Bài giảng lý thuyết sinh học phân tử DNA replication

DNA Replication• Sao chép DNA thực hiện nhanh và chính xác • DNA xoắn kép được tách ra làm khuôn tổng hợp hai mạch mới • Nhiều enzyme tham gia vào quá trình sao chép • Quá trình được bắt

SINH HỌC PHÂN TỬ

PGS.TS Trương Xuân Liên

Nội dung :

1/ Quá trình Sao chép của DNA (4T)

Sao chép DNA Quá trình sửa chữa DNA

2/ Quá trình phiên mã (4T)

Các loại RNA Quá trình phiên mã

Mã di truyền

3/ Sinh tổng hợp protein (2T)

Quá trình dịch mã Các yếu tố ức chế quá trình dịch mã

SAO CHÉP DNA

DNA : Chất liệu di truyền của sự sống

Figure 16.7a, c

C T A

A T

C G G C

A

A T

A T

T A

C T A

0.34 nm 3.4 nm

(a) Key features of DNA structure

truyền của tế bào sống ?

• Trước đây, các nhà khoa học đã từng

nghĩ rằng proteine là chất liệu di truyền

của tế bào sống vì proteine có cấu trúc

phức tạp hơn DNA : proteine có cấu tạo từ

20 loại amino axit khác nhau tạo thành

những chuỗi polypeptide dài

copyright cmassengale

Thí nghiệm của Federick Griffith 1928

hiện tượng biến nạp ( transformation)

Living S cells

(control)

Living R cells (control)

Mouse healthy Mouse healthy Mouse dies RESULTS

 DNA có thể mang tín hiệu di truyền của tế bào

St.Pneumoniae : Dạng S có vỏ bao , chủng độc lực ,

Dạng R không có vỏ bao, không độc lực

tính gây bệnh từ

tế bào S bị đun chết đã truyền sang tế bào R

Thí nghiệm của Oswald T Avery’s - 1944

8

 DNA là nhân tố biến nạp mang tín hiệu di truyền

( chứ không phải RNA hay proteine )

Cho DNA hoặc RNA của vi trùng thể S vào dung dịch nuôi

cấy vi trùng R

3. Gây nhiễm E coli bacteria với 2

loại phage T2 đã được đánh dấu

4 32 P được phát hiện trong vi khuẩn

và các phage mới , trong khi đó

35 S is không được tìm thấy trong

vi khuẩn.

Thí nghiệm của Hershey-Chase Bacteriophage - 1953

DNA mới chính là vật chất di truyền của của phage T2

Erwin Chargaff phát hiện cấu tạo của phân tử DNA

1947 DNA có cấu tạo từ 4 nucleotide

A denine, T hymine, G uanine, C ytosine

A = 30.3% G = 19.5%

T = 30.3% C = 19.9%

copyright cmassengale

A denin kết hợp với T hymine

G uanine kết hợp với C ytosine

Định luật Chargaff

Rosalind Franklin : sử dụng kỹ thuật phân

tích dùng tán xạ tia X chụp tinh thể DNA

copyright cmassengale

James D Watson & Francis H Crick 1953

• Xây dựng thành công mô hình

cấu trúc phân tử DNA dựa trên 2

phát kiến :

2 Các nghiên cứu bằng tia của Rosalind

Franklin & Maurice H F Wilkins

Cấu trúc của DNA

DNA có cấu trúc xoắn kép với các vòng xoay đều có chiều dài 3.4

nm Khoảng cách giữa các nucleotide là 0.34 nm Đường kính 2nm

1962: Giải Nobel Sinh lý học và Y khoa :

James D.

“Khám phá liên quan đến cấu trúc phân tử của axit nucleic và ý nghĩa của nó trong việc chuyển tải

thông tin chất liệu sống ".

Các nucleotide của hai sợi liên kết với nhau bằng các cầu

hydrogen theo nguyên tắc bổ xung A với T, G với C

Hydrogen bond

Cấu trúc xoắn kép của DNA (double helix structure)

gồm 2 mạch polynucleotide bắt cặp bổ xung

Phosphate group Nitrogenous base

Sugar

Polynucleotide Sugar-phosphate backbone

DNA nucleotide

Phosphate group

Nitrogenous base (A, G, C, or T)

Thymine (T)

Sugar (deoxyribose)

Pyrimidines

Thymine (T) Cytosine (C)

Purines Adenine (A) Guanine (G)

Cấu trúc chuỗi polynucleotide

Chuỗi polypeptide có cấu trúc từ 4 loại

Guanine G Thymine T Cytosine C

Các nucleotide được nối với nhau bằng

dài có định hướng :

3 end

5 end

3end Hydrogen bond

Quá trình sao chép của DNA

Sao chép DNA

(a) The parent molecule has two

complementary strands of DNA.

Each base is paired by hydrogen

bonding with its specific partner,

A with T and G with C.

(b) The first step in replication is

separation of the two DNA strands.

(c) Each parental strand now

serves as a template that determines the order of nucleotides along a new, complementary strand.

(d) The nucleotides are connected

to form the sugar-phosphate backbones of the new strands Each “daughter” DNA

molecule consists of one parental strand and one new strand.

A C T A G

A C T A G

T G A T C

T G A T C

A C T A G

A C T A G

T G A T C

T G A T C

T G A T C

T G A T C

Trong quá trình sao chép, hai mạch đơn của phân tử DNA mẹ được tách ra và mỗi mạch sẽ làm khuôn để tổng hợp mạch mới theo nguyên tắc bổ xung với các base trên mạch khuôn (A-T , G-C)

Các giả thuyết về quy luật sao chép của DNA

• DNA sao chép trong quá trình phân chia của tế bào

• Có ba giả thuyết về quy luật sao chép của DNA

Thí nghiệm của Meselson-Stahl

Bacteria transferred to medium containing

14 N

Less dense

More dense

 E.coli được nuôi trong môi trường có

isotope nặng ( 15N ).

 Chuyển sang môi trường nuôi cấy chỉ

định với các isotope nhẹ

 DNA được chiết tách và ly tâm sau 20

phút (sau lần sao chép đầu) và sau 40 phút (sau lần sao chép thứ 2) cho thấy :

=> Sao chép lần đầu : chi tạo ra một băng DNA lai (15N-14N), loại trừ giả thuyết bảo tồn.

DNA nhẹ và DNA lai loại trừ giả thuyết sao chép phân tán và ủng hộ giả thuyết bán bảo tồn

DNA sao chép theo quy luật bán bảo tồn

DNA sao chép theo quy luật bán bảo tồn

Sao chép DNA theo quy luật bán bảo tồn

• Mỗi phân tử con chỉ

mang một sợi mới

• Sợi DNA gốc được

Chĩa ba sao chép

Sợi mới tổng hợp

Chĩa ba sao chép

Vùng đang sao chép

Vùng đang sao chép

DNA Replication

• Sao chép DNA thực hiện nhanh và chính xác

• DNA xoắn kép được tách ra làm khuôn tổng hợp hai mạch mới

• Nhiều enzyme tham gia vào quá trình sao chép

• Quá trình được bắt đầu từ một điểm khởi sự sao chép

(origins of replication) nơi hai mạch của DNA tách ra

Tế bào procaryote chỉ có một

điểm khởi đầu sao chép

Điểm khởi đầu sao chép

• Tế bào Eucaryote có hàng trăm đến hàng nghìn điểm khởi đầu

Replication begins at specific sites

where the two parental strands

separate and form replication

bubbles.

The bubbles expand laterally, as

DNA replication proceeds in both

directions.

Eventually, the replication

bubbles fuse, and synthesis of

the daughter strands is

Two daughter DNA molecules

In eukaryotes, DNA replication begins at many sites along the giant

DNA molecule of each chromosome. In this micrograph, three replicationbubbles are visible along the DNA of

a cultured Chinese hamster cell (TEM).

(b) (a)

0.25 µm

Quá trình sao chép bắt đầu từ

một vị trí được gọi là điểm khởi

đầu sao chép nơi hai mạch của

DNA mẹ tách ra hình thành vòng

sao chép

Vòng sao chép sẽ lan dần theo

hai hướng do quá trình sao chép

được thực hiện trên cả hai mạch

Vòng sao chép lan tỏa cho

đến khi các chĩa ba sao

chép kế cận tiếp xúc với

nhau

Cơ chế nhân đôi của DNA (DNA Replication)

• DNA polymerase III không tự bắt

đầu tổng hợp chuỗi polypetide

mà cần có một đoạn mồi ngắn Ở

đầu 3’ của mạch khuôn, RNA

primase nối các ribonucleotide

bắt cặp bổ xung tạo nên đoạn mồi

ngắn)

• DNA polymerase III gắn tiếp các

desoxinucleotides vào đầu 3’ của

đoạn mồi và tiếp tục ,kéo dài

mạch mới theo hướng 5’-3’

• DNA polymerase 1 sẽ cắt đoạn

RNA mồi và thay vào đó các

desoxinucleotide tương ứng

• Mạch DNA mới được tổng hợp

DNA polymerase I degrades the RNA primer and

replaces it with DNA

DNA polymerase III adds nucleotides to primer

DNA pol III gắn các nucleotide vào đoạn mồi

DNA pol I phá hủy đoạn RNA mồi & thay thế bằng DNA

Sơi DNA con mới được tổng hợp

• Nucleotides gắn vào theo nguyên tắc bổ xung với các base trên mạch khuôn

• Mạch DNA mới được kéo dài theo chiều 5’  3’

• Nusleotide được hoạt hóa nhờ ATP để thành nucleoside triposphat trước khi gắn vào nhóm OH tự do ở đầu 3’ của sợi polynucleotide đang được tổng hợp

• DNA polymerase có tính đặc hiệu cao chỉ thêm nucleotide vào đầu 3’OH của mạch đang được tổng hợp

DNA polymerase

Pyrophosphate

Cơ chế sao chép của DNA

Quá trình sao chép DNA

Giai đoạn khởi sự :

1 Proteine B đặc hiệu nhận biết và gắn vào điểm khởi sự sao chép (ori)

2 Enzyme gyrase ( topoisomerase) cắt DNA làm tháo xoắn ở 2 phía của proteine B

3 Enzyme helicase làm đứt các mối liên kết hydro giữa 2 base bắt cặp tạo thành chẻ ba sao chép

4 Các proteine SSB ( Single Strand Binding) gắn vào các mạch đơn DNA giữ cho chúng tách nhau, thẳng ra và ngăn không cho lai

ngẫu nhiên hoặc xoắn lại để việc sao chép được dễ dàng

Giai đoạn nối dài :

đoạn mồi RNA primese tổng hợp một đoạn RNA mồi ngắn bắt cặp

bổ xung với các nucleotide ở đầu 3’ của mạch khuôn

để tạo nên mạch mới bổ sung theo hướng 5’3’

Phân tử DNA gồm hai mạch đối song song, khi tách ra để sao chép tạo một chẻ ba sao chép ( replication fork ).

khuôn quá trình tổng hợp sẽ hướng từ ngoài vào chẻ ba được gọi

là mạch trước (leading strand), còn ở mạch khuôn kia sẽ tổng hợp mạch sau ( lagging strand) theo chiều từ chẻ ba sao chép hướng ra ngoài bằng cách tạo ra các đoạn DNA ngắn (Okazaki ) rồi nối lại với nhau

Các Enzymes trong sao chép DNA

Helicase tách sợi DNA

xoắn kép

Proteine giữ cho hai mạch tách rời nhau

DNA polymerase III

nối các nucleotide tạo

thành mạch mới

Ligase nối các đoạn Okazaki và hàn kín mạch

Primase tổng hợp đoạn mồi bắt cặp với mạch khuôn

DNA polymerase I (Exonuclease) cắt bỏ đoạn mồi và thay vào đó các base thích hợp

Các men & proteine tham gia vào quá trình sao chép

 DNA helicases cắt cầu nối hydro  tách hai mạch của sợi DNA

 RNA primase tổng hợp đoạn mồi RNA ngắn để các nucleotides sẽ gắn tiếp.

 DNA polymerase III gắn các nucleotide kéo dài đoạn mồi theo chiều 5’ 3’

 DNA polymerase I cắt đoạn mồi RNA và thay vào đấy DNA

 DNA ligase nối liền các đoạn DNA thành mạch liên tục.

Overall direction of replication

DNA pol III

Replication fork

Leading strand

DNA ligase Primase

OVERVIEW

Primer DNA pol III

DNA pol I

Lagging strand

Lagging strand

Leading strand

Leading strand

Lagging strand Origin of replication

• Trên một mạch khuôn từ đầu 3’,

DNA mới được tổng hợp liên tục

tạo nên mạch trước (leading) và chỉ

cần một đoạn mồi

• Trên mạch khuôn kia , mạch DNA

mới được gọi là mạch sau hay

mạch chậm (Lagging) cũng được

tổng hợp theo chiều 5’-3’ nên sự

tổng hợp sẽ gián đoạn đi từ chẻ ba

hướng ra ngoài và cần nhiều đoạn

mồi để tạo thành các phân đoạn

DNA (Okazaki) Các đoạn Okazaki

được gắn lại với nhau nhờ men

Lagging strand

DNA pol III

Template strand

Leading strand Lagging strand

DNA ligase

Template strand

Overall direction of replication

Cơ chế sao chép của DNA

Binding proteins giữ cho hai mạch khuôn tách rời

Helicase gắn vào mạch DNA ở vị trí và tách hai mạch của phân tử DNA

Replication

3’

DNA polymerase III nối các DNA nucleotides

vào đoạn mồi RNA.

Hướng sao chép

DNA polymerase kiểm soạt và sửa chữa những nucleotide gắn sai.

Replication

Hướng sao chép

Okazaki fragment

Mạch trước tổng hợp liên tục theo chiều 5’-3’

Mạch sau tổng hợp gián đoạn các đoạn Okazaki theo chiều 5’-3’

Replication

Hướng sao chép

3’ 5’

3’ 5’

DNA polymerase I nhờ hoạt tính Polymerase lắp các dexoribonucleotide phù hợp thay thế

Ligase sẽ xúc tác tạo các cầu nối giữa các phân tử đường-phosphat trên mỗi mạch cơ bản hay còn gọi là mạch xương sống ( backbone ).

3’ 5’

Replication Fork Overview

Overall direction of replication

DNA pol III

Replication fork

Leading strand

DNA ligase Primase

OVERVIEW

Primer DNA pol III

DNA pol I

Lagging strand

Lagging strand

Leading strand

Leading strand

Lagging strand Origin of replication

Quá trình sửa sai

• Sửa sai trong sao chép

– DNA polymerase (DNA pol III) có thể gắn sai nucleotide

– DNA pol có khả năng nhận biết các sai lầm và tức thời

sửa chữa những sai sót nhờ hoạt tính polymerase &

3’exonuclease những nucleotide bị gắn nhầm sẽ được loại bỏ và thay bằng các nucleotide phù hợ[  tỷ lệ nhầm

– Sửa chữa gắn không phù hợp : những base gắn không

đúng vị trí có thể được thay thế cho đúng

Sửa sai khi không sao chép

Phân tử DNA có thể bị biến đổi ngay cả khi không sao

chép

bởi các yếu tố hóa học, phóng xạ…Các biến đổi này xảy

ra vời tần xuất khá cao Nhờ các cơ chế sửa sai nên tần số đột biến được duy trì ở mức độ thấp

Các enzyme nhận biết gắn vào trình tự sai và cắt rời đoạn sai và mạch đơn đúng được dùng làm khuôn để tổng hợp lại chỗ bị cắt cho đúng

Rà soát và sửa chữa DNA

• DNA polymerases rà soát

mạch DNA mới sao chép và

thay thế những nucleotide

sai

• Sửa chữa sai do không phù

hợp, các men sẽ thay thế các

base đúng trong các cặp base

• Cắt để sửa , men sửa chữa

nucleases cắt đoạn hư hỏng

và tổng hợp đoạn DNA thay

thế mới

Nuclease

DNA polymerase

DNA ligase

A thymine dimer distorts the DNA molecule.

2

Repair synthesis by

a DNA polymerase fills in the missing nucleotides.

Sửa lỗi DNA

Sai sót trên

mạch DNA

bên trái

DNA nucleoses cắt vùng sai sót

DNA polymerase tổng hợp một đoạn mới bên mạch trái dùng mạch phải làm khuôn

DNA ligase nối liền chỗ đứt ở mạch trái

Có rất nhiều enzyme đặc hiệu làm nhiệm vụ dò tìm và sửa chữa sai sót trên phân tử DNA