BÀI GIẢNG: Thực Hành Hóa sinh học.THS.PHẠM HỒNG HIẾU

Nội dung mơn học Buổi GiỚI THIỆU MƠN HỌC  Tên môn học  Thời lượng  Giảng viên   Trang web hieu/ Email ThS Phạm Hồng Hiếu Ng/liệu Pha hóa chất, chuẩn bị thiết bị dụng cụ B1: Định tính amino acid phản ứng ninhydrin B2: Xác định amino acid phương pháp sắc ký mỏng B3: Tìm điểm đẳng điện protein phương pháp tạo pH khác B4: Xác định hàm lượng protein thô : http://ibf.iuh.edu.vn/pham-hong- Malt (PTN) Dứa xanh : phamhonghieu@iuh.edu.vn hieuphamhong@gmail.com B5: Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt lực enzyme α-amylase B6: Xác định hoạt tính enzyme bromelin B7: Định lượng đường khử B8: Xác định lipide tổng Táo/ mận Đậu phộng B9: Xác định số acid peroxide chất béo : Thực Hành Hóa sinh học : 30 tiết TH : ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học ThS Phạm Hồng Hiếu Giáo trình tài liệu tham khảo Thực hành Hóa sinh học – ĐH Công nghiệp TP.HCM John L Tymoczko, Jeremy M Berg, Lubert Stryer Biochemistry A Short Course - 2nd W.H Freeman and Company, New York 2013 Mary K Campbell, Shawn O Farrel Biochemistry - 8th Cengage learning 2013 David L Nelson, Micheal M Cox Lehninger Principles of Biochemistry 6th edition, Freeman and Company, 2013 Reginald H Garrett, Charles M Grisham Biochemistry - 5th, Cengage learning, 2013 Thực hành Hóa sinh học Thực hành Hóa sinh học PTN Trứng PTN Dầu ăn Báo cáo thực hành ThS Phạm Hồng Hiếu Nội Dung Bài        Tên thí nghiệm Mục đích thí nghiệm Ngun tắc Hóa chất dụng cụ Cách tiến hành Kết thí nghiệm Bàn luận ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học Quy định chung Quy định chung  Sinh viên phải đủ buổi thực hành, vắng phải bù vào buổi khác (nhưng buổi bù bị trừ đ vào điểm báo cáo thực hành)  Sinh viên làm thực hành phải (trễ 15 phút không vào lớp, phải bù vào buổi khác)  Sinh viên phải mặc áo blouse, giữ gìn trật tự vệ sinh q trình thực hành, thí nghiệm, khơng tự ý chưa cho phép giảng viên, khơng tiếp khách phịng thí nghiệm  Dụng cụ thí nghiệm bàn giao kiểm tra, hư hỏng, mát phải có trách nhiệm bồi thường  Mỗi sinh viên phải nộp báo cáo thực hành nộp vào cuối buổi thực hành nên phải chuẩn bị nội dung trước để cần điền kết bàn luận vào cuối buổi thực hành  Trong q trình thực hành, giảng viên kiểm tra đột xuất lý thuyết thí nghiệm, sinh viên khơng nắm vững kiến thức, cách tiến hành thí nghiệm nhà ôn để làm bù vào buổi thực hành sau  Sinh viên có cột điểm, cột điểm báo cáo thực hành cột điểm kiểm tra cuối kỳ ThS Phạm Hồng Hiếu ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học Bài 0: Pha hóa chất, chuẩn bị thiết bị dụng cụ Thực hành Hóa sinh học Sử dụng dụng cụ  Dụng cụ đo thể tích  Một số dụng cụ PTN Sử dụng dụng cụ (đọc thêm tài liệu kỹ thuật PTN video clip web) Pha hóa chất ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học Dụng cụ đo thể tích Dụng cụ đo thể tích Dung dịch gì? Dung dịch hỗn hợp bao gồm hay nhiều chất tan dung mơi (có thể nước chất hữu ether, v.v) Thể tích dung dịch dễ bị ảnh hưởng nhiệt độ, đặc biệt nhiệt độ làm việc cách biệt nhiều so với 200C Đơn vị thể tích Thể tích dung dịch thường đo với đơn vị lít (L), mét khối (m3) đơn vị nhỏ chúng mililit (mL), micro-lit (μL) Lit (L) : lit (L)= 103 mililit (mL) = 106 microlit (μ L) m3 : m3 = 103 dm3 = 106 cm3 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học Nhiệt độ (oC) Phân loại dụng cụ đo thể tích Thực hành Hóa sinh học Nhiệt độ (oC) 25 Khối lượng riêng (g/ml) 0.99707 0.99999 30 0.99567 10 0.99973 35 0.99406 15 0.99913 40 0.99025 20 0.99823 45 0.99025 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 10 Phân loại dụng cụ đo thể tích  TC “to contain” • Dụng cụ “TC” loại dụng cụ mà thể tích dung dịch chứa (kể từ vạch định mức) thể tích ghi dụng cụ • Người ta thường dùng loại dụng cụ để chứa đựng dung dịch cần pha chế (pha chế dung dịch loại dụng cụ này) • Ví dụ: bình định mức, cốc đong, bình tam giác…  Dựa vào mục đích sử dụng, người ta chia dụng cụ đo thể tích làm loại: • TC: “to contain” – để chứa • TD: “to deliver” – để phân phối ThS Phạm Hồng Hiếu Khối lượng riêng (g/ml) 0.99987 11 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 12 Phân loại dụng cụ đo thể tích Một số dụng cụ đo dung tích  TD “to deliver” • Dụng cụ “TD” loại dụng cụ mà thể tích dung dịch chứa (kể từ vạch định mức) ứng với phần dung dịch chảy ra, khơng kể giọt cuối cịn đọng đầu dụng cụ • Người ta thường dùng loại dụng cụ để đong dung dịch chuyển sang dụng cụ khác • Ví dụ: pipet, buret ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học  Cách đọc số dụng cụ đo thể tích  Cốc đong  Bình tam giác  Ống đong  Pipet (Pipette)  Buret  Bình định mức 13 Cách đọc số dụng cụ đo thể tích  Các yêu cầu trước sử dụng dụng cụ đo dung tích • Mặt ngồi mặt dụng cụ đo thể tích trước đọc số phải thật Chỉ cần chút dơ hay có chút dầu dính mặt ngồi dụng cụ đo thể tích gây nên kết đọc sai • Nhiệt độ phịng chuẩn độ khơng q nóng hay lạnh Tốt với nhiệt độ chuẩn ghi dụng cụ Còn sai lệch nhiều, nên xác định độ sai số ảnh hưởng nhiệt độ tới dụng cụ đo • Khi đọc số dụng cụ đo thể tích, mắt người quan sát vạch phẳng với vạch mức (khi vạch mức thành trước, thành sau phải trùng nhau) ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 15 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 14 Cách đọc số dụng cụ đo thể tích  Cách đọc dụng cụ đo dung tích • Với dung dịch dụng cụ đo dung tích có mặt phẳng lõm xuống o Đối với dung dịch suốt ta đọc theo vạch phẳng ứng với mặt khum vệt lõm o Đối với dung dịch không suốt ta đọc theo vạch mức • Với dung dịch dụng cụ đo dung tích có mặt phẳng lồi lên o Đối với dung dịch suốt ta đọc theo vạch phẳng ứng với mặt khum vệt lồi o Đối với dung dịch không suốt ta đọc theo vạch mức ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 16 Cách đọc số dụng cụ đo thể tích Cốc đong  Cốc đong hay cịn gọi beaker làm thủy tinh hay nhựa tổng hợp, thân cốc có chia vạch ghi số mL  Trong phịng thí nghiệm, hay sử dung loại cốc tích 50mL, 100mL, 250mL, 500mL, 1000mL  Độ xác hệ thống dụng cụ đo thể tích  Nó dùng để hịa tan dung dịch trước cho vào bình định mức đun nấu chất Hình Minh họa cách đọc thể tích xác ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 17 ThS Phạm Hồng Hiếu Bình tam giác Thực hành Hóa sinh học 18 Ống đong  Bình tam giác hay cịn gọi erlen bình nón, làm thủy tinh tổng hợp (có nút nhám khơng có nút nhám), thân bình có chia vạch ghi số mL  Trong phịng thí nghiệm, hay sử dụng loại bình tam giác tích 50mL, 100mL, 250mL, 500mL, 1000mL  Độ xác hệ thống dụng cụ đo thể tích  Bình thường sử dụng chuẩn độ hóa học bình có nút nhám sử dụng dung dịch bay ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 19  Ống hình trụ thủy tinh hay nhựa tổng hợp, thân ống có chia vạch theo dung tích ghi số mL Trong phịng thí nghiệm, hay sử dung loại bình tam giác tích 5mL, 10mL, 50mL, 100mL, 250mL, 500mL, 1000mL Ở số trường hợp dung dịch bay hơi, độc hại, ống đong có nút nhám sử dụng Cách sử dụng ống đong sau: • Chọn ống đong có dung tích gần với thể tích muốn lấy (khơng lấy ống đong 250mL để đong thể tích 10mL dung dịch!) • Để ống đong bề mặt nhẵn, ổn định • Nhìn đọc kết ngang tầm mắt vạch phẳng ứng với mặt khum vệt lồi ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 20 Pipet (Pipette) Pipet (Pipette)  Pipet ống thủy tinh dài, bé, phình giữa; đầu ống kéo dài vuốt nhỏ Các pipet thường thiết kế theo dạng TD Dùng để đong chuyển thể tích dung dịch xác định từ dụng cụ sang pipet sang dụng cụ khác Pipet chia thành loại sau: • Pipet bầu • Pipet khắc vạch • Micropipet (Micropipette) ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 21  Pipet bầu: loại đánh vạch để đong thể tích xác Pipet bầu có bầu phình to thân, bầu ghi dung tích 1mL 2mL, 5mL, 10mL, 50mL, phía bầu có vịng ngấn loại có hai vịng ngấn phía phía bầu để giới hạn xác lấy chất lỏng ThS Phạm Hồng Hiếu Pipet (Pipette) Thực hành Hóa sinh học 22 Pipet (Pipette)  Pipet khắc vạch: Pipet thường có dung tích từ đến 100mL chia độ với dung tích khác nhau, từ 0.1mL nhỏ Thành ngồi chúng chia vạch đến độ xác khác tùy theo nhu cầu người sử dụng Thể tích chất lỏng chứa pipet biểu diễn mL ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 23  Micropipet (Micropipette): Muốn đo thể tích nhỏ chất lỏng người ta dùng micropipet dung tích từ 5μL đến 20mL Có hai loại Micropipet loại đầu nhiều đầu, phân loại Mircorpipet dạng cầm tay điện tử Micropipete thường có chia độ, có vạch chia 0,01mL, nên đọc với độ xác 0,002  0,005mL ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 24 Pipet (Pipette) Pipet (Pipette)  Nguyên tắc làm việc với pipet • Không chạm tay vào phần pipet Nhiệt từ tay truyền sang thủy tinh, dung tích pipet đựng chất lỏng tăng lên • Cầm đầu pipet ngón tay ngón tay phải nhúng đầu pipet vào dunh dịch (đến gần đáy bình) Chú ý giữ cho đầu pipet ngập dung dịch Tay trái giữ bình đựng dung dịch Muốn hút đầy pipet, người ta nhúng đầu vào chất lỏng hút chất lỏng lên bóp cao su miệng  Micropipet (Micropipette): ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 25 ThS Phạm Hồng Hiếu Pipet (Pipette) Thực hành Hóa sinh học 26 Pipet (Pipette)  Nguyên tắc làm việc với pipet • Nếu hút dung dịch miệng cần tập hút chất lỏng động tác mút lưỡi ngắt qng, khơng hít khơng khí từ pipet vào • Khi hút, cần phải thở hoàn toàn tự qua mũi đầu bé pipet luôn phải nhúng chất lỏng Chất lỏng hút lên cao vạch dấu khoảng – 3cm, sau nhanh chóng bịt lấy lỗ ngón trỏ bàn tay phải giữ pipet ngón ngón Ngón trỏ cần phải ướt, ngón tay ướt bịt pipet chặt • Hút dung dịch miệng áp dụng hút nước, để đảm bảo an toàn sinh viên Tuyệt Đối không hút dung dịch miệng! ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 27  Nguyên tắc làm việc với pipet • Khi pipet đầy (nhìn đọc mức chất lỏng ngang tầm mắt) thả hở ngón trỏ để chất lỏng chảy từ từ khỏi pipet Khi dung dịch chảy đến vị trí vạch dấu, bịt chặt ngón tay lại Nếu lúc đầu pipet cịn dính giọt, phải cẩn thận gạt giọt xuống Đưa pipet sang bình hứng, thả ngón trỏ để chất lỏng chảy theo thành bình Khi chất lỏng chảy đến vị trí định, dùng ngón trỏ bịt lỗ pipet lại, giữ pipet thêm khoảng giây, vị trí nghiêng thành bình, xoay nhẹ xung quanh trục • Chú ý khơng dung dịch bắn tung t lên thành bình, điều gây ảnh hưởng đến q trình phân tích hóa học sau • Khơng đuổi giọt chất lỏng lại khỏi pipet cách thổi dùng bàn tay ấp nóng phần bầu pipet ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 28 Pipet (Pipette) Pipet (Pipette)  Nguyên tắc làm việc với pipet ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học  Nguyên tắc làm việc với pipet • Khi hút dung dịch chất độc phải sử dụng bóp hình lê, dùng thiết bị đặc biệt khác bóp cao su có van Bóp cao su có ba van, điều khiển chúng để hút chất lỏng vào cho chất lỏng chảy khỏi pipet Dụng cụ đặc biệt thuận tiện làm việc với dung dịch độc có mùi khó chịu 29 ThS Phạm Hồng Hiếu Pipet (Pipette) Thực hành Hóa sinh học 30 Micropipet  Khi sử dụng micorpipet thiết phải tuân theo qui tắc sau đây: • Khơng điều chỉnh lấy thể tích q thể tích qui định • Khơng để ngược micropipet, tránh để chất lỏng lọt vào ống hút • Sử dụng đầu hút (tips) phù hợp (về thể tích) • Nên để nhiệt độ dung dịch micropipet • Thả nút hút chất lỏng từ từ (khơng nên q chậm gây sai số) thả nút thả dung dịch từ từ (chú ý đến dung dịch có độ nhớt cao) • Thao tác tháo đầu hút cách ấn nút đến nút dừng thứ rửa đầu hút dung dịch rửa sử dụng lại đầu hút • Để micropipet theo chiều thẳng đứng để hút dung dịch để góc 450C để thả dung dịch xuống • Tuyệt đối khơng sử dung micropipet để hút hóa chất gây hại (ether, hexan làm hư đầu hút nhựa, v.v) • Bảo quản micropipet nhiệt độ độ ẩm theo đề nghị nhà sản xuất ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 31 Lấy mẫu theo chiều xuôi ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 32 Micropipet Pipet (Pipette)  Làm pipet: • Sai số gây pipet bẩn lớn, dung tích pipet tương đối nhỏ Vì làm việc với pipet • Trước dùng pipet phải rửa sấy khơ cẩn thận • Sau dùng xong pipet phải rửa liền có điều kiện • Pipet thường làm với dung dịch tẩy rửa (ví dụ: xà bơng, hỗn hợp cromic, dung dịch kiềm pemanganat, hỗn hợp rượu với ete,… ) • Cho dung dịch tẩy rửa vào phần ba pipet • Bịt pipet lại, đặt nằm ngang, lắc pipet cách cẩn thận cho dung dịch tẩy rửa lan phía pipet • Rửa lại nước (chú ý: trình tẩy rửa dùng dung dịch có tính tẩy rửa mạch thiết phải đeo bao tay, đồng thới tránh không để dung dịch tẩy rửa bắn vào thể) • Lặp lại quy trình cần Lấy mẫu theo chiều ngược ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 33 ThS Phạm Hồng Hiếu Pipet (Pipette) Thực hành Hóa sinh học 34 Buret  Làm pipet: • Pipet sau rửa sạch, sấy để vào giá riêng đậy lên ống nghiệm nhỏ mảnh giấy lọc • Sau làm việc, phải tráng pipet vài ba lần nước cất đặt vào ống đo thủy tinh, thay lớp giấy lọc đậy lớp giấy • Trong điều kiện khơng thể sấy khô liền, ta nên rửa thật pipet, tráng lại nước cất, tráng lại dung dịch định hút, sau dùng để hút dung dịch ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 35   Buret dùng để chuẩn độ, để đo thể tích xác … Đó dụng cụ thường có dung tích tứ đến 100 mL, khắc vạch xác đến 0.01 mL hay 0.1 mL ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 36 Buret  Buret Phân loại buret theo dạng khố buret ta chia làm hai loại: • Loại có khóa: Khóa buret nhựa hay thủy tinh mài nhám Nếu dùng khóa thủy tinh mài nhám ta cần ý: giữ cho khóa dễ xoay cách thoa lớp vaselin vào chỗ thủy tinh mài; khơng rót dung dịch kiềm vào buret này, kiềm có khả ăn mịn thủy tinh • Loại khơng có khóa: Đầu gắn ống cao su nối với mao quản thủy tinh ống cao su kẹp kẹp Mohr có hạt cườm thủy tinh bên ống Dùng ngón tay bóp kẹp hay kéo ống cao su chỗ có viên thủy tinh, chất lỏng từ buret chảy Ống cao su phải có thành dầy 1,5mm, có đường kính gần 3mm Như đường kính ngồi ống cao su khoảng 6mm ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 37  Phân loại buret theo phương thức sử dụng: • Buret thường: Người sử dụng tự cho dung dịch chuẩn vào buret Loại ta thường hay gặp phịng thí nghiệm • Buret bán tự động: Có bầu thủy tinh đựng dung dịch chuẩn, có bình chứa trung gian Loại buret cồng kềnh, ta gặp • Buret tự động: Có bầu thủy tinh đựng dung dịch chuẩn, bên hơng có thiết bị để đưa dung dịch lên buret cách tự động Rất xác Tuy nhiên giá thành cao Trong phịng thí nghiệm phân tích nên có hai buret loại này.,Được sử dụng để kiểm tra nồng độ dung dịch chuẩn Ngoài thí nghiệm địi hỏi phải kiểm tra mẫu thường xuyên với dung dịch chuẩn ta sử dụng buret loại ThS Phạm Hồng Hiếu Buret Thực hành Hóa sinh học 38 Buret  Nguyên tắc làm việc với buret (1) Treo burret lên giá đỡ (2) Xả hết bọt khí burret cách mở khóa burret (3) Rót dung dịch vào burret (4) Định vạch mức (5) Chuẩn độ (6) Xịt nước cất quanh thành bình ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học  Làm buret • Khi kết thúc công việc, không sử dụng buret nữa, ta phải làm vệ sinh buret thật kỹ Khi đổ dung dịch khỏi buret phải rót từ từ để tất chất lỏng chảy hết khỏi thành buret, điều có ý nghĩa đặc biệt chuẩn độ dung mơi khác nước • Cách rửa buret giống pipet Ngoài rửa cần ý rửa cẩn thận phần khố buret dung dịch chất dơ thường đọng khóa • Sai số buret bẩn lớn Sai số lớn vết bẩn dầu mỡ trình chuẩn độ giọt chất lỏng bị giữ lại thành buret kết đo bị sai lệch Để tránh chất dầu mỡ rơi vào buret không nên dùng buret bẩn, bôi trơn khóa buret với nhiều vaselin bịt tay vào đầu buret rửa • Đối với thí nghiệm phân tích đặc biệt, làm buret khơng phải có rửa mà sau rửa cịn phải hấp nước cần 39 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 40 Bình định mức     Bình định mức Là bình thủy tinh trịn, đáy bằng, cổ dài bé có vạch định mức Bình định mức dùng để đong thể tích dung dịch, để pha chế dung dịch có nồng độ xác định Chính bình định mức thường loại ”TC” Thể tích chất lỏng đựng bình biểu diễn mililit Trên bình có ghi dung tích nhiệt độ (thường 20oC), dung tích đo nhiệt độ ghi bình Các bình định mức thường có dung tích khác từ 20 đến 1000 mL ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 41  Nguyên tắc làm việc với loại bình định mức • Tránh tiếp xúc tay vào bầu bình, cầm vào phần cổ bình Vì nhiệt từ tay chuyền vào thành bình làm cho dung dịch bình nóng lên số đọc khơng cịn xác • Trước làm đầy bình ta đặt bình lên mặt phẳng chiếu sáng rõ ThS Phạm Hồng Hiếu Bình định mức Thực hành Hóa sinh học 42 Bình định mức  Phương pháp pha hóa chất: • Cân lượng hóa chất cần pha beaker khơ • Cho dung mơi vào hịa tan chất rắn beaker • Cho dung mơi hịa tan chất rắn vào bình, lấy dung mơi tráng beaker đổ tiếp vào bình, làm vài lần cho đảm bảo tất lượng hóa chất có bình Rót thêm dung mơi vào bình khơng q ½ hay 1/3 bình tia Sau lắc bình chất tan hồn tồn • Chỉ sau thêm vào bình lượng dung mơi Ở giai đoạn cuối (cịn 1-2 mL), ta thêm dung mơi vào giọt pipet có bóp cao su ống nhỏ giọt Khi mắt người làm thí nghiệm vạch định mức phải nằm đường thẳng Nếu bề mặt chất lỏng phần mặt khum lõm phần phải chập trùng với vạch định mức, cịn mặt khum lồi phần phải trùng với vạch định mức (đối với dung dịch suốt) ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 43  Phương pháp pha hóa chất: (tt) • Nếu dung mơi cho vào q vạch mức chút ta dùng giấy lọc thấm bớt phần dung dịch dư Đậy kín bình, cẩn thận lắc dung dịch • Những điều cần ý sử dụng bình định mức: o Khơng cho vào bình chất khó tẩy rửa o Khơng để dung dịch pha chế q lâu bình o Khơng đun nóng bình  Làm bình định mức: giống với pipet ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 44 Một số thiết bị dụng cụ PTN Một số thiết bị dụng cụ PTN  Ống nghiệm:  Giá ống nghiệm: Thường Chịu nhiệt Giá gỗ Giá inox Giá nhựa Có nắp ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 45 Một số thiết bị dụng cụ PTN ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 46 Một số thiết bị dụng cụ PTN  Kẹp ống nghiệm: Kẹp gỗ ThS Phạm Hồng Hiếu  Giá đỡ kẹp: Kẹp inox Thực hành Hóa sinh học Kẹp sắt 47 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 48 Một số thiết bị dụng cụ PTN Một số thiết bị dụng cụ PTN  Các loại chổi rửa: ThS Phạm Hồng Hiếu  Đũa thủy tinh Thực hành Hóa sinh học 49 Một số thiết bị dụng cụ PTN Thực hành Hóa sinh học 50 Một số thiết bị dụng cụ PTN  Bóp cao su: ThS Phạm Hồng Hiếu ThS Phạm Hồng Hiếu  Bình đựng hóa chất: Thực hành Hóa sinh học 51 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 52 Một số thiết bị dụng cụ PTN Một số thiết bị dụng cụ PTN  Ống nhỏ giọt bình nhỏ giọt: ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học  Cối chày sứ: 53 Một số thiết bị dụng cụ PTN Thực hành Hóa sinh học 54 Một số thiết bị dụng cụ PTN  Các phễu: ThS Phạm Hồng Hiếu ThS Phạm Hồng Hiếu  Đèn cồn: Thực hành Hóa sinh học 55 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 56 Một số thiết bị dụng cụ PTN Một số thiết bị dụng cụ PTN  Bếp điện lưới amiăng: ThS Phạm Hồng Hiếu  Tủ sấy: Thực hành Hóa sinh học 57 Một số thiết bị dụng cụ PTN Thực hành Hóa sinh học 58 Một số thiết bị dụng cụ PTN  Tủ ấm: ThS Phạm Hồng Hiếu ThS Phạm Hồng Hiếu  Cân kỹ thuật cân phân tích: Thực hành Hóa sinh học 59 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 60 Một số thiết bị dụng cụ PTN Một số thao tác  Lò nung: ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 61 ThS Phạm Hồng Hiếu Pha hóa chất  Nồng độ phụ: • Dùng cho phản ứng mang tính chất quan sát • Dùng làm mơi trường cho phản ứng xảy • Phục vụ cho cơng việc pha chế • Gồm: o Nồng độ % (C%w/w, C%w/v, C%v/v) o Nồng độ tỷ lệ VD: dd HCl 1:5 (1 phần HCl+5 phần H2O)  Nồng độ chính: • Dùng đo hàm lượng/nồng độ chất liên quan trực tiếp đến mức độ sai kết • Gồm: CM, CN (hay N), T (ppm, ppb, g/kg, g/L) ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 63 Thực hành Hóa sinh học 62 Pha hóa chất  100  250  250  250  250  250  250 ml NaOH 30% từ NaOH 96% ml NaOH 1% từ NaOH 96% ml CuSO4 1% từ CuSO4.5H20 98% ml HCl 1% từ HCl 36% ml NaOH 1N từ NaOH 96% ml NaOH 0,1N từ NaOH 1N ml cồn 800 từ cồn 960 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 64 100 ml NaOH 30% từ NaOH 96% 250 ml NaOH 1% từ NaOH 96% C%w/v (g/100ml) ≈ C%w/w (g/100g) C%w/v = C%w/w x dNaOH30% (tra bảng dNaOH30% = 1,3311 g/ml) C%w/v = mct x 100 / Vdd → mct = C% x Vdd /100 = x 250 /100 = 2,5 g mà C%w/v = mct x 100 / Vdd = C%w/w x dNaOH30% → mct = C%w/w x dNaOH30% x Vdd /100 = 30 x 1,3311 x 100 /100 = 39,933 g Do NaOH có độ tinh khiết 96%: m’ct = mct x 100 / 96 ≈ 2,604 g Do NaOH có độ tinh khiết 96%: m’ct = mct x 100 / 96 = 41,597 g ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 65 250 ml CuSO4 1% từ CuSO4.5H2O 98% ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 250 ml HCl 1% từ HCl 36% Tương tự trên: mct = C% x Vdd /100 = 2,5 g Tương tự trên: mct = C% x Vdd /100 = 2,5 g m’ = m x 100 / 98 ≈ 2,551 g m’ = m x 100 / 36 ≈ 6,944 g Trong 250 g CuSO4.5H2O có 160g CuSO4 m’’ = m’ x 250 / 160 ≈ 3,986 g dHCl36% = 1,18 g/ml → V = m / d ≈ 5,9 ml ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 67 66 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 68 250 ml NaOH 0,1N từ NaOH 96% 250 ml NaOH 0,01N từ NaOH 0,1N m = NĐV = 0,1.40.250/1000 = g N1V1 = N2V2 m’ = m x 100 / 96 ≈ 1,042 g ThS Phạm Hồng Hiếu →V1 = N2V2/N1 = 0,01 x 250 / 0,1 = 25 ml Thực hành Hóa sinh học 69 96 80  80 H20: Thực hành Hóa sinh học 70 Bài 1: Định tính amino acid phản ứng ninhydrin 250 ml cồn 800 từ cồn 960 Cồn 96°: ThS Phạm Hồng Hiếu Nguyên lý: Tất α-amino acid tạo phức màu với thuốc thử Ninhydrin theo chế sau: 16 Vcồn 96 / VH20 = 80/16 → Vcồn 96 = (80/16) VH20 mà Vcồn 96 + VH20 ≈ 250 ml → (80/16) VH20 + VH20 = 250 ml → VH20 = 250 x 16 /96 ≈ 41,7 ml → Vcồn 96 = 250 – 41,7 = 208,3 ml Thực tế: Vcồn 96 = 80 x = 240 ml VH20 = 16 x = 48 ml ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 71 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 72 Bài 1: Định tính amino acid phản ứng ninhydrin Ống Glycine 0,02% (mL) 1 Protein trứng (mL) Ninhydrin 0,1% (giọt) Bài 2: Xác định amino acid phương pháp sắc ký mỏng  Nguyên lý: cm 5 cm cm Bút chì Đun nóng ống nghiệm phút đèn cồn/đun cách thủy nhiệt độ 70C phút  quan sát & nhận xét 0,5 cm aa1 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 73 Bài 3: Tìm điểm đẳng điện protein phương pháp tạo pH khác Ống Na2HPO4 0,2M (mL) Acid citric C6 H8 O 0,1M (mL) pH Protein trứng 5% (mL) Cồn 96 (mL) 0,34 0,66 3,7 1 0,48 0,52 4,7 1 0,66 0,34 5,7 1 Lắc đều, để yên phút  quan sát & nhận xét ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 75 ThS Phạm Hồng Hiếu aa2 hh aa Thực hành Hóa sinh học 74 Bài 4: Xác định hàm lượng protein thô  Nguyên lý: Vơ hóa mẫu: Mẫu vơ hóa H2SO4 đậm đặc nhiệt độ cao với chất xúc tác Các chất chứa nitơ → (NH4)2SO4 Cất đạm: • Dùng dung dịch NaOH đuổi NH3 khỏi dung dịch: (NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 +H2O • NH3 bay sang bình hứng có chứa dung dịch H2SO4 (đã biết trước nồng độ, thể tích: NH3 + H2O → NH4OH 2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + H2O Định phân lượng H2SO4 dư dung dịch NaOH, từ ta xác định lượng H2SO4 phản ứng tính hàm lượng nitơ tổng có mẫu: H2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2H2O ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 76 Bài 5: Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt lực enzyme α-amylase Bài 4: Xác định hàm lượng protein thô  Tiến hành: 10ml mẫu giọt pp NaOH 30% (+2ml) H2O H2O * H2O H2O vào 25ml H2SO4 0,1N giọt MR ThS Phạm Hồng Hiếu 8 * phễu bình cầu đựng nước bếp điện phễu bình chứa nước ngưng cốc thuỷ tinh ống sinh hàn erlen bình cất ống nối cao su  Cách tiến hành: Cân 5g lúa nảy mầm  nghiền với 10ml nước cất  để yên 15 phút  lọc  5ml nước lọc  thêm vào 20ml cồn tuyệt đối (kết tủa)  để lắng  lọc & rửa kết tủa lần với ml cồn tuyệt đối  hòa tan phần kết tủa = 10ml H2O  dung dịch amylase (dịch chiết) Thực hành Hóa sinh học 77 ThS Phạm Hồng Hiếu Bài 5: Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt lực enzyme α-amylase Pha NaCl 0,1% Ống Na2HPO4 C6H8O7 0,2M (mL) 0,1M (mL) 9,34 10,66 10,30 9,70 11,14 8,86 12,08 7,92 13,22 6,78 14,54 5,46 16,46 3,54 pH 4,6 5,0 5,4 5,8 6,2 6,6 7,0 Tinh bột Enzyme 0,2% (mL) (mL) 5 5 5  Nhỏ giọt Lugol lên mặt kính đồng hồ  Cứ phút nhỏ giọt dd ống lên giọt Lugol  ống âm tính với Lugol ( ko màu xanh tím)  nhỏ giọt Lugol vào tất ống nghiệm  quan sát & nhận xét ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 79 Thực hành Hóa sinh học 78 Bài 6: Xác định hoạt tính enzyme bromelin  Nguyên lý: • Cho Protease tác dụng với Casein Hemoglobin, sau ức chế Enzyme TriCloAcetic acid (TCA) để dừng phản ứng, xác định sản phẩm tạo thành phản ứng màu với thuốc thử Folin • Biểu diễn hoạt tính đơn vị hoạt độ Một đơn vị hoạt độ lượng enzyme phút 300C phân giải lượng protein tương đương với mol tyrosine ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 80 Bài 6: Xác định hoạt tính enzyme bromelin Bài 6: Xác định hoạt tính enzyme bromelin   Đường chuẩn Tyrosine: Ống nghiệm Tyrosine chuẩn (mL) Tyrosine tương ứng (µM) Ống nghiệm Thử không (2) Casein 1% (mL) 5 0,2 0,4 0,6 0,8 TCA 5% (mL) 10 Enzyme mẫu (mL) 1 0,2 0,4 0,6 0,8 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 5,0 NaOH 0,5N (mL) 10 10 10 10 10 10 Folin pha loãng (mL) 3 3 3 Thực hành Hóa sinh học Lắc giữ 35,50C 10 phút TCA 5% (mL) 10 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên  Hút 5ml dịch lọc (ống  ống A, ống  ống B)  Thêm 10mL NaOH 0,5N + 3mL Folin, lắc mạnh  Để 10 phút, đo OD 660nm  tính ΔOD = ODT - OD0 Lắc mạnh, sau 10 phút OD bước sóng 660nm 81 ThS Phạm Hồng Hiếu Bài 6: Xác định hoạt tính enzyme bromelin  Thử thật (1) HCl 0,2N (mL) ThS Phạm Hồng Hiếu Xác định Tyrosine mẫu: Thực hành Hóa sinh học 82 Bài 7: Định lượng đường khử Hoạt độ Enzyme Protease tính theo cơng thức:  KN đường tổng & đường khử: Đường khử: Ag+  Ag, Cu2+  Cu+, Fe3+  Fe2+ dd A (1g/l glu,2g/l fruc,3g/l sac)  Xđ đường khử  Xk = 3g/l V: Tổng thể tích hỗn hợp ống nghiệm (2) (mL) v: Thể tích dịch lọc đem phân tích (mL) t: Thời gian thủy phân (phút) m: Khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) L: Độ pha lỗng mẫu enzyme µM Tyrosine: Lượng µM Tyrosine v (mL) suy từ đường chuẩn (cách làm giống 7) ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 83 dd A  Thủy phân = HCl  Xđ đường khử  Xt > 6g/l C12H22O11 (sac) + H2O  C6H12O6 (glu) 342 18 180 Xko khử = (Xt – Xk)*k + C6H12O6 (fruc) 180 Nếu 100% Xko khử = saccharose  k = 342/360 = 0.95 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 84 Bài 7: Định lượng đường khử Bài 7: Định lượng đường khử  Nguyên lý: – Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS) – Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử Dựa theo đồ thị chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic tính hàm lượng đường khử mẫu nghiên cứu – Bước sóng so màu: 530nm  Cách tiến hành: Cân – 6g táo/mận  trích ly nhiều lần cồn  cô khô 30ml  định mức 100ml  pha loãng 10 lần  dịch chiết Ống nghiệm Chuẩn glucose 500ppm Thực hành Hóa sinh học Dung dịch DNS C (ppm) A 85 M1 M2 50 100 150 200 Cx Cx A0 = A1 A2 A3 A4 Ax1 Ax2 0.5 0.5 0.5 9.5 8.5 7.5 6.5 0.5 M1 M2 2 0.5 0.5 5.5 7.5 7.5 86 M1 M2 C (ppm) 50 100 150 200 Cx Cx A 0,805 1,372 2,052 2,634 1,006 1,012 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử mẫu y = 0.0135x R² = 0.9947 2.5 1.5 2.634 Giả sử m = 5,230 g → ppmbd = 74202 → C%bd = 7,42% 1.372 0.805 0.5 0 87 Ta có: Ax = 0,013Cx mà Ax = 1,009 → Cx = 77,6 2.052 Vdo Vdm Vdm1   Vxd2 Vxd1 m bd Thực hành Hóa sinh học Thực hành Hóa sinh học Ống nghiệm Vdo Vdm Vdm1 100    Vxd2 Vxd1 m bd 106 ThS Phạm Hồng Hiếu 0.5 ThS Phạm Hồng Hiếu  C % bd  C x  Ví dụ Ax = ½ (Ax1 + Ax2) Từ số liệu thu lập đường chuẩn y = ax (A = aC) Từ tìm Cx = Ax/a  ppmbd  C x  Đun cách thủy sôi 10 ph (đậy nắp ống nghiệm), chuyển màu nâu đỏ Bài 7: Định lượng đường khử Ống nghiệm Dịch xác định Nước cất ThS Phạm Hồng Hiếu 50 ThS Phạm Hồng Hiếu 100 150 200 Thực hành Hóa sinh học 250 88 Bài 8: Xác định lipide tổng  Bài 8: Xác định lipide tổng Ngun lý: • Lipide khơng tan nước rượu, tan dung môi hữu • Ngun liệu giàu lipide làm khơ  trích ly lipide = ether etylic / ether dầu hỏa Soxhlet  xác định mbéo cách: o C1: Tính lượng mẫu sau trích ly chất béo o C2: Đuổi dung mơi, thu cân mbéo ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 89  ThS Phạm Hồng Hiếu Bài 8: Xác định lipide tổng  Thực hành Hóa sinh học Thực hành Hóa sinh học 90 Bài 8: Xác định lipide tổng Tiến hành: • Chuẩn bị dụng cụ: o Rửa Soxhlet, tráng lại phần bình đun, bình chiết, ống xi phơng = aceton o Sấy khơ tủ sấy 1050C o Lau phần dụng cụ tiếp xúc với nguyên liệu miếng giấy lọc có tẩm ether (lau lần miếng giấy lọc khác nhau) ThS Phạm Hồng Hiếu Tiến hành: • Chuẩn bị mẫu: o Cân xác ~ 2g ngliệu nghiền nhỏ o Sấy ngliệu tủ sấy 1050C đến khối lượng không đổi, để nguội bình hút ẩm o Cân nguyên liệu sấy khơ hồn tồn o Cắt giấy lọc 8x10cm, gấp thành bao, sấy 1050C đến KL không đổi, để nguội bình hút ẩm, cân o Cho mẫu vào bao giấy, tránh rơi rớt 91  Tiến hành: • Chuẩn bị mẫu thiết bị Soxhlet: o Đặt bình đun lên nồi cách thủy o Lắp bình chiết khớp với miệng bình đun o Đặt bao mẫu vào đáy bình chiết o Đặt phễu thủy tinh lên miệng ống sinh hàn o Lắp kiểm tra hệ thống dẫn nước ống sinh hàn o Cho ether vào ngập mẫu & chiếm ~ 2/3 bình đun o Kiểm tra lại độ kín tồn hệ thống ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 92 Bài 8: Xác định lipide tổng  Tiến hành: • Quá trình chiết rút lipide thiết bị Soxhlet: o Cho gói mẫu vào ống trụ, gắn nút bơng gịn phía phễu ống sinh hàn o Bật bếp cách thủy nhiệt độ 45 – 500C o Mở nước hệ thống sinh hàn o Chiết đến hết lipide mẫu: (1 cách)  Ether ống trụ không màu  Nhỏ vài giọt dung môi ống trụ nhỏ vào miếng giấy lọc/miếng thủy tinh  vết loang dung môi sau khô không phân biệt giấy trắng/miếng thủy tinh ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 93 Kết quả: • C1: Sấy cân mẫu: % lipide  B  C   100 G o G: Khối lượng mẫu đem phân tích (g) o B: Khối lượng bao giấy có chứa mẫu độ khơ tuyệt đối (khối lượng giấy khô tuyệt đối + khối lượng mẫu khô tuyệt đối) (g) o C: Khối lượng bao giấy có chứa mẫu chiết rút lipide độ khô tuyệt đối (g) ( m  m2 )  100 % lipide  • C2: Sấy cân dung mơi: G o m1 o m2 : Khối lượng bình cầu có chứa lipide (g) : Khối lượng bình cầu khơng (g) ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 94 Xác định số acid • Cân 5g dầu mỡ  hòa tan 25mL cồn + 25mL ether trung tính, thêm giọt pp • Chuẩn độ NaOH 0,1N đến màu hồng bền vững sau 30 giây • Đối với loại tinh dầu có nhiều ester dễ bị xà phịng hóa: dùng dd NaOH 0,05N để chuẩn độ , , = • Chỉ số acid A = Xác định số acid • Chỉ số acid = số mg KOH cần thiết để trung hòa hết acid béo tự có g chất béo: RCOOH + KOH  RCOOK + H2O • Trong dầu mỡ, lượng acid béo tự không đáng kể tăng lên trình bảo quản giai đoạn nẩy mầm  đánh giá dầu mỡ cũ/mới, qua chế biến hay chưa Thực hành Hóa sinh học  Bài 9: Xác định số acid peroxide chất béo Bài 9: Xác định số acid peroxide chất béo ThS Phạm Hồng Hiếu Bài 8: Xác định lipide tổng o 5,61 / 2,805 : số mg KOH tương ứng với 1mL NaOH 0,1N / 0,05N o a / a’ : số mL NaOH 0,1N / 0,05N sử dụng định lượng o b : trọng lượng chất thử để định lượng (g) 95 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 96 Bài 9: Xác định số acid peroxide chất béo Bài 9: Xác định số acid peroxide chất béo Chỉ số peroxide: • Chỉ số peroxyd số gram Iode giải phóng peroxyd có 100 gram chất béo • Được tính mili đương lượng oxy hoạt tính làm oxy hố KI 1kg mẫu Chỉ số peroxide: • 5mL dd dầu bị hóa + 30mL cloroform–a.acetic 1:2 + 1mL dd KI bão hòa  đậy nắp  lắc hh phút để yên phút bóng tối • Thêm 50mL nước cất • Định phân iod dung dịch Na2S2O3 0,002N với vài giọt thị hồ tinh bột 1% đến màu xanh tím • Làm TN kiểm chứng khơng có chất béo Na2S2O3 + I2 → 2NaI+ Na2S4O6 • Chỉ số peroxyt xác định mức độ hóa chất béo ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 97 ThS Phạm Hồng Hiếu Thực hành Hóa sinh học 98