Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch 62 BÀI 1 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ α-AMYLAZA THEO PHƯƠNG PHÁP HEINXEL 1.1. Chiết tách dịch enzym từ chế phẩm nấm mốc và từ malt. Cân 20-100 g môi trường nuôi cấy bề mặt (chế phẩm nấm mốc) hoặc malt, nghiền nhỏ cẩn thận, cho vào bình tam giác, thêm 500-1000 ml dung dịch NaCl 1%, đặt trên máy lắc liên tục trong 1-2 h. Lọc hoặc ly tâm ở 6000 vòng/phút để được dung dịch enzym trong suốt. 1.2. Nguyên tắc : Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dich iốt. Đơn vị hoạt độ ezim là lượng enzym có khả năng phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút ở 30 0 C. 1.3. Cách tiến hành và tính kết quả : Cho vào ống nghiệm 1mg dung dịch tinh bột 1%, 1 mg dung dịch NaCl 0,1% và 2 ml dung dịch đệm phosphat 0,05M pH 6.0, lắc đều, giữ ở 30 0 C trong 15-20 phút để dung dịch đạt đến 30 0 C. Thêm vào hỗn hợp 1 ml dung dịch enzym đã đạt đến 30 0 C. Lắc đều, tiếp tục giữ ở 30 0 C đúng 30 phút lấy ống nghiệm ra khỏi tủ ấm, cho ngay vào 5 ml dung dịch axít sunfosalisilic 20 % để làm ngừng phản ứng sau vài phút lọc. Song song với mẫu thí nghiệm làm mẫu kiểm tra cũng tương tự như trên nhưng cho dung dịch axít sunfosalisilic vào trước rồi mới cho dung dịch enzym. Lấy 1ml dịch lọc của mẫu thí nghiệm cũng như mẫu kiểm tra cho vào ống nghiệm, thêm 9 ml dung dịch iốt pha loãng 150 lần. So màu ở bước sóng 560 nm. Lấy hiệu s ố số đọc trên máy giữa mẫu kiểm tra và thí nghiệm, đối chiếu với đường cong tiêu chuẩn, tính số mg tinh bột đã bị phân giải. Hoá chất sử dụng : - Dung dịch NaCl 0,1% - Dung dịch axít sunfosalisilic 20% - Dung dịch iốt : hoà tan 1g iốt vào 5ml dung dịch có chứa 2 g KI, thêm nước cất vào đến 300ml. Khi dùng pha loãng dung dịch này 150 lần. - Dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 6.0 Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch 63 - Dung dich tinh bột 1% trong dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 6.0. Cân 1g tinh bột trộn với khoảng 10ml dung dịch đệm, thêm vào 80ml dung dịch đệm đang sôi, để nguội, thêm dung dich đệm vào cho đến 100ml. Để bảo quản dung dịch tinh bột có thể thêm 1g benzoat natri. - Dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1% : Cân 1 g tinh bột trộn với 10 ml nước cất, thêm 80 ml nước cất đang sôi, khuấy đều và nếu cần tiếp tục đun để nhận được dung dịch trong suốt, để nguội cho vào bình đị nh mức 100 ml và thêm nước cất đến vạch mức. Từ dung dịch này chuẩn bị các dung dịch có chứa 2, 4, 6, 8 và 10 mg tinh bột trong 1 ml bằng cách lấy 2, 4, 6, 8 ml dung dịch tinh bột 1% và thêm nước cất vào cho đến 10 ml. Lập đồ thị tiêu chuẩn : Lấy 0,1 ml dung dịch tinh bột đã chuẩn bị như trên, thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 0,1 %; 0,2 ml dung dịch đệm; 0,1 ml nước cất; 0,5 ml dung dịch axít sunfosalisilic 20%, lắc đều, thêm 9 ml dung dịch iốt đã pha loãng 150 lần, so màu ở bước sóng 560 nm. Vẽ đồ thị tiêu chuẩn, trên trục hoành ghi số mg tinh bột, trục tung ghi số đọc được trên máy tương ứng. Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch 64 BÀI 2 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ AMYLAZA DỰA VÀO LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ TẠO THÀNH. 2.1. Chiết tách dịch enzym. Tiến hành giống như ở phần 1.1 của bài 1 ở trên. 2.2. Xác định hoạt độ amylaza theo phương pháp Nelson. - Nguyên tắc : Sau khi cho enzym thuỷ phân tinh bột ở những điều kiện xác định, đun hỗn hợp phản ứng với dung dịch đồng (II), tạo thành kết tủa Cu 2 O. Hoà tan kết tủa trong thuốc thử arseno-molypden sẽ nhận được màu xanh da trời. So màu ở bước sóng 660nm, đối chiếu với đồ thị tiêu chuẩn để tính lượng đường. - Đơn vị hoạt độ enzym là lượng enzym mà trong 30 phút ở 30 0 C có thể phân giải tinh bột tạo thành lượng đường khử tương ứng với 1 micromol glucoza. 2.3. Cách tiến hành và tính kết quả : - Chuẩn bị 2 ống nghiệm khô, sạch, cho vào mỗi ống 0,5 ml dung dịch enzym có độ pha loãng thích hợp. Cho vào ống thứ 1 (ống kiểm tra) 1 mol thuốc thử 5 và 0,5 ml dung dịch tinh bột 1 %. Ống thứ 2 (ống thí nghiệm) đặt vào tủ ấm 30 0 C trong 10-15 phút. Thêm 0,5 ml dung dịch tinh bột 1 % (đã đạt 30 0 C) lắc đều, giữ đúng 30 phút ở 30 0 C. Sau đó cho 1 ml thuốc thử 5 lắc đều. Đặt cả 2 ống nghiệm vào nồi cách thuỷ đang sôi trong 20 phút rồi lấy ra làm nguội dưới vòi nước chảy. Thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử arseno- molypden, lắc liên tục cho đến khi ngừng tạo thành bọt khí CO 2 và hoà tan hoàn toàn kết tủa Cu 2 O. Thêm nước cất đến 10 ml. Lắc đều, so màu ở bước sóng 660 nm đối với mẫu trắng. Mẫu trắng : Cho 1 ml nước cất, 1 ml thuốc thử 5, đun sôi 20 phút trong nồi cách thuỷ đang sôi, làm lạnh, thêm 1ml thuốc thử arseno-molypden và tiếp tục làm như trên. - Tính kết quả : Lấy hiệu số đọc trên máy giữa mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra (E TN - E KT ). Đối chiếu với đồ thị tiêu chuẩn để tính ra số micromol glucoza tương ứng, nhân với độ pha loãng dung dịch enzym, tính số đơn vị hoạt độ trên 1 g môi trường nuôi cấy bề mặt (chế phẩm nấm mốc) hoặc malt. Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch 65 - Hoá chất : 1- Dung dịch enzym : chuẩn bị giống như phần 1.1 của bài 1. 2- Dung dịch tinh bột 1 % trong dung dịch đệm phosphat 0,05M pH = 6.0. 3- Thuốc thử đồng (I) : Hoà tan 200 g Na 2 SO 4 khan hoặc 356 g Na 2 SO 4 .10H 2 O vào 600 ml nước cất đang sôi. Chuẩn bị 100 ml dung dịch có chứa 25g muối Seignet. Cho cả hai dung dịch trên vào bình định mức 1 lít. Thêm vào 20 g NaHCO 3 và 25 g Na 2 CO 3 khan (hoặc 50 g tinh thể). Sau khi hoà tan thêm nước cất vào đến vạch. Nếu dung dịch đục cần phải lọc. Giữ dung dịch ở 30-37 0 C. Nếu sau đó dung dịch có tinh thể cần phải đun cách thuỷ nhẹ trước khi dùng. 4- Thuốc thử đồng (II) : Hoà tan 15 g CuSO 4 .5H 2 O trong ít nước cất, thêm 1-2 giọt H 2 SO 4 đặc, thêm nước cất đến 100 ml. 5- Thuốc thử hỗn hợp : Trộn lẫn thuốc thử đồng (I) và (II) theo tỷ lệ 25:1 ngay trước khi dùng. 6- Thuốc thử arseno-molypden : Hoà tan 25 g molypdat amonium trong 400 ml nước cất, thêm 31 ml H 2 SO 4 đặc. Chuẩn bị 25 ml dung dịch có chứa 3 g Na 2 HAsO 4 .7H 2 O. Trộn lẫn 2 dung dịch trên giữ ở 30-37 0 C trong 24-48 h hoặc ở 55 0 C trong 24 phút trong lọ có màu nâu để dung dịch có màu vàng bền. 7- Dung dịch glucoza tiêu chuẩn : Trong 1 ml chứa 1 µM glucoza, từ dung dịch này chuẩn bị các dung dịch có chứa 0,20; 0,25; 0,30; 0,40; 0,50; 0,60 µM trong 1ml. Lấy 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm thêm 1ml thuốc thử 5, đun sôi 20 phút trong nồi cách thuỷ, làm lạnh, thêm 1ml thuốc thử arseno-molypden, lắc đều, so màu. Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch 66 BÀI 3 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYM POLYPHENOLOXYDAZA 3.1. Nguyên tắc : Khi cho một lượng axít ascorbic tác dụng với pyrocatechin với sự có mặt của enzym polyphenoloxydaza thì phản ứng sẽ xảy ra trước hết tạo thành orthoquinon. Sau đó orthoquinon là chất oxy hoá mạnh tác dụng với axít ascorbic. Căn cứ vào lượng axít ascorbic tiêu tốn trong phản ứng sẽ suy ra hoạt tính của enzym. Phương trình phản ứng như sau : Pyrocatechin Polyphenoloxydaza Orthoquinon + H 2 O Orthoquinon + axít ascorbic → Pyrocatechin + axit dehidroascorbic 3.2. Chiết tách enzym Polyphenoloxydaza. Cân 2-5 g thực vật tươi (lá chè, hạt cacao tươi, ), cắt thành mảnh nhỏ bỏ vào cối sứ nghiền nhanh với axeton khan và 0,5 g Al 2 O 3 . Gạn dung dịch chiết qua phễu thuỷ tinh xốp số 2, còn cặn tiếp tục nghiền, lọc khoảng 5-6 lần cho đến khi chlorophyll hoàn toàn được tách hết. Lúc đó ta nhận được loại bột màu vàng nhạt, đó là chế phẩm enzym-axeton. 3.3. Cách tiến hành và tính toán kết quả. - Cách tiến hành : Cân chính xác 50 mg chế phẩm enzym-axeton vào bình nón 100 ml, cho thêm 10 ml dung dịch đệm phosphat pH =7, thêm 2 ml dung dịch axít ascorbic 0,2% vừa mới pha và 1 ml dung dịch pyrocatechin 0,5 %. Lắc mạnh trong đúng 2 phút ở nhiệt độ 20 0 C. Khử hoạt tính enzym bằng cách thêm 2 ml dung dịch H 2 SO 4 10 %. Tiếp tục thêm vào phản ứng một vài tinh thể KI và 5 giọt hồ tinh bột 1 %. Tiếp tục chuẩn độ lượng axit ascorbic còn lại bằng dung dịch KIO 3 0,001N đến khi xuất hiện màu xanh bền. Song song với thí nghiệm thực, tiến hành thí nghiệm trắng bằng cách thêm các hoá chất theo thứ tự : 50 mg chế phẩm enzym-axeton vào bình nón 100 ml, thêm 10 ml dung dịch đệm phosphat pH=7, thêm 2 ml dung dịch H 2 SO 4 10 %, Lắc mạnh đúng 2 phút ở 20 0 C. Tiếp tục thêm 2 ml axit ascorbic 0,2 % vừa mới pha và 1 ml dung dịch pyrocatechin 0,5 %. Thêm vài tinh thể Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch 67 KI và 5 giọt hồ tinh bột 1 % rồi chuẩn độ lượng axit ascorbic bằng dung dịch KIO 3 0,01N đến khi xuất hiện màu xanh bền. - Tính kết quả : Hoạt độ enzym polyphenoloxydaza được thể hiện bằng hiệu số giữa số ml dung dịch KIO 3 0,01N ở mẫu trắng và mẫu thí nghiệm trong 1g chế phẩm enzym-axeton, được tính theo công thức sau : χ = C.t 1000).ba( − Trong đó : χ là hoạt độ enzym polyphenoloxydaza trong 1gam chế phẩm trong 1 phút a là số ml KIO 3 0,01N chuẩn độ ở mẫu trắng b là số ml KIO 3 0,01N chuẩn độ ở bình thí nghiệm 1000 là hệ số chuyển ra gam C là khối lượng mẫu chế phẩm enzym-axeton t là thời gian thí nghiệm - phút. - Dụng cụ và hoá chất : Cân điện tử, cối chày sứ, phễu xốp số 2, máy hút chân không, buret 10 ml, pipet 1 ml, pipet 2 ml, bình nón 100 ml, tủ lạnh. Al 2 O 3 , axeton khan, axit ascorbic 0,2 %, pyrocatechin 0,5 %, axit sunphuric 10 %, KI tinh thể, dung dịch KIO 3 0,01N. . dịch enzym, tính số đơn vị hoạt độ trên 1 g môi trường nuôi cấy bề mặt (chế phẩm nấm mốc) hoặc malt. Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch 65 - Hoá chất : 1- Dung. Khi dùng pha loãng dung dịch này 150 lần. - Dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 6.0 Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch 63 - Dung dich tinh bột 1% trong dung dịch đệm. Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch 62 BÀI 1 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ α-AMYLAZA THEO PHƯƠNG PHÁP HEINXEL 1.1. Chiết tách dịch enzym từ chế phẩm nấm