bài giảng thí nghiệm sinh học phân tử

CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG MỤC TIÊU: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau: - Khái niệm

Trang 1

MỤC LỤC

BÀI 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG 2

BÀI 2 NHÂN BẢN SAO DNA/GEN MỤC TIÊU BẰNG PHẢN ỨNG PCR 7

BÀI 3 TÁCH CHIẾT PLASMID TỪ TẾ BÀO CHỦ 10

BÀI 4 PHÂN TÍCH PLASMID BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG, CẮT GIỚI HẠN VÀ ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE 13

BÀI 5 THU NHẬN DNA/PLASMID TINH SẠCH TỪ BỘ KIT TINH CHẾ DNA 18

BÀI 6 NỐI DNA VÀO PLASMID 20

BÀI 7 BIẾN NẠP PLASMID TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ E coli 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

Trang 2

BÀI MỞ ĐẦU NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM & GIỚI THIỆU MÔN HỌC

I Những quy định chung

1 Những người không có nhiệm vụ không được vào phòng thí nghiệm

2 Vật dụng cá nhân để đúng nơi quy định

3 Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo Blouse, đeo khẩu trang, mang găng tay,

cột tóc gọn gàng

4 Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm

5 Không sử dụng trang thiết bị trong phòng thí nghệm khi chưa được hướng dẫn cụ thể

6 Không được mang hoá chất, dụng cụ khi chưa được sự đồng ý của trưởng phòng thí nghiệm

7 Khi rời phòng thí nghiệm phải kiểm tra điện, nước, khóa cửa

II Quy định an toàn

An toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng trong phòng thí nghiệm Đặc biệt đối với phòng thí nghiệm sinh học phân tử và thao tác trên gen, sinh viên cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy tắc

an toàn do thường xuyên phải tiếp xúc với hóa chất độc hại để đảm bảo an toàn cho bản thân và những người xung quanh Sau đây là một số quy tắc:

- Đọc kỹ tài liệu thực tập và nắm vững nguyên tắc, vật liệu, phương pháp thực hành trước khi vào phòng thí nghiệm

- Chỉ mang những dụng cụ tối thiểu cần cho thực tập (tài liệu, tập ghi, bút) vào chỗ làm Tất

cả vật dụng khác cần để ở vị trí riêng biệt

- Trước khi bắt đầu thực tập, cần lau sạch mặt bàn với cồn 70%

- Đối với các hóa chất sử dụng trong thực tập, cần xem rõ tên hóa chất trước khi dùng Trường hợp không rõ, sinh viên cần hỏi cán bộ hướng dẫn Không tự ý làm thử để tìm hiểu

- Phenol, chloroform là các hóa chất nguy hiểm, có khả năng gây bỏng Vì vậy, khi thao tác với các hóa chất này, sinh viên tuyệt đối cẩn thận, không để tiếp xúc trực tiếp với da, đặc biệt là

Trang 3

- Ethidium bromide là một chất độc, có khả năng gây ung thư Khi thao tác với hóa chất này, sinh viên phải mang bao tay và thao tác cực kỳ cẩn thận Không để vương vãi dung dịch ethidium bromide xung quanh vị trí làm việc Đầu típ hút ethidium bromide, bản gel sau khi điện di và dung dịch hút bỏ trong quá trình thí nghiệm phải bỏ đúng nơi quy định, không vứt bỏ lung tung

- Trường hợp lỡ tay làm đổ hóa chất lên bàn thực tập phải lau ngay tránh để người khác sơ ý đụng phải

- Lắng nghe và thực hiện nghiêm túc các hướng dẫn của cán bộ phụ trách thực tập trong việc dùng hóa chất cũng như trang thiết bị thí nghiệm Trường hợp xảy ra tai nạn, sự cố, cần báo ngay với cán bô phụ trách thực tập để có biện pháp xử lý thích hợp

- Trước khi rời phòng thí nghiệm phải rửa sạch tay

III Giới thiệu môn học

Môn học thực tập sinh học phân tử giúp sinh viên làm quen với các kỹ thuật cơ bản của công nghệ gen thông qua đó nắm vững, hiểu rõ hơn các khái niệm, kiến thức của công nghệ gen và có thể bước đầu tiến hành các thí nghiệm về thao tác trên gen

3.1 Nội dung

Bài 1 Các khái niệm cơ bản về tạo dòng

Bài 2 Nhân bản sao DNA/gen mục tiêu bằng phản ứng PCR

Bài 3 Tách chiết plasmid từ tế bào chủ

Bài 4 Phân tích plasmid bằng các phương pháp đo mật độ quang, cắt giới hạn và điện di trên gel agarose

Bài 5 Thu nhận DNA/plasmid tinh sạch từ bộ kit tinh chế DNA

Bài 6 Nối DNA vào plasmid

Bài 7 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ E coli

3.2 Phương pháp dạy và học

- Bài học được tiến hành dưới hình thức bài giảng và thao tác thực hành

Trang 4

3.3 Phương pháp đánh giá

Nội dung các bài thực tập có liên quan với nhau, các kết quả thu được của bài thực tập trước được dùng làm nguyên liệu để thực hiện các bài tiếp theo Vì thế cần lưu ý bảo quản kết quả của bài thực tập trước để sử dụng cho bài sau

1 Chuyên cần (Đ1) 0.1

2 Kỹ năng thực hành (Đ2) 0.3

3 Viết báo cáo (Đ3) 0.3

4 Kiểm tra kết thúc môn (Đ4) 0.3

Trang 5

BÀI 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG MỤC TIÊU:

Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:

Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:

- Khái niệm về tạo dòng

- Ứng dụng của việc tạo dòng trong Sinh học phân tử

- Các bước cơ bản của tạo dòng

- Khái niệm về tái tạo dòng (subcloning)

- Khái niệm chung về vector và chủng chủ

- Một số enzyme dùng trong tạo dòng

Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau:

- Sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ chuyên dụng trong sinh học phân tử

- Cẩn thận, khéo léo và khả năng tập trung cao độ trong các thao tác sinh học phân tử đồng thời có khả năng tư duy cao

- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu

Số tiết lên lớp: 10 tiết

Bảng phân chia thời lượng

2 Nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ cho thí

nghiệm sinh học phân tử 2

3 Thiết lập quy trình tạo dòng DNA/gen mục tiêu

vào tế bào chủ E coli 5

Trang 6

Trọng tâm bài giảng

- Mục đích của việc dòng hóa gen mục tiêu vào tế bào chủ E coli

- Vector và đặc điểm của vector

- Nội dung của quy trình tạo dòng DNA/gen mục tiêu vào tế bào chủ E coli

- Cách sử dụng các máy, dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong sinh học phân tử

Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1], [2]

1.1 Tạo dòng và tái tạo dòng

1.2 Vector và chủng chủ

1.3 Các enzyme dùng trong tạo dòng

1.4 Cách thức sử dụng eppendorf, pipetman, máy điện di DNA, Đèn UV, máy ly tâm,

bộ kit tinh sạch dành cho DNA, dung dịch, thuốc thử chuyên dụng trong sinh học phân

2 Mục đích của việc tạo dòng?

3 Các bước cơ bản của quy trình tạo dòng

4 Vector là gì?

5 Ứng dụng của vector trong việc tạo dòng gen mục tiêu

6 Chủng chủ là gì?

7 Đặc điểm của chủng chủ

8 Vi khuẩn E coli và ứng dụng của nó trong công nghệ gen

9 Enzyme cắt giới hạn (RE) là gi?

10 Ứng dụng của RE trong dòng hóa gen quan tâm vào vector

11 Polymerase, Ligase, Nuclease và ứng dụng của nó trong sinh học phân tử

Trang 7

BÀI 2 NHÂN BẢN SAO DNA/GEN MỤC TIÊU BẰNG

PHẢN ỨNG PCR

MỤC TIÊU:

- Mục đích của việc PCR trong sinh học phân tử

- Nguyên tắc của phương pháp PCR

- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu

2 Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ 0.5

3 Các bước tiến hành 2.5

Trọng tâm bài thực hành

- Thực hiện các bước trong quy trình nhân bản DNA/gen mục tiêu bằng phản ứng PCR

- Giải thích được cơ chế trong phản ứng PCR

- Thành phần của phản ứng PCR

I Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1]

1.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR

Trang 8

1.2 Các thành phần phản ứng PCR

1.3 Ứng dụng của PCR

II Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ

- DNA bộ gen

- 1 eppendorf 0.5 ml vô trùng và giá để eppendorf

- 1 eppendorf chứa mồi xuôi

- 1 eppendorf chứa mồi ngược

- 1 eppendorf chứa dung dịch đệm cho phản ứng PCR

- 1 eppendorf chứa dung dịch dNTP

- 1 eppendorf chứa enzyme Taq DNA polymerase (luôn được giữ trong chậu nước đá trong khi thao tác)

- 1 eppendorf nước cất hai lần vô trùng

- Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip

Trang 9

Đặt eppendorf có chứa hỗn hợp phản ứng PCR vào máy PCR với chương trình PCR như sau:

Trang 10

BÀI 3 TÁCH CHIẾT PLASMID TỪ TẾ BÀO CHỦ

MỤC TIÊU:

- Khái niệm cơ bản về plasmid

- Quy trình tách chiết plasmid

- Ứng dụng của plasmid trong việc sử dụng làm vector

- Thu nhận plasmid tinh sạch làm nguyên liệu cho quy trình tạo dòng

- Nguyên tắc tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS-kiềm

- Giải thích được các thành phần dùng để tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS-kiềm

I Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1] [3]

1.1 Plasmid và đặc điểm sinh học của nó

1.2 Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ

1.3 Nguyên tắc tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS-kiềm

Trang 11

- 6 eppendorf 1.5ml

- Các dung dịch I, II, III

- RNase, phenol, chloroform, ethanol tuyệt đối, ethanol 70%, TE

- Pipetman các loại: 0.5-10ul; 20-100ul; 200-1000ul, đầu tip

- Bình đựng nước thải

- Máy vortex

- Máy li tâm ở nhiệt độ thường và ly tâm lạnh

III Thực hành

Sinh viên tiến hành tách chiết plasmid theo các bước như sau:

- Nuôi cấy dòng E coli mang plasmid pGEM trong 5ml môi trường LB có bổ sung 5ul

Amp 50mg/ml, lắc qua đêm ở 37oC

- Hút dịch vi khuẩn vào 3 eppendorf 1.5ml, mỗi eppendorf 1.5ml Thu sinh khối bằng ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Hút bỏ dịch bên trên

- Bổ sung 100µl dung dịch 1 vào eppendorf chứa sinh khối; vortex thật kỹ

- Bổ sung 200µl dung dịch 2; đảo nhẹ Bổ sung ngay 150µl dung dịch 3; đảo nhẹ

- Ly tâm thu dịch nổi ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng Thu dịch nổi từ 3 eppendorf trên vào eppendorf mới, bỏ cặn

- Bổ sung 1.5µl RNase vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi trên ủ ở 37oC trong 1 giờ

- Sau đó, bổ sung vào mỗi eppendorf 250µl phenol pH 8 và 250µl chloroform; vortex nhẹ;

ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng; thu dịch nổi

- Thêm vào eppendorf trên 500ul ethanol tuyệt đối; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút,

4oC Hút bỏ dịch nổi, thu tủa

- Rửa tủa trên với 500ul ethanol 70% lạnh; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC Thu tủa; phơi khô tự nhiên

- Bổ sung 25µl TE; bảo quản mẫu ở 4oC

Chú ý: Phenol, chloroform là những chất oxy hóa mạnh, có khả năng gây bỏng Tránh tiếp

xúc trực tiếp với da, đặc biệt là mắt trong trường hợp nhỏ lên tay, cần rửa ngay bằng nước trường hợp bị nặng hơn, cần báo ngay với cán bộ hướng dẫn thực hành để kịp thời xử lý

Trang 12

2 Mục đích của việc tách chiết plasmid?

3 Giải thích các bước của quá trình tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS- kiềm

Trang 13

BÀI 4 PHÂN TÍCH PLASMID BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG, CẮT GIỚI HẠN VÀ ĐIỆN DI GEL AGAROSE

MỤC TIÊU:

- Mục đích của việc xác định nồng độ và độ tinh sạch của một mẫu DNA

- Giá trị của một mẫu DNA được xem là sạch là như thế nào

- Nguyên tắc hoạt động của máy đo mật độ quang

- Mục đích của việc sử dụng enzyme cắt giới hạn trong bài thực hành

- Phương pháp điện di trên gel agarose là như thế nào?

- Mục đích của phương pháp điện di gel agrose

- Biết cách sử dụng máy đo mật độ quang

- Biết cách phân tích bản đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid cho trước đồng thời biết cách sử dụng enzyme cắt giới hạn thích hợp cho phản ứng cắt kiểm tra plasmid

- Biết cách thu nhận thông tin kiểm chứng về trình tự plasmid mục tiêu

- Biết cách đọc, ghi nhận và giải thích kết quả trên bảng điện di gel agarose

3 Các bước tiến hành 3

4 Nhận xét kết quả thí nghiệm 1,5

Trang 14

- Nắm vững phân tích mẫu plasmid bằng các phương pháp đo mật độ quang, cắt giới hạn và điện di trên gel agarose

I Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1]

1.1 Phân tích plasmid bằng phương pháp đo mật độ quang

1.2 Phân tích plasmid bằng phương pháp cắt giới hạn

1.3 Phân tích sản phẩm cắt giới hạn bằng điện di gel agarose

- Bình chứa nước thải, giấy thấm

- Máy đo mật độ quang

b Thực hành

- Tiến hành pha loãng mẫu 10 lần bằng cách hút 1.5ul dung dịch DNA plasmid thu được vào 1 eppendorf sạch Bổ sung 13.5ul nước cất vô trùng Lắc trộn đều

- Mở máy đo mật độ quang, chọn chương trình đo thích hợp theo hướng dẫn của cán bộ

- Rửa sạch buồng đo, điều chỉnh blank

- Nạp 10ul mẫu vào buồng đo Nhấn nút DNA để đo nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch DNA

- Ghi nhận kết quả và rút ra kết luận

Trang 15

- Dung dịch DNA plasmid thu được ở bài 2

- 1 eppedorf 1.5ml

- Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip

- Nước cất vô trùng

- Enzyme cắt giới hạn, dung dịch đệm (buffer)

- Bình chứa nước thải, giấy thấm

- Tủ ấm 37oC

b Thực hành

Dựa vào bản đồ plasmid cho trước (Hình 2), sinh viên thực tập chọn enzyme cắt giới hạn sử dụng cho phản ứng cắt kiểm chứng plasmid Dự đoán kết quả thu được khi sử dụng enzyme đã chọn cho phản ứng kiểm chứng

Hình 2 Vùng trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn (MCS) và bản đồ giới hạn của

plasmid pGEM- T Easy [4]

Sinh viên tiến hành thực hiện phản ứng cắt giới hạn theo các bước sau:

 Chuẩn bị một eppendorf sạch và thiết lập phản ứng cắt với thành phần sau đây:

DNA plasmid 1ug

Trang 16

Dung dịch đệm (10X) 1ul

Enzyme cắt giới hạn 0.5ul

Nước cất bổ sung sao cho tổng thể tích phản ứng là 10ul

 Ủ hỗn hợp phản ứng này ở 37oC trong 2 giờ hoặc qua đêm

II.3 Phân tích sản phẩm cắt giới hạn của plasmid bằng điện di gel agarose

a Vật liệu, dụng cụ, thiết bị

- Sản phẩm PCR của bài 1; Dung dịch plasmid đã tách chiết của bài 2; Sản phẩm cắt giới hạn của bài 3 của mỗi nhóm thực tập

- Agarose nóng chảy ở nhiệt độ thấp

- Dung dịch điện di TAE 1X (pha từ dung dịch TAE 50X)

- Chuẩn bị gel agarose

Sinh viên tiến hành đổ gel agarose theo các bước sau:

+ Chuẩn bị khuôn đổ gel, gắn lược vào khuôn

+ Cân 0.5g agarose vào bình erlen 100ml, bổ sung 25ml dung dịch TAE 1X

+ Đun chảy dung dịch agarose trong lò vi ba; để nguội đến 35-40oC, lắc đều; đổ dung dịch agarose vào khuôn lược

+ Để nguội cho gel kết đông tự nhiên; sau khi gel đông gỡ 2 gờ của khuôn và tháo lược ra khỏi khuôn

Trang 17

+ Chuẩn bị 1 miếng parafilm; hút 5ul dung dịch DNA (10ul đối với mẫu sản phẩm cắt giới hạn) cần phân tích đặt lên bề mặt miếng parafilm; thay đầu tip, hút 3ul dung dịch nạp mẫu, trộn đều với dung dịch DNA

+ Dùng pipetman hút toàn bộ dung dịch mẫu vừa trộn và nạp vào giếng trên gel agarose + Đóng nắp buồng điện di, cắm điện cực

+ Điện di với điện thế 100V, 20 phút

+ Xem kết quả điện di bằng hộp soi đèn UV

BÁO CÁO

Viết báo cáo kết quả thí nghiệm và giải thích mục đích của việc phân tích plasmid bằng các phương pháp đo mật độ quang, cắt giới hạn và điện di gel agarose

Câu hỏi:

1 Tại sao cần xác định nồng độ và độ tinh sạch của một mẫu DNA?

2 Phân tích mẫu DNA plasmid sau khi tách chiết bằng phương pháp nào?

3 Nguyên tắc hoạt động của máy đo mật độ quang

4 Mục đích của việc sử dụng enzyme cắt giới hạn trong bài thực hành

5 Gel agarose là gì? Đọc kết quả điện di trên bảng điện di gel agarose là như thế nào?

Trang 18

Bài 5 Thu nhận DNA/plasmid tinh sạch từ bộ kit tinh chế DNA

MỤC TIÊU:

- Hiểu biết quy trình tinh sạch sản phẩm DNA/plasmid sau khi đã đƣợc thao tác (cắt bằng enzyme cắt giới hạn) và kiểm tra trên gel agarose bằng bộ kit tinh sạch cho DNA

- Biết cách tinh chế sản phẩm bằng bộ kit dành cho DNA

- Biết sản phẩm sau tinh chế có đáp ứng yêu cầu cho việc dòng hóa tiếp theo hay không

Bảng phân chia thời lƣợng

I Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1], [5]

1.1 Mục đích của việc tinh sạch sản phẩm DNA/plasmid sau khi đã thao tác

1.2 Nguyên tắc của quy trình tinh sạch DNA/plasmid bằng bộ kit dành cho DNA

Định dạng
Số trang	25
Dung lượng	577,38 KB