MỞ ĐẦU SINH HỌC PHÂN TỬ, ỨNGDỤNG CÔNG NGHỆ SINHHỌC, TRONG Y DƯỢC
BÀI 4: MỞ ĐẦU SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG Y DƯỢC Mở đầu sinh học phân tử: 1.1 Kỹ thuật PCR; Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) phương pháp khuếch đại nhanh nhiều đoạn DNA mà khơng qua tạo dòng Phương pháp Kary B Mullis đưa năm 1985 Phương pháp PCR thực hoàn toàn eppendoff có độ nhạy cao thời gian ngắn ta thu nhận nhiều DNA Kỹ thuật PCR ứng dụng nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính phơi, giải mã di truyền, tạo giống với đột biến định hướng, nghiên cứu tiến hoá sinh vật mức độ phân tử,… a Nguyên tắc Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) phương pháp tổng hợp DNA dựa mạch khn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA Primer đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với mạch đoạn DNA khuôn nhờ hoạt động DNA polymerase đoạn primer kéo dài để hình thành mạch Kỹ thuật PCR hình thành dựa đặc tính DNA polymerase, đoạn DNA nằm hai primer khuếch đại thành số lượng lớn đến mức thấy sau nhuộm ethidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích khác thao tác gel Như vậy, để khuếch đại trình tự DNA xác định, cần phải có thơng tin tối thiểu trình tự DNA, đặc biệt làm trình tự base hai đầu đoạn DNA đủ để tạo primer bổ sung chuyên biệt Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm bước sau: Bước 1: (Biến tính tách đơi sợi DNA, denaturation) Giai đoạn thực nhiệt độ cao nhiệt độ nóng chảy phân tử (92 – 96 C) vòng 30 giây đến phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành mạch đơn Chính mạch đơn đóng vai trò mạch khuôn cho tổng hợp mạch bổ sung Bước 2: (bắt cặp, annealing) Trong bước nhiệt độ hạ thấp nhiệt độ nóng chảy (Tm) primer, cho phép primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ dao động khoảng 54 – 65 0C Tùy thuộc vào Tm primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây Mồi xuôi bắt cặp gắn đầu 3’ mạch khuôn 5’3’ Mồi ngược bắt cặp gắn đầu 3’ mạch khuôn 3’5’ Bước 3: (kéo dài, elongation – extension) Nhiệt độ tăng lên 72 0C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt Dưới tác động DNA polymerase, nucleotide gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian giai đoạn tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Sự khuếch đại tính sau: Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n m: Là số chuỗi mã hóa n: Là số chu kỳ Như vậy, qua chu kỳ nhiệt, DNA đích nhân thành hai sao; chu kỳ lặp lặp lại liên tục 30 - 40 lần từ DNA đích nhân thành 230 đến 240 sao, tức đến hàng tỷ Đọc kết PCR: Điện di gel agarose để phân loại DNA theo kích thước Là tượng dịch chuyển vật thể mang điện tích tác động điện trường Điện di gel (gelelectrophoresis) áp dụng sinh học phân tử DNA, RNA, Protein dựa đặc điểm vật lý chúng kích thước, khối lượng, hình dạng hay điện tích chúng Kĩ thuật sử dụng gel đóng vai trò thể để phân tách phân tử, chất nhuộm khác (ethidium bromide, xanh coomassie, bạc…) để phát vị trí phân tử gel sau điện di Một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện tạo điện trường Khi phân tử tích điện đặt điện trường, chúng dịch chuyển hướng đến cực dương (+) cực âm (-) tùy theo điện tích chúng Trong điện trường, DNA tích điện âm di chuyển cực dượng, đoạn DNA có kích thước ngắn di chuyển nhanh so với đoạn kích thước lớn Trong điện di, ethidium bromide đan xen vào cấu trúc sợi đôi DNA làm sợi đôi DNA phát sáng quan sát đèn UV b Các yếu tố ảnh hưởng DNA mẫu (DNA khuôn): khuôn DNA quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu PCR Phản ứng PCR tối ưu với đoạn khn hồn toàn tinh sạch, hiệu PCR tỷ lệ thuận với độ tinh DNA khn Trình tự DNA khn không nên lớn 6475 hoa rum chiết xuất đủ insulin cho toàn người mắc bệnh tiểu đường giới Từ vi sinh vật: phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp dựa chủng vi sinh vật biến đổi gen chủ yếu vi khuẩn (E.coli, Bacillus brevis…) nấm men (Saccharomyces cerevisiae…) 2.5 Chẩn đoán bệnh để can thiệp sớm Kỹ thuật DNA tái tổ hợp sản xuất Test Kit chẩn đoán bệnh Test kit hiểu nôm na kiểm tra, công cụ để kiểm tra vấn đề cụ thể cách lấy lượng nhỏ mẫu chờ xem kết khoảng thời gian ngắn Những kiểm tra/ chẩn đoán bệnh viện hay phòng thí nghiệm gọi test kit Hiện chúng thiết kế nhỏ gọn, dễ sử dụng, độ xác cao Những sản phẩm đưa thị trường nước ta phần nhỏ thơng dụng như: que thử thai, đo pH, test nhóm máu, test nước, hóa chất thực phẩm… Nhưng nước phát triển có loại test kit phát số bệnh tiểu đường, viêm gan B/C, test vi khuẩn, test DNA, thuốc… chí test HIV Que thử thai dụng cụ xét nghiệm định tính nhằm phát nồng độ hormone HCG (Human Chorionic Gonadotropin), chất thai tiết xuất nước tiểu phụ nữ mang thai Sau quan hệ 7-10 ngày thấy dấu hiệu có thai sớm dùng que thử thai Test kit nhóm máu: Khi nói nhóm máu, ngụ ý đến protein – kháng nguyên – tồn bề mặt tế bào hồng cầu Mặc dù có hàng trăm loại kháng nguyên khác đó, thứ quan trọng với sức khỏe nhóm A, B, AB O Đọc kết sau: Nhóm máu O, máu khơng vón cục Nhóm máu A, máu vón cục xuất vùng anti-A Nhóm máu AB, máu vón cục xuất vùng anti-A, anti-B Nhóm máu B, máu vón cục xuất vùng anti-B Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có nhiều dạng mà đặc điểm chung dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, kháng thể gắn với enzyme Khi cho thêm chất thích hợp (thường nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme thủy phân chất thành chất có màu Sự xuất màu chứng tỏ xảy phản ứng đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên thông qua cường độ màu mà biết nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát Phương pháp thiết kế cho việc phát định lượng vật chất peptides, protein, antibodies, hormone,… Đơi gọi tên gọi khác EIA (Enzyme ImmunoAssay) Kĩ thuật nhạy đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên kháng thể nồng độ thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIARadio Immuno Assay) kĩ thuật rẻ tiền an toàn mà đảm bảo độ xác ELISA dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh Bệnh suy giảm miễn dịch (AIDS) virus gây ra, chủ yếu HIV1 HIV2 Dự tính có 30 triệu người bị nhiễm HIV gần triệu người mắc AIDS Trên 90% số người bị nhiễm bệnh nước phát triển tại, việc chuẩn đoán HIV/AIDS gặp khó khăn thiếu phương tiện chẩn đốn bệnh Hiện nhiều công ty tổ chức quốc tế có bán kit chẩn đốn đặc thù nhạy kỹ thuật DNA tái tổ hợp để phân tích HIV1 HIV2 Chẩn đoán HIV máu dựa kỹ thuật ELISA tiến hành sau: vi lỗ máy ELISA có chứa peptid tổng hợp virus peptid tái tổ hợp virus có khả kích thích phản ứng tạo kháng thể người bệnh Khi nhỏ huyết tương vào vi lỗ, kháng thể có huyết tương bệnh nhân phản ứng với peptid vi lỗ Các kháng thể bị gắn với peptid phản ứng với anti-human immunoglobulins bắt cặp với chất thị HRP Mức độ bắt cặp với HRP thể mức độ nhiễm HIV Sử dụng peptid loại HIV khác làm tăng tính đặc thù chẩn đốn Bộ kit gồm peptid tạo kỹ thuật DNA tái tổ hợp có độ nhạy tính đặc thù cao Bệnh Hepatitis C virus thường liên quan tới xơ gan thường dẫn đến ung thư gan Khoảng ½ số người nhiễm virus bị viêm gan Chẩn đoán HCV dựa vào kỹ thuật ELISA: peptid virus HCV tổng hợp nhờ kỹ thuật DNA tái tổ hợp Phủ vi lỗ peptid virus Các peptid gây việc tổng hợp kháng thể antibody người Kháng thể antibody huyết tương phản ứng với peptid vi lỗ kháng nguyên liên kết lại phản ứng tiếp với anti-human imnunoglobulin bắt cặp với thị HRP HRP liên kết cho biết mức độ nhiễm HCV, phương pháp có độ nhạy tính đặc thù cao Chẩn đốn sớm dị hình, quái thai trước sinh Tiến hành kỹ thuật chọc ối, kết hợp đồng thời phân tích máu bố mẹ enzyme hạn chế, người ta chẩn đốn sớm trước sinh (vì sử dụng enzyme hạn chế có khả phân biệt gen đột biến với gen bình thường) Các đoạn DNA cắt ra, phân tách qua phương pháp điện di, đem lai với mẫu dò DNA RNA đánh dấu phóng xạ 32P Ảnh phóng xạ tự ghi cho ta thấy đoạn DNA lai với mẫu dò Các đoạn tách để nghiên cứu xác định đột biến hay bình thường enzyme hạn chế, số đột biến di truyền có ảnh hưởng đến vị trí dành cho enzyme hạn chế Ở người bệnh Đao, cặp nhiễm sắc thể 21 có đến (khơng phải bình thường), bị dị hình, si đần bẩm sinh, lùn, cổ rụt, má phệ, khơng có khả sinh dục Vợ chồng có bị bệnh Đao lại tiếp tục có thai nhờ kỹ thuật chọc ối, chẩn đốn sớm trước sinh kiểu hình di truyền tế bào, để biết có nên sinh hay phải dùng liệu pháp sẩy thai 2.6 Kháng sinh Năm 1928, Alexander Fleming nhà khoa học đến từ Scottland, loay hoay thí nghiệm với virus cúm Khi lục lọi mớ đĩa thí nghiệm đầy loại vi khuẩn khác ông phát điều kỳ lạ Một loại nấm mốc bám vào đĩa thí nghiệm dường tiêu diệt đám vi khuẩn mà chạm tới Hoặc theo cách giải nghĩa đại, lồi nấm mốc chứa đặc tính kháng sinh Sau hàng năm trời truy tìm phương thuốc "kỳ diệu", Fleming tự nhiên tìm thấy hồn cảnh tình cờ Chỉ vài tuần sau, giáo sư phân loại nấm mốc phát thuộc chủng Penicillium Ơng đặt tên cho thành phần có khả diệt khuẩn "Penicillin" Và từ thuốc kháng sinh giới đời Kháng sinh chất chiết xuất từ vi sinh vật tổng hợp hóa học, với liều nhỏ có tác dụng ức chế giết chết vi sinh vật, dùng chỗ tồn thân, độc không độc cho thể Hiện biết > 10.000 kháng sinh 200 loại sản xuất sử dụng thương mại Việc tìm kiếm kháng sinh tiếp diễn, tượng vi sinh vật kháng lại tác dụng kháng sinh ngày nhiều Cơ chế tác dụng kháng sinh - Ngăn cản tổng hợp thành tế bào vi khuẩn - Làm biến đổi màng nguyên sinh chất vi khuẩn - Cản trở tổng hợp protein acid nucleic tế bào Phân loại kháng sinh Các chủng vi sinh vật sử dụng sản xuất kháng sinh Penicillin crysogenum Penicillin notatum sản xuất penicillin Kháng kháng sinh Kiểm Tra