bài giảng thực hành vi sinh y

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUY TÂN KHOA Y BÀI GIẢNG THỰC HÀNH Môn học : CĂN BẢN VI SINH HỌC Mã mơn học: MIB 251 Số tín chỉ: Thực hành : Lý thuyết: 02 01 Dành cho sinh viên ngành: Điều dưỡng Khoa : Y Bậc đào tạo: Đại học – Cao đẳng Học kỳ : I Năm học : 2016 - 2017 Đà Nẵng, tháng 01năm 2017 Thực hành Vi sinh học Thực hành Vi sinh học NỘI QUY PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC Vi sinh vật thể sống có kích thước vơ nhỏ bé mà mắt thường khơng thể nhìn thấy Bên cạnh vi sinh vật có ích cho sống người, vi sinh vật có khả gây bệnh có hại sức khỏe người Chính thế, người làm thí nghiệm phịng thí nghiệm vi sinh cần phải tn thủ quy tắc sau đây: Phải chuẩn bị cho buổi thí nghiệm cách đọc kỹ, làm quen với quy tắc phương pháp có liên quan đến thí nghiệm, nhằm sử dụng thời gian cách hiệu quả, đồng thời giảm thiểu tối đa rủi ro xảy làm thí nghiệm Khơng ăn, uống, hút thuốc, nói chuyện ồn tiến hành thí nghiệm Phải ln mặc áo blouse phịng thí nghiệm, tuyệt đối không để môi trường hay vật phẩm có vi sinh vật dấy lên quần áo, giấy tờ dụng cụ cá nhân Đồng thời phải ý bảo vệ da quần áo khỏi bị dính hóa chất thuốc nhuộm Chỉ đem đồ vật cho phép vào phịng thí nghiệm, tài liệu hướng dẫn thực hành, sổ sách ghi chép, vật liệu thí nghiệm khác Tất thứ khác áo khoác, túi sách, sách vở,… phải đặt nơi quy định, cách xa nơi làm thí nghiệm Trước lúc bắt đầu làm thí nghiệm phải sát trùng bề mặt bàn thí nghiệm hóa chất sát trùng chuẩn bị sẵn lau khô giấy vệ sinh Lặp lại công việc lần sau hồn thành thí nghiệm Tất vật liệu hóa chất thí nghiệm ngồi tên vật liệu, hóa chất cịn phải ghi xác tên người làm thí nghiệm, tên lớp học ngày làm thí nghiệm, để tránh nhầm lẫn sử dụng vứt bỏ vật liệu, hóa chất Chú ý, phải cẩn thận để không làm đổ, vỡ, hư hỏng trang thiết bị dụng cụ Phải ý cẩn thận sử dụng đèn cồn Không đốt đèn cồn không sử dụng Thao tác cẩn thận tránh làm bỏng tay gây hỏa hạn Tất vật liệu bị nhiễm bẩn cần phải khử trùng trước vứt bỏ sử dụng lại Các vật liệu cần khử trùng phải đặt nơi quy định 10 Khi kết thúc thí nghiệm, cần phải vệ sinh thiết bị, dụng cụ sử dụng theo quy trình phải xếp chúng vào nơi quy định 11 Sau lần thí nghiệm, phải rửa tay trước rời phịng thí nghiệm 12 Trong trường hợp có tai nạn hay bị thương, báo cho cán phịng thí nghiệm để chữa chạy kịp thời BÀI CÁCH SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI Các loại kính hiển vi sử dụng nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật đặc điểm hình thái, sinh lý nhờ vào khả phóng đại chúng Việc lựa chọn loại kính hiển vi để nghiên cứu phụ thuộc vào mục đích cụ thể nghiên cứu Tuy vậy, kính hiển vi quang học sáng loại kính sử dụng phổ biến dễ sử dụng phịng thí nghiệm vi sinh Cấu tạo 1.1 Bộ phận học - Giá kính: chỗ dựa chủ yếu cho nhiều phận khác bàn kính, ống kính trục mang ống kính - Bàn kính chuyển động theo mặt phẳng ngang nhờ ốc vặn di chuyển bàn kính, nhờ di chuyển vị trí tiêu vào thị trường Trên bàn kính có kẹp giữ tiêu Dưới bàn kính có giá giữ tụ quang - Ống kính: ống trịn (kính mắt) hay hai ống trịn (kính hai mắt) di động theo hướng điều chỉnh người sử dụng Ống kính có khả di chuyển lên, xuống nhờ ốc điều chỉnh theo hai chiều ngược nhau: Ốc chỉnh thô (di chuyển nhanh) chỉnh để tìm ảnh vật; ốc chỉnh tinh (di chuyển chậm) chỉnh để có ảnh rõ nét 1.2 Bộ phận quang học Gồm có vật kính, thị kính, kính tụ quang gương phản chiếu Trong đó, vật kính phần quan trọng - Vật kính: tạo ảnh thực phóng đại ngược chiều với vật quan sát Kính hiển vi thơng thường có vật kính: x4, x10, x40 x100 Vật kính x100 vật kính dầu Khi quan sát vật mẫu nhuộm màu với vật kính x100 cần nhúng chìm vào dầu soi sử dụng cho vật kính hiển vi (có độ chiết quang tương đương với độ chiết quang thủy tinh, ánh sáng qua không bị khúc xạ mà chiếu thẳng vào vật kính) - Thị kính: thị kính lắp vào phía ống kính Thị kính kính hiển vi thường sử dụng thị kính hai mắt - Kính tụ quang: nằm bàn kính, di chuyển nhờ ốc điều chỉnh có tác dụng tập trung ánh sáng Bên kính tụ quang hệ thống chắn sáng cho phép điều chỉnh lượng ánh sáng chiếu vào - Gương phản chiếu: phận lắp kính tụ quang, giúp hướng chùm tia sáng vào kính tụ quang, quay để thu nhận ánh sáng Ánh sáng truyền từ đáy thân kính, xuyên qua mẫu vào vật kính Ánh sáng điều chỉnh cách nâng hạ tụ quang, đóng mở chắn sáng, tăng hay giảm ánh sáng đèn Lƣu ý: - Cẩn thận nâng, hạ kính kính mẫu vật dễ bị vỡ - Vật kính dầu sau sử dụng xong cần phải chùi loại giấy lau dành riêng cho Đặc biệt khơng dùng cồn giấy vệ sinh chùi vào vật kính Cách sử dụng Trước hết phải chuẩn bị tiêu có vi sinh vật, sau cần phải điều chỉnh nguồn ánh sáng điều chỉnh vật kính Điều chỉnh nguồn ánh sáng - Đưa vật kính vào vị trí nhận nguồn sáng - Cắm điện bật công tắc đèn, dùng ánh sáng đèn - Mắt nhìn vào thị kính đồng thời sử dụng tay phải điều chỉnh gương phản chiếu để tập trung nguồn sáng vào tâm điểm thị trường quan sát Điều chỉnh cho lượng sáng vào đạt tối đa Điều chỉnh vật kính kính tụ quang - Chuẩn bị tiêu chứa mẫu vật đặt vào bàn kính, cố định kẹp tiêu - Điều chỉnh kính tụ quang tay trái: nâng kính lên mức hợp lý, tránh làm vỡ tiêu - Mở hệ thống chắn sáng tối đa điều chỉnh để có ảnh rõ nét - Nhìn vào thị kính, điều chỉnh tiêu để chọn vùng cần quan sát - Di chuyển vật kính xuống gần tiêu với khoảng cách hợp lý để có ảnh rõ, tránh làm vỡ tiêu - Nhìn vào thị kính, thận trọng điều chỉnh ốc chỉnh thô, ốc chỉnh tinh thấy ảnh đẹp - Khi quan sát, điều chỉnh vị trí tiêu để quan sát phần mẫu vật theo ý muốn - Nếu sử dụng vật kính dầu (x100), cần phải nhỏ giọt dầu lên vị trí cần quan sát tiêu Sau hạ từ từ vật kính vật kính nhúng vào dầu, cẩn thận để khơng làm vỡ tiêu Điều chỉnh ốc chỉnh thô chỉnh tinh để có ảnh rõ nét Hình 1: Cấu tạo kính hiển vi quang học Bảo quản kính Khi sử dụng xong - Nâng vật kính lên cao, lấy tiêu - Nếu sử dụng vật kính dầu phải sử dụng khăn giấy lau dành riêng cho vật kính dầu lau thật (chú ý lau nhẹ, tránh làm xước vật kính) - Xoay đứng gương phản chiếu, hạ tụ quang xuống - Cho kính vào hộp vào tủ kính - Để tiêu vào nơi quy định Bảo quản kính hiển vi - Phải giữ kính hiển vi thật nơi khô để tránh nấm sợi phát triển bụi bám vào - Trong thời gian không sử dụng, lấy thị kính đậy nắp ống kính lại Để nguyên vật kính - Khi di chuyển kính hiển vi, phải thao tác nhẹ nhàng,cẩn thận Một tay cầm thân kính, tay giữ đế kính Chỉ nên di chuyển kính hiển vi thấy cần thiết BÀI CÁC KỸ THUẬT KHỬ TRÙNG, TIỆT TRÙNG Khái niệm khử trùng, tiệt trùng Cách thông thường để lan truyền vi khuẩn vi trùng bệnh viện gián tiếp qua vật dụng thứ ba dụng cụ bị nhiễm khuẩn, đồ dùng sử dụng cơng cộng khăn lau, xà phịng, bơ, thuốc pha chế khơng tiệt trùng tốt Vì vậy, cách tốt phải khử trùng tất loại thuốc pha chế, dụng cụ dùng phẫu thuật điều trị bệnh nhân Khử trùng: làm giảm, tiêu diệt vi khuẩn để ngăn chặn lan truyền, nha bào phương pháp tác dụng Tiệt trùng: tiêu diệt tất sinh vật sống có hại, kể nha bào Nguyên tắc Sau khử trùng cần đảm bảo: - Sự vô trùng tuyệt đối cho vật phẩm dụng cụ - Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật - Đảm bảo an toàn tuyệt đối cho người Kỹ thuật khử trùng Ý nghĩa vô trùng thực hành vi sinh vật: - Đem lại kết chẩn đốn xác - Tránh lây nhiễm cho người tiếp xúc môi trường xung quanh Để đảm bảo vô trùng, yêu cầu người làm kỹ thuật phải thực thao tác kỹ thuật sau: a) Sử dụng que cấy - Cầm que cấy cầm bút, “mềm” cổ tay để dễ làm thao tác - Khử trùng dây cấy kim loại lửa đèn cồn: vừa đốt vừa xoay que cấy Phải khử trùng dây cấy trước sau lấy bệnh phẩm b) Sử dụng ống nghiệm - Cách cầm ống nghiệm: có cách + Cầm ngón tay 1, 2, Thân ống nghiệm lót ngón tay Đáy ống nghiệm đặt lịng bàn tay + Cầm ngón tay Thân ống nghiệm kẹp ngón tay Thường dùng tay trái cầm ống nghiệm, tay phải cầm que cấy - Mở nút ống nghiệm: dùng mô út bàn tay cầm que cấy mở nút ống nghiệm Tay cầm ống nghiệm xoay kéo ống nghiệm khỏi nút - Đóng nút ống nghiệm: làm mở nút đẩy ống nghiệm vào nút theo hướng ngược lại mở nút - Khử trùng ống nghiệm: + Sau mở nút ống nghiệm, phải hơ nóng miệng ống nghiệm lửa đèn cồn trước lấy bệnh phẩm (vừa hơ vừa xoay tròn miệng ống nghiệm) + Phải khử trùng lại trước đậy nút ống nghiệm c) Sử dụng hộp Petri (hộp lồng) - Cách cầm hộp Petri: có cách + Dùng bàn tay đỡ đáy hộp dùng ngón cố định lên bờ nắp hộp + Dùng ngón tay 3, 4, đỡ đáy hộp, hai ngón vịng theo chu vi nắp hộp - Mở đóng nắp hộp Petri: dùng ngón để mở đóng nắp hộp Chú ý: mở tồn nắp hộp, thường mở phần để hạn chế vi khuẩn từ không khí rơi vào hộp Petri d) Sử dụng ống hút Có loại ống hút: ống hút khắc độ ống hút Pasteur o - Các ống hút có nút bơng đầu, bọc giấy khử khuẩn 170 C/ 30 phút trước sử dụng Khi dùng, ống hút khử khuẩn lại - Dùng bóp cao su để hút dịch - Cắm ống hút dùng vào bình chứa dung dịch khử trùng Các phƣơng pháp khử trùng, tiệt trùng 4.1 Phương pháp dùng hóa chất Đặc điểm phương pháp dung dịch khử trùng công vào tế bào vi sinh vật sống để tiêu diệt chúng Vì vậy, điều quan trọng nồng độ thuốc khử trùng thời gian ngâm phải không khơng có hiệu Để khử trùng có hiệu quả, thuốc sử dụng trộn phải: - Tiêu diệt ngăn chặn phát triển vi sinh vật có hại - Khơng có hại cho dụng cụ, khơng khử hoạt tính chất hữu cần khử trùng - Pha nồng độ Các dung dịch khử trùng thông dụng + Iod cồn 70%: Sử dụng sát trùng da trước mổ, trước tiêm làm thủ thuật + Cloramin: - Cloramin 5% khử trùng phòng dụng cụ - Cloramin 0,5% khử trùng da + Phenol: - Phenol 1% khử trùng phòng trang thiết bị - Phenol 2% để khử trùng dụng cụ Phenol gây ăn mịn kim loại, khơng dùng cho vật thể sống dụng cụ làm cao su Tất dụng cụ ngâm dung dịch khử trùng phải ngâm ngập nước giờ, dụng cụ có nịng phải tháo rời, có khóa phải để mở Sau giờ, cọ dụng cụ rửa nước máy luộc sôi phút, để dụng cụ chỗ cho khơ sau dụng cụ cần tiệt trùng phải đưa tiệt trùng Loại hóa chất có tác dụng tiệt trùng có hiệu dùng Cidex: - CX145 : Can lít dung dịch dùng 14 ngày - CX281 : Can lít dung dịch dùng 28 ngày - CX285 : Can lít dung dịch dùng 28 ngày Cho Cidex vào ngâm ngập dụng cụ rửa 10 để tiêu diệt loại nha bào gây bệnh bao gồm nha bào uốn ván trực khuẩn uốn ván Sau ngâm đủ thời gian lấy dụng cụ kỹ thuật vô khuẩn rửa lại nước vô trùng Các dụng cụ cần tiệt trùng tiếp xúc hoàn toàn với hóa chất dạng dung dịch khơng đảm bảo nồng độ thích hợp thời gian cần thiết tác dụng tiệt trùng hiệu Một số hóa chất lại có hại cho dụng cụ, làm rát da, phải đeo găng tay sử dụng Sử dụng hóa chất để tiệt trùng tốn hiệu không cao 4.2 Phƣơng pháp vật lý 4.2.1 Tiệt trùng nhiệt khơ a) Tiệt trùng Lị Pasteur hay tủ sấy Nhiệt khô tiệt trùng làm khô vi trùng oxy hóa cấu tử chúng Nhiệt khô dùng để khử trùng dụng cụ kim loại hay thủy tinh: ống nghiệm, hộp lồng, ống hút bột khô Sự tiệt trùng nhiệt khô thực tủ sấy, tủ kín kim o loại, đốt nóng chất khí hay điện trở Nhiệt độ lị lên đến 180 C khí nóng phải quạt lò để tránh sai biệt nhiệt độ Cách tiến hành: - Các dụng cụ phải làm khơ gói giấy để đảm bảo tính vơ trùng sau sấy, xếp vào tủ sấy - Đậy nắp tủ lại, bật công tắc để tủ hoạt động Xoay núm để điều chỉnh nhiệt độ thời o o gian tới số mong muốn (180 C 30 phút hay 160 C giờ) - Nhiệt độ thời gian mong muốn trì nhờ phận điều khiển tự động o - Tắt lò, để nguội 60 C mở cửa tủ khơng làm nứt vỡ dụng cụ làm ảnh hưởng đến tính vơ trùng dụng cụ - Các dụng cụ sau sấy mà giấy bao có màu vàng đạt yêu cầu Lƣu ý: Vì nhiệt độ cao, nên phương pháp áp dụng cho vật chịu o nhiệt độ 180 C b) Tiệt trùng cách đốt qua lửa nung đỏ Phương pháp dùng để khử trùng pipet, que cấy, đầu ống nghiệm, miệng bình tam giác sau lấy nút Cách tiến hành: - Hơ dụng cụ lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại - lần Dây cấy phải nung thật đỏ hết chiều dài phần dây cấy - Đợi cho dụng cụ nguội dùng để tránh vỡ dụng cụ vi sinh vật không bị tiêu diệt lấy giống o - Cũng nhúng dụng cụ vào cồn 90 đốt nhiều lần để khử trùng 4.2.2 Tiệt trùng nhiệt ẩm a) Đun sôi nƣớc Phương pháp dùng cần khử trùng nhanh dụng cụ: kim tiêm, kéo, kẹp, dao, cốc thủy tinh, chai lọ,… Cách tiến hành: - Dùng nước máy đổ ngập dụng cụ - Đun sôi từ 30 phút đến Phương pháp có tác dụng diệt tế bào sinh dưỡng không diệt nha bào vi sinh vật Để khắc phục hạn chế này, người ta pha thêm vào nước acid phenic 5% b) Đun cách thủy nhiệt độ thấp (phƣơng pháp khử trùng Pasteur) Phương pháp dùng để khử trùng thực phẩm dễ biến tính nhiệt độ cao sữa, bia, rượu,… Cách tiến hành: o o Đun nóng mơi trường lên 60-75 C 15-30 phút đun nóng lên 80 C 1015 phút Phương pháp có khả ức chế vi khuẩn không sinh nha bào o c) Hấp gián đoạn 100 C (phƣơng pháp Tyndal) Phương pháp dùng để khử trùng số loại môi trường nuôi cấy men bánh mì, men gia súc, mốc làm nước chấm… vi sinh vật tạo nha bào khác Cách tiến hành o - Hấp môi trường 100 C từ 30-40 phút - Lấy để tủ ấm 24 cho nha bào vi sinh vật nẩy mầm o - Hấp môi trường lần thứ 100 C 30-40 phút để tiêu diệt nha bào vừa nảy mầm - Lặp lại trình từ - lần - Kết quả: môi trường vừa vô trùng, vừa đảm bảo không bị biến đổi d) Khử trùng nƣớc bão hòa áp suất cao Phương pháp thực nồi hấp tiệt trùng áp suất cao Đó thiết bị làm kim loại, chịu nhiệt độ áp suất cao, có khả tự động điều chỉnh áp suất thời gian tiệt trùng theo yêu cầu người sử dụng Nguyên tắc Làm gia tăng nhiệt độ để khử trùng vật nước bão hịa áp suất lớn áp suất bình thường khí Khi áp suất nước tăng nhiệt độ nồi tăng theo nhờ hệ thống van chặt chẽ Hình 2: Nồi hấp tiệt trùng áp suất cao Cách sử dụng - Chuẩn bị dụng cụ chứa mơi trường (ống nghiệm, bình tam giác bao gói phần nút bơng để tránh làm ướt nút bông) c) Cách lấy bệnh phẩm - Viêm tai o Nếu chưa bể mủ, sát trùng da cồn 70 , chờ khơ, sau chọc hút hay rạch lấy mủ cho vào tube vô trùng Nếu bể mủ, lau mủ dùng tăm vô trùng ép nặn mủ thấm vào tăm bông, cho vào môi trường chuyên chở Stuart-Amies gửi đến phịng thí nghiệm Các mẫu mủ lấy khơng có mơi trường chun chở phải gửi đến phịng thí nghiệm yêu cầu cấy - Viêm tai Nếu cấp tính chưa bể mủ, bác sĩ chuyên khoa lấy qua chọc hút xuyên màng nhĩ cho vào tube vô trùng Nếu bể mủ hay chảy mủ kinh niên, lau mủ vùng tai dùng tăm vô trùng thấm mủ vào tăm cho vào mơi trường chun chở StuartAmies gửi đến phịng thí nghiệm Các mẫu mủ lấy khơng có mơi trường chun chở phải gửi đến phịng thí nghiệm u cầu cấy - Viêm xoang Nếu cấp tính lấy quệt mũi hầu Bác sĩ chuyên khoa dùng kẹp nong mũi bệnh nhân lấy quệt mũi hầu tăm nhỏ, cọng mềm, luồn từ lỗ mũi qua vách mũi trước mũi sau, đưa sâu vào cản lại hầu Quệt mũi, hầu cho vào tube vô trùng hay môi trường chuyên chở Stuart-Amies gửi đến phịng thí nghiệm Nếu kinh niên, lấy mẫu thử mẫu sinh thiết hay dịch rửa xoang nước muối sinh lý khơng có chất sát trùng Mãnh sinh thiết hay dịch rửa cho vào lọ vô trùng hay tube vơ trùng gửi đến phịng thí nghiệm - Viêm mũi Bác sĩ chuyên khoa lấy quệt mũi sau, vùng viêm (như lấy quệt mũi hầu trên) gửi đến phịng thí nghiệm Quệt mũi trước lấy để khảo sát tình trạng mang vi khuẩn S pneumoniae, H influenzae bệnh nhân trẻ em bị nhiễm trùng hơ hấp cấp Ngồi ra, quệt mũi trước cịn lấy để điều tra tình trạng người lành mang S aureus - Viêm kết mạc Bệnh phẩm quệt mủ kết mạc mắt bác sĩ chuyên khoa lấy kỹ thuật vô trùng, gửi đến phịng thí nghiệm 2.8 Đàm, dịch hút đàm khí quản qua mũi, dịch hút rửa phế quản qua nội soi a) Chỉ định Các trường hợp viêm nhiễm đường hô hấp như: viêm phổi, viêm phế quản cấp, cấp viêm phế quản mạn Nên cho định lấy mẫu trường hợp bệnh nhân có triệu chứng sau: ho có máu hay ho nhiều, đau ngực, khó thở, có dấu hiệu đặc phổi có râle ẩm rít, giảm tiếng rì rào phế nang, gõ đục khám phổi, phim phổi có thâm nhiễm, có nang, có mủ b) Thời điểm lấy mẫu Càng sớm tốt Nên lấy trước bệnh nhân dùng kháng sinh hệ thống c) Cách lấy mẫu - Đàm + Trước hết cho bệnh nhân súc miệng sạch, không súc miệng nước súc miệng có chất sát trùng + Hướng dẫn bệnh nhân hít thật sâu cố khạc đàm Có thể giúp bệnh nhân khạc đàm cách vỗ nhẹ vào lưng Bệnh nhân khạc đàm vào lọ vô trùng, rộng miệng, nắp chặt, tránh lẫn nước bọt - Dịch hút đàm khí quản qua đường mũi + Trường hợp bệnh nhân khạc đàm trẻ em + Dùng dụng cụ đặc biệt gọi hút khí quản, ống nghiệm gắn với nắp vặn có vịi, nối với ống thông mềm, nối với máy bơm chân không hoạt động vịi có van hông mở Trước hết thân nhân bệnh nhi ẵm ngửa bé vào lòng, giữ đầu ngửa sau Đưa ống thông qua mũi bệnh nhi đầu ống chạm vào phần khí quản, lúc bệnh nhi có phản xạ ho Ngay lúc bệnh nhi ho, dùng tay bịt chặt van hông lại, nhờ đàm hút vào ống thơng Sau rút ống thông khỏi mũi bệnh nhi, cho đầu ống thông vào lọ chứa 5ml nước muối sinh lý vơ trùng Nước muối sinh lý rửa đàm dính thành ống thông vào ống nghiệm Tắt máy bơm, tháo nắp có vịi khỏi ống nghiệm đạy chặt ống nghiệm nắp đậy khác có dụng cụ Gửi mẫu đến phịng thí nghiệm + Nếu khơng có dụng cụ này, dùng ống chích 60ml, nối đầu với ống thơng mềm để lấy đàm theo cách trên, thay dùng bơm chân khơng, hút đàm tay với ống chích - Dịch hút phế quản qua nội soi Do bác sĩ chuyên khoa lấy nội soi, cho vào tube nắp chặt vô trùng gửi đến phịng thí nghiệm 2.9 Đƣờng sinh dục a) Chỉ định Khi nghi ngờ nhiễm trùng bệnh lây truyền đường sinh dục (đàn ông, đàn bà) hay bị huyết trắng nghi nhiễm trùng (đàn bà) b) Thời điểm Càng sớm tốt, giai đoạn đầu bệnh Trước dùng kháng sinh c) Cách lấy bệnh phẩm - Bệnh nhân nam o + Tụt da quy đầu sau, dùng cồn 70 lau da quy đầu chờ khô + Bệnh nhân vút nhẹ dương vật theo ống đái giọt mủ thấm giọt mủ lên que tăm vơ trùng, phần cịn lại quệt lên lame kính Que tăm cho vào môi trường chuyên chở Stuart-Amies, với lame kính, gửi đến phịng thí nghiệm để khảo sát sớm tốt + Nếu bệnh nhân không vút mủ, dùng que gịn mảnh luồn vào ống đái sâu - 4cm, vừa xoay nhẹ vừa rút ra, cho vào môi trường chuyên chở Stuart-Amies, gửi đến phịng thí nghiệm + Các loại bệnh phẩm khác lấy để khảo sát quệt hậu mơn, quệt họng, quệt mủ lấy nội soi trực tràng, đặc biệt người đồng tính luyến - Bệnh nhân nữ + Bệnh nhân nằm bàn khám phụ khoa, rửa phận sinh dục nước, thấm khơ, sau cho mỏ vịt vào Mỏ vịt vô trùng hấp ướt hay sấy khô khơng phải hóa chất 20 + Dùng tăm bơng quệt lấy huyết trắng thành sau âm đạo, cho vào mơi trường chun chở Stuart-Amies, gửi đến phịng thí nghiệm + Đối với người bị nghi nhiễm lậu, lấy bệnh phẩm từ lòng cổ tử cung cách dùng gịn vơ trùng lau huyết trắng dùng tăm bơng mảnh đưa vào lịng cổ tử cung, xoay nhẹ 10 giây trước rút Lấy mẫu que tăm bông, que quệt lên lame kính, que cịn lại cho vào mơi trường chun chở Stuart-Amies, gửi mẫu đến phịng thí nghiệm - Trẻ em + Có thể lấy mủ mắt nghi bị viêm mủ kết mạc mắt lậu + Cũng lây mủ từ âm đạo bé gái 23 BÀI PHƢƠNG PHÁP CẤY VI KHUẨN Muốn khảo sát vi khuẩn, cần phải tiến hành nuôi cấy để nhận định loại đặc tính sinh lý khác Định nghĩa Cấy chuyển vi khuẩn từ mơi trường chúng sống sang mơi trường để chúng tiếp tục phát triển điều kiện thuận lợi Phần lớn vi khuẩn sống mơi trường bình thường Một số địi hỏi mơi trường giàu chất dinh dưỡng, có chứa máu hay mảnh quan tươi Mục đích - Bảo tồn vi khuẩn ni khiết - Ly trích vi khuẩn có thiên nhiên, khơng khí, nước, mẫu đất, mẫu thực phẩm, mẫu bệnh lý - Nghiên cứu tính chất sinh học, cấy vào môi trường đặc biệt chứa đường sữa Dụng cụ a) Dây cấy: làm platin hay nickel chrome để tránh vấn đề bị rỉ sét đốt đỏ nhiệt độ cao lúc khử trùng - Dây cấy thẳng: Dùng đâm thẳng vào thạch sâu (thạch mềm) để kiểm tra tính di động Hay cấy vi khuẩn kỵ khí, ly trích khuẩn lạc vi khuẩn gần - Dây cấy vòng: dùng cấy lướt bề mặt thạch - Dây cấy dẹp có móc: để cấy nấm b) Ống hút (pipette) - Pipette Pasteur: Dùng cấy vi khuẩn từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng - Pipetman: Dùng để cấy thể tích định vi khuẩn c) Hộp Petri d) Ống nghiệm e) Các dụng cụ khác: bình cầu, bình tam giác Các kỹ thuật cấy khuẩn Hình 6: Kỹ thuật cấy ria mơi trường thạch đĩa Petri Hình 7: Một số cách cấy ria môi trường thạch đĩa Petri Hình 8: Kỹ thuật cấy đâm sâu (A) cấy ria ống thạch nghiêng (B) BÀI CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA - MIỄN DỊCH DÙNG TRONG CHẨN ĐỐN VI SINH VẬT Q trình phân lập định danh vi khuẩn bệnh phẩm thường thực qua bước: - Khảo sát hình thái tính chất bắt màu vi khuẩn kính hiển vi - Khảo sát tính chất phát triển vi khuẩn môi trường nuôi cấy - Xác định tính chất sinh hóa - Xác định tính chất kháng nguyên ngưng kết với kháng huyết mẫu Trong khảo sát tính chất sinh hóa vi khuẩn khảo sát chuyển hóa vi khuẩn Mỗi loại vi khuẩn khác có nhu cầu sử dụng chất khác nhau, sử dụng chất chúng tạo nên sản phẩm chuyển hóa khác Thử nghiệm tính chất sinh hóa vi khuẩn khảo sát sản phẩm chuyển hóa chúng, sản phẩm chuyển hóa nhận biết chất thị màu môi trường bị biến đổi thay đổi độ pH… Để dễ dàng ghi nhớ người ta xếp phản ứng sinh hóa vào nhóm lớn: I Các phản ứng sinh hóa Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có nitơ 1.1 Phản ứng Indol: Một số vi khuẩn E.coli có enzyme Tryptophanase chuyển tryptophan thành Indol o Nuôi cấy vi khuẩn nước pepton không chứa đường sau 18 - 24 ủ 37 C, nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Kovac’s (para dimethyl amino benzaldehyt rượu isoamyl HCl), màu đỏ xuất vòng phút cho biết phản ứng dương tính 1.2 Khả tạo thành H2S: Nhiều vi khuẩn sử dụng hợp chất có chứa S thiosulfat tạo thành H 2S H2S phản ứng với FeSO4 môi trường tạo thành FeS màu đen FeSO4 + H2 S → FeS↓ + H2SO4 Ở phòng xét nghiệm người ta thường khảo sát khả tạo thành H 2S môi trường KIA chứa FeSO4 Na2S2O3 1.3 Phản ứng phân giải urê: Vi khuẩn có enzyme urease làm phân giải urê tạo thành NH3 NH2 O = C + H2O → CO2 + NH3 NH2 NH3 kiềm hóa mơi trường đổi thị màu đỏ phenol thành màu đỏ cánh sen Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có carbon 2.1 Khả lên men đường: Trong trình phát triển, vi khuẩn lên men đường tạo thành acid làm đổi thị màu đỏ phenol từ màu đỏ sang màu vàng Người ta cấy vi khuẩn vào ống chứa pepton, cao thịt, 1% đường thị màu, phản ứng dương tính mơi trường chuyển sang màu vàng Trường hợp vi khuẩn có enzyme hydrogenlyase tạo thành phát ống Durham HCOOH → H2 + CO2 2.2 Phản ứng đỏ methyl (MR, Methyl Red): Những vi khuẩn E.coli có khả lên men glucose sinh hỗn hợp nhiều acid làm cho pH môi trường giảm đến ≤ 4,5, phát thị đỏ methyl, thị đổi màu đỏ lúc pH ≤ 4,5 Nuôi cấy vi khuẩn môi trường MR – VP, sau 24 thêm giọt đỏ methyl vào Phản ứng dương tính lúc mơi trường trở thành màu đỏ 2.3 Phản ứng Voges-Proskauer (VP): Những vi khuẩn Enterobacter aerogenes có khả lên men glucose, sản phẩm chuyển hóa ngồi acid cịn có acetoin, hợp chất bị khử oxy tạo thành diactyl, chất tham gia vào phản ứng tạo màu với thuốc thử VP Nuôi cấy vi khuẩn môi trường MR - VP, sau 24 thêm vài giọt thuốc thử Để phịng thí nghiệm 30 phút, khơng đậy nắp ống nghiệm, phản ứng dương tính làm xuất màu đỏ 2.4 Khả sử dụng Citrate: Khác với E.coli Các loài Klebsiella Enterobacter sử dụng Citrate nguồn carbon Cấy vi khuẩn cách ria bề mặt ống thạch nghiêng Citrate Simmons chứa thị màu xanh bromothymol Sau 24 vi khuẩn sử dụng Citrate để phát triển làm kiềm hóa mơi trường Phản ứng dương tính cho thấy mơi trường chuyển từ màu lục sang màu xanh dương Những phản ứng liên hệ đến enzyme Thử nghiệm enzyme cho phép phân biệt nhóm vi khuẩn khác Những thử nghiệm enzyme thường thực bao gồm thử nghiệm sau: 3.1 Thử nghiệm catalase: số vi khuẩn có khả sinh catalase enzyme thủy phân H2O2 làm xuất oxy catalase H2 O2 H2O + ½O2 Phản ứng ứng dụng để phân biệt tụ cầu liên cầu nhận biết vi khuẩn khác 3.2 Thử nghiệm coagulase: coagulase enzyme số lồi vi khuẩn tiết làm đông huyết tương người thỏ Thử nghiệm coagulase ứng dụng để xác định tụ cầu gây bệnh 3.3 Thử nghiệm Oxydase: số vi khuẩn có enzyme Oxydase Trong khơng khí enzyme phản ứng với thuốc thử p - phenyenendieamine để tạo thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương (hoặc tím) Thử nghiệm sử dụng để nhận biết lậu cầu, cầu khuẩn màng não, phẩy khuẩn tả… II Phản ứng miễn dịch Phản ứng miễn dịch học kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Xét nghiệm Viêm gan B (HbsAg) o - Test bảo quản nhiệt độ 20 - 30 C - Mang găng tay bảo vệ rửa tay kỹ sau xét nghiệm - Phải dùng thuốc sát trùng lau mẫu bị đổ dính bàn để phịng tránh lây nhiễm - Test dụng cụ phải hủy bỏ theo tiêu chuẩn rác Bệnh Viện sau sử dụng - Không dùng Test hư hỏng hạn sử dụng Xét nghiệm NGAY sau xé bao đựng Test Hình 9: Kit chẩn đốn nhanh viêm gan B (HbsAg) Qui trình xét nghiệm Mẫu xét nghiệm  Mẫu xét nghiệm phải dùng huyết tương huyết o  Nếu chưa dùng ngay, mẫu trữ lạnh ngày nhiệt độ từ - C o  Trước sử dụng phải để mẫu ấm lên khoảng 20 - 30 C Quy trình: - Dùng máy ly tâm 3.000 RPM lấy huyết tương – huyết - Nếu khơng có máy ly tâm, nhỏ - ml máu vào ống nghiệm (1), chờ 20 phút máu đông, huyết tương - huyết lên - Lấy 60µl Huyết tương - Huyết cho vào ống nghiệm (2) - Xé bao, lấy Test đặt thẳng đứng vào ống nghiệm (2), dung dịch huyết tương - huyết không ngập vạch mũi tên - Chờ Test vừa ngấm đều, lấy đặt bàn phẳng sạch, khô - Đọc kết vòng 05-25 phút GHI CHÚ QUAN TRỌNG - Sau 25 phút, kết khơng xác - Vạch kết (T) lên đậm mờ theo nồng độ kháng nguyên người xác định dương tính - Âm tính xác định sau 20 phút Hình 10: Qui trình thực cách đọc kết chẩn đoán nhanh viêm gan B (HbsAg) Xét nghiệm HIV o - Test bảo quản nhiệt độ 20-30 C - Mang găng tay bảo vệ rửa tay kỹ sau xét nghiệm - Phải dùng thuốc sát trùng lau mẫu bị đổ dính bàn để phịng tránh lây nhiễm - Test dụng cụ phải hủy bỏ theo tiêu chuẩn rác Bệnh Viện sau sử dụng - Không dùng Test hư hỏng hạn sử dụng - Xét nghiệm NGAT sau xé bao đựng Test Hình 11: Kit chẩn đốn nhanh HIV Qui trình xét nghiệm Mẫu xét nghiệm  Mẫu xét nghiệm phải dùng huyết tương huyết o  Nếu chưa dùng ngay, mẫu trữ lạnh ngày nhiệt độ từ 2-8 C o  Trước sử dụng phải để mẫu ấm lên khoảng 20-30 C Quy trình: Dùng máy ly tâm 3.000 RPM lấy huyết tương – huyết Nếu khơng có máy ly tâm, nhỏ 3-4 ml máu vào ống nghiệm (1), chờ 20 phút máu đông, huyết tương - huyết lên Xé bao, đặt Test thử lên bàn phẳng sạch, khô Dùng pipette nhỏ 02 - 03 giọt (khoảng 60µl) huyết tương - huyết vào ô chữ (S) Nhỏ dung dịch pha lỗng Đọc kết vịng 05 - 25 phút sau nhỏ mẫu GHI CHÚ QUAN TRỌNG - Sau 25 phút, kết khơng xác - Vạch kết (T) lên đậm mờ theo nồng độ kháng thể người xác định dương tính Hình 12: Quy trình thực cách đọc kết chẩn đốn nhanh HIV BÀI KHÁNG SINH ĐỒ PHƢƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN KHÁNG SINH TRONG THẠCH Thử nghiệm kháng sinh đồ định thực vi khuẩn gây tiến trình nhiễm trùng nhằm đảm bảo kháng sinh trị liệu đốn trước cách xác độ nhạy cảm vi khuẩn kháng sinh dựa vào định danh vi khuẩn Thử nghiệm kháng sinh đồ thường thực tác nhân vi khuẩn coi thuộc lồi có khả đề kháng kháng sinh thơng dụng (ví dụ, vi khuẩn sản xuất men bất hoạt kháng sinh hay làm thay đổi hấp thu kháng sinh) Có số vi khuẩn mà người ta đốn trước độ nhạy cảm với kháng sinh dùng kháng sinh điều trị theo kinh nghiệm Không cần thiết làm kháng sinh đồ nhiễm trùng gây vi khuẩn biết luôn nhạy cảm với số kháng sinh điều trị (vi khuẩn Streptococcus pyogenes, Nesseria meningitidis luôn nhạy cảm với kháng sinh penicillin) Kháng sinh đồ quan trọng nghiên cứu dịch tễ học kháng thuốc nghiên cứu kháng sinh Kháng sinh Các đĩa kháng sinh đóng gói đảm bảo điều kiện không hút ẩm Các đĩa kháng sinh nên lưu trữ sau: o o - Các lọ chứa đĩa kháng sinh giữ C hay giữ đông - 14 C dùng - Nên lấy lọ chứa đĩa kháng sinh đóng kín khỏi tủ lạnh khoảng 30 phút để nhiệt độ phịng thí nghiệm trước mở nắp Động tác nhằm tránh giọt nước đọng lại đĩa khí ẩm bên ngồi tiếp xúc với nhiệt độ lạnh đĩa - Chỉ sử dụng đĩa hạn sử dụng, loại bỏ đĩa kháng sinh hạn Quy trình thực khuếch tán 2.1 Pha huyền dịch vi khuẩn Trên mặt thạch phân lập, chọn từ ba đến năm khuẩn lạc giống tách rời Dùng que cấy chạm vòng cấy chạm vào đầu khúm vi khuẩn cấy chuyển vào - ml dung dịch nước muối sinh lý 9‰ Điều chỉnh độ đục dịch cấy khuẩn tương đương độ đục chuẩn 0.5 McFarland Huyền dịch vi khuẩn có chứa khoảng đến x 10 CFU/ml (CFU: Colony Forming Unit, đơn vị hình thành khuẩn lạc: vi khuẩn sống) 2.2 Trải vi khuẩn lên mặt thạch Trong vòng 15 phút sau pha huyền dịch vi khuẩn, dùng que gòn vô trùng nhúng vào huyền dịch, ép xoay nhẹ que gòn thành ống nghiệm Động tác loại bỏ lượng huyền dịch vi khuẩn thừa khỏi que gòn Trải đầy vi khuẩn từ que gòn lên mặt thạch Mueller - Hinton hong khô bề mặt trước o Trải cách vạch que gịn lên mặt thạch, xong lại xoay mặt thạch 60 cấy vạch lần nữa, tiếp để đảm bảo trải đầy vi khuẩn lên mặt thạch Để hộp thạch trải vi khuẩn vòng đến phút (không 15 phút) khô mặt trước đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch 2.3 Đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch trải vi khuẩn Xác định đĩa kháng sinh nên đặt lên mặt thạch Khi đặt, phải ép nhẹ đĩa để đảm bảo chúng tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch Đặt đĩa kháng sinh phải đảm bảo tâm đĩa kháng sinh không gần 24 mm Thường với hộp thạch đường kính 150 mm, khơng đặt 12 đĩa hay đĩa với hộp thạch đường kính 90mm Kháng sinh khuếch tán sau đĩa kháng sinh chạm mặt thạch, khơng nên dời chỗ đĩa kháng sinh đặt lên mặt thạch Trong vòng 15 phút sau đặt đĩa kháng, phải ủ sấp hộp thạch (đáy nắp dưới) o tủ ủ 35 C Hình 13: Quy trình thực kỹ thuật kháng sinh đồ (Khuếch tán kháng sinh thạch) 2.4 Đọc biện luận kết Sau ủ 16 đến 18 giờ, đọc kết hộp thạch Nếu mặt thạch trải vi khuẩn cách, dịch cấy khuẩn độ đục, vi khuẩn mọc thành khúm mịn tiếp xúc nhau, vịng vơ khuẩn vịng tròn đồng Nếu vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc riêng lẻ có nghĩa huyền phù vi khuẩn q lỗng, phải làm lại thí nghiệm Đo đường kính vịng vơ khuẩn vịng, kể đường kính đĩa kháng sinh, hồn tồn khơng có vi khuẩn mọc thấy mắt thường Đo đường kính vịng vô khuẩn thành mi-li-mét với thước compa trượt hay thước kẻ, cách áp thước lên mặt sau đáy hộp thạch Chu vi vịng vơ khuẩn vùng mà mắt thường thấy vi khuẩn mọc Biện luận đường kính vịng vơ khuẩn dựa theo bảng đánh giá theo tiêu chuẩn, ghi nhận kết vi khuẩn nhạy hay trung gian hay đề kháng kháng sinh thử nghiệm Sai lệch kết thử nghiệm kháng sinh đồ 30 Có thể có sai lầm sau làm sai lệch kết thử nghiệm kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán: - Đọc sai đo đường kính vịng vơ khuẩn - Ngoại nhiễm vi khuẩn khác huyền dịch vi khuẩn kiểm tra - Huyền dịch vi khuẩn đậm nhạt - Không lắc độ đục chuẩn 0.5 McFarland hay độ đục chuẩn bị hỏng - Nhiệt độ hay khí trường ủ không - Môi trường kháng sinh đồ không đạt chuẩn (nên kiểm tra lô môi trường trước sử dụng) - Mất hàm lượng kháng sinh đĩa trình dùng bảo quản phịng thí nghiệm 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Étienne lévy-lambert, 1978, Techniques de base pour le laboratoire médical - Kỹ thuật phòng xét nghiệm, người dịch: Nguyễn Viết Thọ - Nguyễn Xuân Thiều, NXB Y học 2.Lê Duy Linh, Trần Thị Hường, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng, 2001, Thực tập Vi sinh sở, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 3.Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2006, Thí nghiệm Vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 4.Phạm Hùng Vân, 2002, Cẩm nang kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng, Bộ Y tế, Trường Đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh 5.Tài liệu thực tập Vi sinh vật học, 2010, Đại học Huế, Trường Đại học Y dược, Bộ môn Vi sinh vật 6.Trần Linh Thước, 2006, Phương pháp phân tích Vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo dục .. .Thực hành Vi sinh học Thực hành Vi sinh học NỘI QUY PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC Vi sinh vật thể sống có kích thước vơ nhỏ bé mà mắt thường khơng thể nhìn th? ?y Bên cạnh vi sinh vật... l? ?y thị kính đ? ?y nắp ống kính lại Để nguyên vật kính - Khi di chuyển kính hiển vi, phải thao tác nhẹ nhàng,cẩn thận Một tay cầm thân kính, tay giữ đế kính Chỉ nên di chuyển kính hiển vi th? ?y. .. a) Sử dụng que c? ?y - Cầm que c? ?y cầm bút, “mềm” cổ tay để dễ làm thao tác - Khử trùng d? ?y c? ?y kim loại lửa đèn cồn: vừa đốt vừa xoay que c? ?y Phải khử trùng d? ?y c? ?y trước sau l? ?y bệnh phẩm b) Sử