiết bị dụng cụ 13 3.4 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM .14 3.4.1 Xác định độ tinh mẫu DNA 14 3.4.2 Đánh giá tính chất biến tính DNA 15 3.4.3 Kỹ thuật định lƣợng DNA 15 3.5 NHỮNG ĐIỂM CẦN LƢU Ý 15 CÂU HỎI ÔN TẬP 16 BÀI NGHIÊN CỨU MỐI TƢƠNG TÁC CÁC ĐẠI PHÂN TỬ SINH HỌC DNA VÀ PROTEIN 17 4.1 MỤC TIÊU 17 4.2 NGUYÊN LÝ 17 4.3 TIẾN HÀNH .18 BÀI DNA POLYMERASE VÀ QUÁ TRÌNH TÁI BẢN DNA 19 5.1 MỤC TIÊU 19 5.2 NGUYÊN LÝ 19 5.3 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT 20 5.3.1 Dụng cụ .20 5.3.2 Hóa chất .21 5.4 TIẾN HÀNH .21 5.5 CHÚ Ý .21 CÂU HỎI ÔN TẬP 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 BÀI LẮP RÁP MƠ HÌNH CẤU T RÚC PHÂN TỬ DNA VÀ CÁC LOẠI LIÊN KẾT HÓA HỌC 1.1 MỤC TIÊU - Sinh viên nắm vững đƣợc cấu tạo hoá học chuỗi xoắn kép đại phân tử DNA - Sinh viên hiểu quy luật lắp ráp đƣợc mơ hình phân tử DNA 1.2 NGUYÊN LÝ 1.2.1 Lịch sử đời mô hình phân tử DNA - Năm 1928, Girffith nhà vi sinh vật học ngƣời Anh, nghiên cứu thí nghiệm biến nạp phế cấu khuẩn gây bệnh viêm phổi - Năm 1944, Avery cộng phƣơng pháp tinh DNA, tìm đƣợc tác nhân gây biến nạp DNA - Năm 1952, Hersey Chase, sử dụng phƣơng pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ chứng minh đƣợc DNA tác nhân gây biến nạp - Năm 1953, James Watson (1928 - nay), Francis Crick (1916 - 2004), Maurice Wilkins (1916 - 2004) Rosalind Franklin (1920 - 1958) công bố cấu trúc chuỗi hố học xoắn kép DNA - Quy tắc Chargaff: • Tổng số nucleotid purine tổng số nucleotid pyrimidine; • A liên kết với T liên kết hydoro; G liên kết với C liên kết hydro; • Tỷ lệ (A+T)/(G+C) đặc trƣng cho loài - DNA có hai dạng xoắn xoắn phải xoắn trái - Về cấu hình khơng gian, DNA có ba dạng: dạng A, dạng B, dạng Z Các dạng khác chiều xoắn, mức độ xoắn mức độ tinh thể hóa Hình 1.1 Các nhà khoa học đóng góp cho phát cấu trúc chuỗi xoắn kép DNA Watson Crick, 1953 1.3 NỘI DUNG THỰC HÀNH 1.3.1 Sinh viên quan sát mơ hình cấu trúc xoắn kép DNA Nhận dạng thành phần cấu tạo phân tử DNA: - Cấu tạo nucleotide gồm thành phần chính: (i) đƣờng cacbon, (ii) nhóm phosphate, (iii) loại bazo nito; - loại bazo nito chia thành hai nhóm, purine (A, G) pyrimidine (T, C) Hình 1.2 Đƣờng Deoxiribose Hình 1.3 Nhóm Photphat Hình 1.4 loại bazo nito liên kết hydro Nhận dạng loại liên kết: - Các nucleotide mạch liên kết với liên kết phosphodiester, hình thành cấu trúc backbone; - Các nucleotide hai sợi đối song liên kết với liên kết hydro theo nguyên tắc bổ sung, purine liên kết với pyrimidine Sử dụng trục chân đế với khớp nhựa tạo trục tƣởng tƣợng mạch xoắn kép 1.3.2 Nhóm sinh viên tháo rời mơ hình lắp ráp lại mơ hình xoắn kép DNA - Gắn khớp nối trục vào chân đế - Ghép cặp bazo nito theo nguyên tắc bổ sung (chú ý chọn ống nhựa liên kết hydro nối có chiều dài phù hợp) - Lắp cặp bazzo nito lên trụ tròn (10 cặp), lƣu ý chiều mạch ngƣợc - Gắn phân tử đƣờng Deoxiribose vào bazo nito tƣơng ứng - Ghép phân tử axit Photphoric vào vị trí tƣơng ứng phân tử đƣờng - Ghép liên kết phosphodieste tạo mạch xoắn kép 1.3.3 Thảo luận kết thực hành Yêu cầu: sinh viên lắp ráp thành cơng mơ hình chuỗi xoắn kép DNA trả lời câu hỏi cuối (giáo viên hƣớng dẫn thực hành đặt câu hỏi) Hình 1.5 Mơ hình lắp ráp hồn chỉnh CÂU HỎI ƠN TẬP Sinh viên thành phần cấu tạo DNA liên kết mơ hình vừa lắp xong? Chỉ đặc điểm cấu tạo mạch đơn quy ƣớc chiều 5’-3’? Chỉ rãnh lớn (major groove) rãnh nhỏ (minor groove) mơ hình cấu trúc xoắn kép? BÀI TÁCH CHIẾT VÀ QUAN SÁT TRỰC QUAN DNA PHƢƠNG PHÁP ĐƠN GIẢN TÁCH CHIẾT DNA TỪ THỰC VẬT 2.1 MỤC TIÊU - Sinh viên hiểu đƣợc cấu trúc tế bào, vị trí DNA nằm chủ yếu nhân tế bào - Sinh viên nắm đƣợc nguyên lý phƣơng pháp tách chiết DNA từ tế bào thực vật - Sinh viên thực hành quan sát trực quan DNA kết tủa hiểu đƣợc tính chất axit nucleic bƣớc tiến hành thí nghiệm 2.2 NGUYÊN LÝ Tách chiết DNA gồm bƣớc - Lấy mẫu: Lấy mẫu, tốt mô non, không bẩn hay bị nhiễm bệnh Không nên lấy mẫu quan dự trữ nhiều protein, gluxit lipid chiết xuất phải tốn công loại bỏ tạp chất Mẫu lấy xong cần phải hạn chế hoạt động enzym DNase cách làm lạnh bỏ vào đá lạnh Phá vỡ màng tế bào màng nhân: tùy đặc điểm cấu tạo màng/thành tế bào có phƣơng pháp phá vỡ khác (nghiền, dùng enzyme, nhiệt độ cao…) Trong tế bào thịt chuối yếu nên cần dằm nát đạt yêu cầu Hoà tan DNA loại bỏ tạp chất: thành phần mẫu DNA chiết xuất thƣờng chứa protein, RNA, carbohydrate lipid, cần phải loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch DNA Kết tủa DNA: mục đích kết tủa nhằm thu đƣợc DNA dạng cô đặc bảo vệ chúng không bị phân hủy enzyme DNase cần lại hịa tan chúng theo nồng độ tùy ý Để kết tủa DNA dùng hóa chất là: Ethanol Isopropanol 2.3 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.3.1 Vật liệu hóa chất - chuối chín (có thể thay cà chua chín, hành tây, dâu tây, bơ…); - Đệm chiết: 40 mL (1.5 g salt + 10 ml detergent + 90 ml distilled water); - Ethanol 96% để lạnh: 40 mL 2.3.2 Thiết bị - Lọ thủy tinh: 02; - Thìa nhựa: 01; - Ống nghiệm thủy tinh: 05; - Giấy lọc: 01; - Bút viết kính: 01 2.4 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 2.4.1 Chuẩn bị - Pha dung dịch đệm chiết 100 mL (1.5 g salt + 10 ml detergent + 90 ml nƣớc cất); - Cài đặt bể ổn nhiệt 50 - 60oC; - Để Ethanol 96% đá tủ lạnh 2.4.2 Tiến hành - Lấy thìa thịt chuối vào lọ thủy tinh, nghiền thật kỹ thìa; - Thêm 40mL đệm chiết đảo thìa; - ủ bể ổn nhiệt/tủ định ơn 50 - 60°C 10 phút phút lắc nhẹ; - Trong lúc chờ đợi, sinh viên chuẩn bị giấy/vải lọc lọ thủy tinh mới; - Lấy hỗn hợp khỏi bể ổn nhiệt; - Cẩn thận dùng giấy/khăn lọc hỗn hợp, thu dịch vào lọ thủy tinh Bƣớc để loại bỏ xác tế bào cụ tế bào thừa sau phá màng; - Chia vào ống nghiệm thủy tinh 5mL dịch chiết; - Giữ ống nghiệm nghiêng góc 45o đổ nhẹ nhàng Ethanol 96% lạnh chảy từ từ theo thành ông nghiệm xuống bề mặt dung dịch; - Cắm ống nghiệm thẳng đứng vào giá, quan sát - phút; - Quan sát vẩn DNA kết tủa trắng đục lên từ lớp hỗn hợp phía dƣới lên lớp dung dịch ethanol phía 2.5 NHỮNG ĐIỂM CẦN LƢU Ý - Kiểm tra mực nƣớc trƣớc bật bể ổn nhiệt; - Tắt thiết bị sau sử dụng; - Đệm chiết chứa chất tẩy rửa giúp hòa tan lớp màng tế bào cấu tạo từ lớp lipid kép; - Dung dịch muối làm cho phân tử DNA kết dính vào dễ kết tủa KỸ THUẬT SỬ DỤNG MICROPIPET Micropipet đƣợc phân loại theo ngƣỡng thể tích dung dich hút đƣợc: ngƣỡng thể tích pipet thƣờng đƣợc ghi thân nút bấm Phần đầu pipet không tiếp xúc trực tiếp với dung dịch mà thơng qua đầu tip (típ) sử dung lần Mỗi loại micropipet sử dụng loại đầu tip khác Khi sử dụng phải lắp đầu tip với loại pipet phù hợp  Pipet 1000-5000l dùng đầu tip TRẮNG  Pipet 100 - 1000l dùng đầu tip XANH*  Pipet 10-100l dùng đầu tip VÀNG*  Pipet 2-20l dùng đầu tip VÀNG  Pipet 0,5-10l dùng đầu tip TRẮNG*  Pipet 0,1 - 2,5l dùng đầu tip TRẮNG Nút bấm pipet có nấc bấm: Nấc 1: bấm nhẹ, dùng hút bơm dụng dịch với thể tích điều chỉnh; Nấc 2: bấm nặng, dùng để bơm dung dịch cịn sót đầu tip sau bấm nấc 10 Thao tác dùng micropipet hút dung dịch: Lắp đầu tip vào pipet: lắp đầu tip phải đảm bảo thật khít với đầu pipet, tránh chạm đầu tip vào tay thứ khác Chỉnh thể tích hút: vặn quan sát số phận chỉnh thể tích - Lƣu ý: sử dụng pipet để hút thể tích chất lỏng tƣơng ứng với thể tích ghi nhãn KHƠNG đƣợc điều chỉnh thể tích vƣợt ngƣỡng cho phép Hút vào: bấm hết nấc nút bấm trƣớc nhúng đầu tip vào dung dịch, nhúng đầu tip vào dung dịch thả nút bấm từ từ hết nấc bấm Lƣu ý: Pipet dụng cụ có chi tiết nhựa, cao su lò xo thép nên trƣờng hợp KHÔNG đƣợc ngửa phần đầu hút pipet lên để tránh chất lỏng chảy ngƣợc vào piston pipet Bơm ra: đặt đầu tip chạm vào thành ống nghiệm đựng dung dịch, bấm nút bấm bơm dung dich từ từ, hết nấc bấm mà dung dịch chƣa hết bấm mạnh nấc nhấc pipet lên Loại bỏ đầu tip: bấm nút loại đầu tip bỏ đầu tip vào cốc đựng rác CÂU HỎI ÔN TẬP Vai trò đệm chiết tách chiết DNA Tác dụng ethanol/isopropanol tách chiết DNA Giải thích khó khăn việc phá màng tế bào thực vật? Thuận lợi việc sử dụng thịt chuối để tách chiêt DNA? 11 BÀI TÍNH CHẤT VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC CỦA AXIT NUCLEIC 3.1 MỤC TIÊU - Sinh viên hiểu đƣợc tính chất vật lý hóa học axit nucleic bao gồm tính chất tích điện âm, biến tính hồi tính, hấp thụ ánh sáng bƣớc sóng 260nm - Sinh viên biết cách phân biệt protein axit nucleic dựa vào khác biệt tính chất vật lý hóa học nhƣ phổ hấp thụ ánh sáng cực đại bƣớc sóng 280nm, có mặt liên kết - SH tự - Hiểu đƣợc nguyên lý hoạt động biết cách sử dụng máy đo quang phổ (dải UV) cách phân tích số liệu bao gồm: độ hấp thụ (Abs/OD), dịch chuyển phổ hấp thụ DNA sợi đơn sợi đôi 3.2 NGUYÊN LÝ Axit nucleic gồm loại DNA RNA Phân tử DNA xoắn kép gồm mạch polynucleotide từ đơn phân nucleotide Cấu trúc phân tử DNA đƣợc Watson Crick công bố năm 1953 Phân tử RNA mạch đơn cấu tạo từ ribonucleotide Axit nucleic tích điện âm (do nhóm phosphat đầu 5’) Phân tử DNA có khả biến tính nhiệt độ cao, nồng độ urea Biến tính tƣợng mạch phân tử DNA tách rời Sự biến tính DNA phụ thuộc vào chiều dài thành phần base nitơ phân tử DNA Axit nucleic có khả hấp thụ ánh sáng cực đại bƣớc sóng 260nm phân tử protein hấp thụ cực đại bƣớc sóng 280nm Dựa vào đặc điểm ngƣời ta phân biệt, định tính, định lƣợng xác định độ mẫu axit nucleic Với lƣợng axit nucleic đơn vị thể tích (dung dịch), độ hấp thụ ánh sáng khác mẫu DNA mạch kép (dsDNA), DNA sợi đơn (ssDNA) RNA sợi đơn (ssRNA) Phân tử dsDNA có độ hấp thụ ánh sáng thấp so với phân tử DNA sợi đơn RNA Nguyên nhân tƣợng che khuất ánh sáng xảy điều kiện thí nghiệm Chính vậy, định lƣợng DNA với đơn vị hấp thụ ánh sáng bƣớc sóng 260nm (A260), hàm lƣợng dsDNA, ssDNA ssRNA khác (xem công thức chuyển đổi dƣới đây) Chính vậy, phân tử dsDNA bị biến tính tách thành sợi đơn có biến đổi giá trị độ hấp thụ ánh sáng - A260 dsDNA = 50 μg/ml - A260 ssDNA = 37 μg/ml - A260 ssRNA = 40 μg/ml Tùy thuộc vào chiều dài trình tự, bị đun nóng, hai mạch phân tử DNA tách Hiện tƣợng gọi biến tính DNA Nhiệt độ mà ½ lƣợng DNA 12 mạch kép (dsDNA) bị tách thành mạch đơn (ssDNA) đƣợc gọi nhiệt độ nóng chảy, Tm (Hình 3.1) Khi nhiệt độ giảm xuống từ từ, hai mạch đơn phân tử DNA bắt cặp bổ sung (lai) với hình thành phân tử DNA sợi kép Trong điều kiện có mặt chất biến tính (urea) sau đun sơi nhiệt độ giảm đột ngột (đặt vào nƣớc đá) hỗn hợp mẫu DNA có nhiều phân tử DNA sợi đơn Việc thay đổi đƣợc quan sát máy đo quang phổ bƣớc sóng 260nm Hình 3.1 Nhiệt độ nóng chảy phân tử DNA Hình 3.2 Phổ hấp thụ DNA, RNA protein 3.3 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 3.3.1 Vật liệu - DNA Lamda gốc có nồng độ μg/μl: 01 (mẫu A); - Mẫu DNA tổng số tách chiết từ lúa: 02 (mẫu B C) 3.3.2 Hóa chất - Dung dịch TE (10mM Tris-HCl, 1mM Na2EDTA); - Nƣớc khử Ion 3.3.3 Thiết bị dụng cụ - Máy đo quang phổ UV-VIS dải ánh sáng từ 110 -1200 nm: 01; - Micro cuvette thủy tinh thạch anh (Quarzt): 02; - Block nhiệt (thermo plate): 01; - Pipette mL: 02; - Đầu tip mL: 1x55 hộp; - Ống eppendorf 1,5 mL: 5x5; 13 - Cốc đá: 01; - Bút viết kính: 1x5; - Giấy lau: 1x5 hộp 3.4 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 3.4.1 Xác định độ tinh mẫu DNA - Tiến hành đo độ hấp thụ quang bƣớc sóng 260 280nm; - Đo lặp lại mẫu lần; - Tính tỉ lệ độ hấp thụ A260/A280 phân tích Hệ thống máy đo quang phổ Cách đặt đầu tuýp nhả lượng dịch nhỏ - Hút 90μl nƣớc khử Ion ống eppendorf 0,2ml, bổ sung 10μl dung dịch DNA lambda nồng độ μg/μl đƣợc dung dịch có nồng độ 0,2μg/μl - Hút 50 μl dung dịch pha loãng cho vào ống eppendorf 0,2 ml, đậy nắp chặt cho vào máy đun nóng đặt sẵn nhiệt độ 100ºC phút sau lấy cho vào khay đá (mẫu 2) 14 - Tƣơng tự, hút 50 μl dung dịch pha loãng cho vào ống eppendorf 0,2 ml, đậy nắp chặt cho vào máy đun nóng đặt sẵn nhiệt độ 100ºC phút sau để nguội từ từ (mẫu 3) - Pha loãng dung dịch protein BSA dung dịch đệm Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 Nồng độ cuối 0,1mg/ml (tƣơng đƣơng 0,1μg/μl) - Đặt nhiệt độ máy đun nóng 100ºC, chuẩn bị khay đá - Bật máy đo UV-VIS, cài đặt chƣơng trình (theo hƣớng dẫn giáo viên) 3.4.2 Đánh giá tính chất biến tính DNA - Hút 90μl dung dịch TE ống eppendorf 0,2ml, bổ sung 10μl dung dịch DNA lambda nồng độ 1μg/ μl đƣợc dung dịch có nồng độ 0,2μg/μl (mẫu 1) - Hút 50μl dung dịch pha loãng cho vào ống eppendorf 0,2ml, đậy nắp chặt cho vào máy đun nóng đặt sẵn nhiệt độ 100ºC phút sau lấy cho vào khay đá (mẫu 2) - Tƣơng tự, hút 50μl dung dịch pha loãng cho vào ống eppendorf 0,2ml, đậy nắp chặt cho vào máy đun nóng đặt sẵn nhiệt độ 100ºC phút sau để nguội từ từ (mẫu 3) - Hút 1μl mẫu 1, cho vào micro cuvette đo độ hấp thụ ánh sáng dải UV bƣớc sóng 260 280 nm Ghi lại số liệu thu đƣợc Yêu cầu: So sánh số liệu đo từ mẫu 1, Giải thích kết 3.4.3 Kỹ thuật định lƣợng DNA Hút 100μl dung dịch protein BSA có nồng độ 0,1μg/μl cho vào ống eppendorf Hút lƣợng thể tích phù hợp cho vào microcuvette đo dải bƣớc sóng từ 180 đến 1000nm Quan sát đỉnh hấp thụ giá trị hấp thụ bƣớc sóng 230, 260 280nm tƣơng ứng polysaccharide, axit nucleic protein Yêu cầu: Xác định giá trị OD (optical density) mẫu bƣớc sóng 230, 260 280nm phát đỉnh hấp thụ protein So sánh giá trị OD bƣớc sóng thu đƣợc 3.5 NHỮNG ĐIỂM CẦN LƢU Ý - Thao tác sử dụng với microcuvette địi hỏi thao tác cẩn thận xác Khi lau microcuvette phải sử dụng giấy không bụi Máy đo quang phổ: 15 Là thiết bị thƣờng đƣợc sử dụng để xác định hàm lƣợng số chất nhƣ Protein, DNA, chlorophil, tinh bột… dung dịch dựa vào mức độ hấp thụ cực đại bƣớc sóng ánh sáng khác tƣơng ứng với loại dung dịch Dựa vào công thức đồ thị chuẩn xác định đƣợc hàm lƣợng chất Hiện nay, số máy đại hiển thị thông số dung dịch cần đo nhƣ hàm lƣợng protein, DNA, polysacharide… CÂU HỎI ÔN TẬP Tính chất biến tính hồi tính DNA thực tế đƣợc ứng dụng trƣờng hợp nào? Giải thích phân tử DNA protein lại hấp thụ ánh sáng bƣớc sóng 260nm 280nm? Ngoài cách phân biệt protein DNA dựa vào phổ hấp thụ ánh sáng có mặt nhóm thiol (-SH), cịn phân biệt cách nào? 16 BÀI NGHIÊN CỨU MỐI TƢƠNG TÁC CÁC ĐẠI PHÂN TỬ SINH HỌC DNA VÀ PROTEIN 4.1 MỤC TIÊU - Sinh viên đƣợc tìm hiểu mối tƣơng tác ý nghĩa DNA protein thể sống - Sinh viên tiến hành đƣợc thí nghiệm chứng minh mối tƣơng tác DNA protein 4.2 NGUYÊN LÝ - Đại phân tử DNA đƣợc cấu tạo từ đơn phân nucleotide Ở sinh vật nhân chuẩn (Eukaryote), hầu hết lƣợng DNA tập trung nhân tế bào (chiếm tới 98 99%), đƣợc tổ chức chặt chẽ cấu trúc nhiễm sắc thể (NST) Đối với sinh vật nhân sơ, DNA tập trung dƣới dạng vòng kép, dạng búi - Sợi kép DNA mang điện tích âm (do cấu trúc nucleotide có nhóm 3-OH đầu 5-phosphat), cuộn xoắn với protein histon mang điện tích dƣơng để đảm bảo trung hồ điện cho tế bào Histone protein cấu trúc NST H2A H2B, H3 H4 hình thành histone octamer Phân tử DNA cuộn 1.7 lần (khoảng 146 bp) quanh Histone octamer để hình thành cấu trúc nucleosome Hình 4.1 DNA cuộn xoắn với protein histone hình thành cấu trúc nucleosome - RNA polymerase phải bám vào vị trí vùng promoter, phiên mã đƣợc diễn - Đối với sinh vật nhân sơ (prokaryote) giai đoạn khởi động, yếu tố sigma gắn vào vị trí promoter: gắn cách lỏng lẻo vị trí -35, sau đó, hộp Pribnov (TATA box) tháo xoắn dần tạo sợi đơn DNA làm khuôn để phiên mã 17 Hình 4.2 Sự tƣơng tác DNA yếu tố phiên mã trình phiên mã Nhƣ vậy: DNA protein có mối tƣơng tác với trình biểu gen 4.3 TIẾN HÀNH - Chuẩn bị ống eppendorf chứa: Nƣớc cất khử trùng DNA DNA + Protein - Tiến hành phản ứng chạy điện di gel agarose 1% để kiểm tra khả di chuyển DNA phức hợp DNA protein điện trƣờng dòng điện chiều - Kết quả: Yêu cầu: sinh viên tiến hành thí nghiệm giải thích kết thí nghiệm cách nộp báo cáo thực hành 18 BÀI DNA POLYMERASE VÀ QUÁ TRÌNH TÁI BẢN DNA 5.1 MỤC TIÊU - Sinh viên hiểu đƣợc vai trò enzyme DNA polymerase q trình nhân đơi tế bào thơng qua việc ức chế hoạt động enzyme chất ức chế đặc hiệu - Sinh viên biết cách nuôi cấy vi khuẩn, đếm số lƣợng tế bào phƣơng pháp đo quang phổ xác định tế bào sống cách đếm khuẩn lạc 5.2 NGUYÊN LÝ Để nhân đôi tế bào (nguyên phân) tế bào phải nhân đôi DNA pha S (Hình 5.1) Enzyme DNA polymerase thực trình chép DNA Nếu DNA khơng đƣợc chép tế bào phân chia Trong tự nhiên nhiều hợp chất có khả ức chế hoạt động enzyme DNA polymerase chúng ức chế phân chia tế bào Hình 5.1 Chu kỳ tế bào Một số hợp chất thuộc loại glycolipid thực vật bậc cao (hình 5.2) có tác dụng ức chế hoạt động enzyme DNA polymerase nhƣ: monogalactosyl diacylglycerol (MGDG), digalactosyl diacylglycerol (DGDG) sulfoquinovosyl diacylglycerol (SQDG) 19 Hình 5.2 Các hợp chất có khả ức chế DNA polymerase spinach Gần MGDG đƣợc sử dụng làm chất kháng viêm ứng chế phát triển khối u ung thƣ dày thông qua tác dụng ức chế hoạt động enzyme DNA polymerase Khi tế bào tiến hành nhân đôi, MGDG ức chế làm cho tế bào dừng phân chia kỳ G1, dẫn đến kích hoạt chế tự chế tế bào (apoptosis) (Hình 5.3) Hình 5.3 Cơ chế ức chế trình tái DNA MGDG Trong thực hành, sinh viên thực thí nghiệm kiểm tra ảnh hƣởng MGDG lên hoạt động enzyme DNA polymerase thông qua đánh giá nhân lên tế bào vi khuẩn E.coli tăng lên theo thời gian nuôi mơi trƣờng dinh dƣỡng có bổ xung MGDG 5.3 VẬT LIỆU, HĨA CHẤT 5.3.1 Dụng cụ - Ống Falcol ni cấy vi khuẩn 50 mL sạch, khử trùng: 10 ống (2 ống/nhóm); 20 - Máy lắc ấm 37ºC: máy có nhiều vị trí đặt bình ni; - Máy đo quang phổ: có cuvet; - Pipet mL: 02; - Đầu tip mL (2 hộp; - Bút viết kính, giấy lau 5.3.2 Hóa chất - Dung dịch vi khuẩn gốc; - Môi trƣờng nuôi cấy (Môi trƣờng LB lỏng đặc đƣợc pha sẵn); - Monogalactosyl Carbosynth; diacylglycerol (MGDG) (C45H74O10) [MM29186, - Nƣớc cất - Trƣớc buổi học ngày, sinh viên tiến hành nuôi cấy vi khuẩn ống có bổ sung 5μg/mL MGDG ống không bổ sung MGDG 5.4 TIẾN HÀNH Chia nhóm: Sinh viên chia thành nhóm, nhóm - ngƣời Chuẩn bị ống ni cấy: nhóm ống ghi rõ ký hiệu (tên sv đại diện, ngày bắt đầu nuôi) - Đổ mL môi trƣờng nuôi vào ống Falcol - Dùng pipet hút 0,25 ml dịch vi khuẩn cho vào ống Bổ sung μl MGDG nồng độ μg/mL vào bình (đánh dấu +, ống cịn lại đánh dấu -) Ni cấy 37ºC, tốc độ lắc 200 vịng/ phút 24 Đánh giá phát triển (nhân lên) vi khuẩn: - Dừng máy lắc, hút 100 μl dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống eppendorf - Pha loãng với nƣớc cất theo tỉ lệ: 1/10 - Đếm số lƣợng tế bào vi khuẩn buồng đếm máy đo quang phổ bƣớc sóng 600 nm tính theo cơng thức OD600 = tƣơng đƣơng với 108 tế bào/mL So sánh số lƣợng tế bào E.coli ống để đánh giá hiệu ức chế enzyme DNA polymerase chất MGDG 5.5 CHÚ Ý - Sinh viên hiểu rõ mục đích thực hành nắm đƣợc cách tiến hành thí nghiệm - Sinh viên nuôi cấy đƣợc vi khuẩn xác định đƣợc số lƣợng tế bào vi khuẩn dịch ni cấy 21 CÂU HỎI ƠN TẬP Vai trị enzyme DNA polymerase nguyên phân vi khuẩn? Nêu tác dụng chất ức chế monogalactosyl diacylglycerol (MGDG) lên DNA polymerase ứng dụng? 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO Carson S., Miller H B & D Witherow S (2012) Molecular Biology Techniques: A Classroom Laboratory Manual Third edition, Elservier Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2008) Sinh học phân tử NXB giáo dục, Hà Nội Kimble M & Schirmer A., (2015) General Genetics Laboratory Manual Kendall Hunt Publishing; edition Phan Hữu Tôn (2009) Giáo trình Sinh học phân tử đại cƣơng NXB nào? 23