3. Một số câu hỏi phụ và lưu ý cần nhớ: Có 3 loại micopipet : 0.5 10(µl), 20 100 (µl), 100 – 1000 (µl) Có 2 loại eppendorf : V = 1.5 ml ( đầu nhọn), V = 2ml ( đầu bằng) Sử dụng micopipet: Hút 1 lần 1 V nhất định : nhấn 1 nấc, xả 2 nấc Hút nhiều lần cùng 1 V : nhấn 2 nấc, xả 1 nấc, đến lần cuối cùng sau khi nhả 1 nấc vào eppendorf, phần còn lại sẽ xả bỏ ra ngoài Tại sao quai hướng ra ngoài : vì khi ly tâm ở tốc độ cao, cặn sẽ lắng xuống ở đáy ống phía đối diện với trục ( phía dưới quai). Như vậy ta biết được vị trí của cắn nên khi thao tác sẽ tránh không làm ảnh hưởng đến cắn. Tại sao phải đặt cân bằng và đối xứng: do ly tâm tròn đều và hướng tâm, nếu để ko cân bằng hoặc ko đối xứng, lực tác dụng bị lệch có thể dẫn đến gãy ổ bi, gãy ổ trục của máy
Trang 1ÔN TẬP SINH HOC PHÂN TỬ
I CÁCH SỬ DỤNG PIPET, MÁY LY TÂM, PHA LOÃNG HÓA CHẤT
1 Công thức pha loãng hóa chất:
Vdd mẹ cần lấy = (Nồng độ dd pha/Nồng độ dd mẹ) x V
muốn pha
Ví dụ: Pha 200 (µl) dd TAE 1X từ dd TAE 10X
- Tính V dd TAE10X cần lấy = (1/10) x 200 = 20 (µl) + 180(µl) H 2O
- Dùng micropipet 10 - 200 µl (lưu ý tùy theo thể tích đề bài yêu cầu chọn loại micopipet thích hợp)
- Chỉnh đến V 20 µl để hút dung dịch TAE 10X (nhấn 1 nấc, xả 2 nấc), cho vào eppendorf
- Sau đó, thay đầu tip khác và chỉnh về V 180 µl để hút H2O cho vào eppendorf đã chứa dd TAE10X
- Trộn đều ( bằng cách đảo trộn bằng tay, hoặc bằng micopipet, hoặc bằng máy trộn vontex)
2 Sử dụng máy ly tâm
- Chọn từng cặp eppendorf giống nhau về hình dáng và thể tích
- Kiểm tra dung dịch chứa bên trong có đồng lượng không ( V bằng nhau) theo từng cặp đã chọn ở trên Cặp nào không đồng lượng thì loại ra
- Đặt từng cặp đối xứng vào máy, quai hướng ra ngoài
3 Một số câu hỏi phụ và lưu ý cần nhớ:
Có 3 loại micopipet : 0.5 - 10(µl), 20 -100 (µl), 100 – 1000 (µl)
Có 2 loại eppendorf : V = 1.5 ml ( đầu nhọn), V = 2ml ( đầu bằng)
Sử dụng micopipet:
- Hút 1 lần 1 V nhất định : nhấn 1 nấc, xả 2 nấc
- Hút nhiều lần cùng 1 V : nhấn 2 nấc, xả 1 nấc, đến lần cuối cùng sau khi nhả 1 nấc
vào eppendorf, phần còn lại sẽ xả bỏ ra ngoài
Tại sao quai hướng ra ngoài : vì khi ly tâm ở tốc độ cao, cặn sẽ lắng xuống ở đáy
ống phía đối diện với trục ( phía dưới quai) Như vậy ta biết được vị trí của cắn nên khi thao tác sẽ tránh không làm ảnh hưởng đến cắn
Tại sao phải đặt cân bằng và đối xứng: do ly tâm tròn đều và hướng tâm, nếu để ko
cân bằng hoặc ko đối xứng, lực tác dụng bị lệch có thể dẫn đến gãy ổ bi, gãy ổ trục của máy
Trang 3II CHIẾT TÁCH AND
Má người
- Qui trình chiết tách
Ba bước: phá màng TB,
biến tính protein, tủa
ADN
- Các dd sử dụng:
1 Phá màng: SDS
2 Biến tính protein:
chloroform hoặc phenol
pH8, hoặc cả hai
3 Tủa ADN: ethanol 960
4 Rửa tủa : cồn 700
Plasmid
- Qui trình chiết tách
Ngoài ba bước cơ bản có thêm bước thu sinh khối
- Các dd sử dụng:
1 Phá màng: SDS kiềm
2 Biến tính protein: SDS kiềm
3 Tủa ADN: ethanol 960
4 Rửa tủa : cồn 700
Thực vật
- Qui trình chiết tách
Ngoài ba bước cơ bản thêm bước dùng nitơ lỏng (-1960C) để làm giòn vách cellulose
- Các dd sử dụng:
1 Phá màng: SDS hoặc CTAB
2 Biến tính protein:
chloroform hoặc phenol pH8, hoặc isoamyl alcol (pp mitsui)
3 Tủa ADN: isopropanol
4 Rửa tủa : cồn 700
Một số lưu ý cần nhớ:
1 Tại sao trong chiết tách ADN plasmid sử dụng SDS kiềm mà không phải là SDS :
vì mục đích muốn loại bỏ bộ gen NST của VK, trong môi trường kiềm (pH = 12) ADN NST biến tính ko hồi phục, còn ADN plasmid biến tính có hồi phục do đó ta loại được ADN NST
2 Biến tính ADN NST là như thế nào: là ADN NST bị tách đôi sợi ra
3 Tại sao người ta hay sử dụng pp CTAB trong chiết tách ADN thực vật: trong TB
thực vật có rất nhiều polysarcharid, CTAB có khả năng liên kết thuận nghịch với ADN ( CTAB – ADN) và CTAB – polysarcharid, do đó có thể loại được polysarcharid ngay bước đầu tiên
4 Vai trò các hóa chất:
Dung dịch phá màng trong chiết tách AND má người gồm: tris-HCl 50mM pH8, EDTA 450mM, SDS1%, NaCl 10mM
- Tris : ổn định PH
- EDTA: ức chế hoạt động các enzyne thủy phân ADN
- SDS 1% Tác nhân chính phá vỡ màng TB
- NaCl 10mM gây xáo trộn áp suất thẩm thấu
- Chloroform:biến tính protein
- Ethanol 96% (100%) lạnh làm tủa ADN
Trang 4- Ethanol 70% rửa muối , làm sạch ADN để thu được ADN tinh khiết
- Bảo quản ADN trong nước hay trong TE ( Tris 0.1M – EDTA 0.001M) để lâu hơn, To
-200c bảo quản trên 6 tháng , 40C bảo quản vài tuần
DD hòa mẩu GTE (glucose- Tris- EDTA)để phân tán vi khuẩn
Phải luôn giử lạnh vì để ức chế hoạt động của các men nội bào
RNAse 10mg/ml -> phân hủy ARN
III PP ĐO QUANG
1 Nguyên tắc pp đo quang:
Dùng tia sáng tử ngoại chiếu qua mẫu thử, nếu là phân tử hấp thụ ánh sáng sẽ hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng thích hợp và cho mật độ quang Dựa vào mật độ quang ta đánh giá được độ tinh sạch của mẫu
- OD ADN = 260nm, OD protein = 280nm, OD thực vật = 230nm
2 Mục đích của pp đo quang :
- Xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh kiết của phân tử ADN trong dd
- PP đo quang phổ dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại của dd ADN ở bức sóng 260nm
- Độ hấp thụ tỷ lệ với nồng độ ADN biểu thị thông qua mật độ quang OD ( oftic density) + OD260nm= 50μg/ml cho 1 dd ADN mạch kép
+ OD260nm= 40μg/ml cho 1 dd ADN mạch đơn
Chú ý : Cần phải làm sạch ARN vì ARN cũng có độ hấp thụ as tử ngoại ở bức sóng OD260nm nên làm sai lệch mật độ quang
3.Công thức :
Nồng độ ADN (μg/ml)= 50 ×OD 260nm
× n
50: hệ số chuyển đổi của dd nồng độ ADN sợi đôi (sợi đơn ×40)
n: hệ số pha loãng
4 Đánh giá độ tinh sạch :
- Đo dd ở bức sóng 260nm là mức hấp thụ cực đại của ADN
- Đo dd ở bức sóng 280nm là mức hấp thụ cực đại của protein
- Lập tỷ số: OD260/OD280 :
Trang 5+ Nếu kết quả = 1,8 – 2,0 : dịch chiết ADN tinh sạch
+ Nếu kết quả > 2 : ADN bị biến tính hoặc phân hủy , còn lẫn ARN
+ Kết quả < 1,8 : dd ADN còn lẫn tạp chất
Lưu ý : ADN thực vật thì đo thêm OD230nm
Tính độ tinh sạch AND thực vật: OD260nm/ OD230nm để loại polysacaric
5 Các bước cần tiến hành khi đến trạm đo quang
Yêu cầu: Đặt một mẫu thử vào máy đo quang
- Chọn 1 mẫu thử đúng ( V mẫu thử phải đủ 2ml)
- Cầm rửa cốc đo, lau cốc ( chỉ lau bên ngoài)
- Đổ mẫu thử vào cốc đo
- Đặt cốc đo vào máy ( lưu ý để mặt trong của cốc theo chiều ánh sáng đi qua)
- Chỉnh bước sóng phù hợp với yêu cầu đề bài
IV ĐIỆN DI
1 Nguyên tắc:
Là sự dịch chuyển của các phân tử tích điện về hướng các điện cực trái dấu với nó trong dd dưới tác dụng
của điện trường
Lưu ý: ADN mang điện tích âm sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương
2 Ứng dụng pp điện di:
Định tính và thu nhận mẫu ADN hiển thị trực tiếp:
- Sản phẩm ADN nguyên vẹn
- Sản phẩm ADN bị cắt giới hạn
- Sản phẩm ADN khuyếch đại bằng kỹ thuật PCR
3 Thành phần bộ điện di:
- Bồn, dd đệm, có dòng điện đi qua
- 2 điện cực ( -), (+)
- Giếng chứa ADN làm từ thạch ( bản nền để ADN di chuyển)
4 Chú ý khi đặt thạch:
- Giếng quay về cực âm
- Đè miếng thạch ngập nước
5 Tốc độ di chuyển của ADN phụ thuộc vào:
- Kích thước, cấu trúc ko gian của phân tử ADN
Trang 6- Nồng độ của chất cấu thành gel (nồng độ thạch cao: di chuyển các phân tử nhỏ, nồng
độ thạch thấp: di chuyển của các phân tử lớn)
6 Tại sao dùng bản thạch làm nền để các ADN di chuyển : vì cấu trúc của thạch là
polyme, tạo ra những khe (mắc lưới) cho phân tử đi qua