THỰC HÀNH hóa SINH học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM - o0o - THỰC HÀNH HÓA SINH HỌC LƯU HÀNH NỘI BỘ GVHD: SVTH: MSSV: Lớp: Nhóm – Tổ: Thành phố Hồ Chí Minh, 2020 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH Để đảm bảo hiệu an toàn làm việc phịng thí nghiệm sinh viên phải thực nghiêm túc quy tắc sau: I Nội dung phịng thí nghiệm Điều 1: Sinh viên có nhiệm vụ làm đầy đủ thí nghiệm theo chương trình qui định, phải chuẩn bị đầy đủ lý thuyết trước vào làm thực hành Điều 2: Phải đến phịng thí nghiệm qui định Khơng rời phịng thí nghiệm khơng phép giáo viên phụ trách Điều 3: Khi làm việc phải giữ trật tự, cấm ăn uống, hút thuốc phòng thí nghiệm Điều 4: Khi sử dụng Hóa chất dễ cháy, dễ nổ, dụng cụ dễ vở, đắt tiền phải tuyệt đối tuân thủ theo dẫn giáo viên Điều 5: Cần có ý thức tiết kiệm Hóa chất, tránh gây đổ vỡ dụng cụ Khi đổ vỡ dụng cụ phải báo với giáo viên bồi hoàn đầy đủ Điều 6: Khơng di chuyển Hóa chất khỏi chỗ qui định, khơng làm thí nghiệm ngồi bàn qui định Điều 7: Trước mở Hóa chất phải lau nắp cổ chai Điều 8: Dụng cụ dùng để lấy Hóa chất phải thật dùng xong phải rửa Không dùng lẫn dụng cụ lấy Hóa chất cho loại hóa chất khác Điều 9: Cẩn thận làm thí nghiệm, phải trung thực, khách quan báo cáo kết Điều 10: Giữ nơi làm việc, rửa dụng cụ lau chùi ngăn nắp nơi làm việc, bàn giao đầy đủ cho nhân viên phịng thí nghiệm trước Phân cơng trực nhật buổi thí nghiệm đẻ đôn đốc giữ vệ sinh trật tự Điều 11: Phải thực qui định phòng hỏa hoạn Điều 12: Khi phải tắt đèn, quạt, ngắt cầu dao điện kiểm tra vòi nước II Quy tắc làm việc với hóa chất độc, dễ nổ, dễ cháy Đa số chất hữu độc hại cần phải nắm vững quy tắc chống độc, chống nổ cháy làm việc với chất hữu Hóa chất phải chứa chai, lọ có nút đậy, dán nhãn Khi cầm chai Hóa chất khơng xách cố chai mà phải bê đáy chai Sử dụng chất KCN, NaCH, HCN, (CH3)2SO4, CH3NH2, Cl2, NO2… phải đeo mặt nạ, kính bảo hiểm phải làm tủ hút khơng tắt máy tủ cịn chất độc Trang Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Sử dụng Na, K… phải dùng bình kẹp sắt, lau khơ giấy lọc dùng rượu butylic hay amylic để hủy Na, K dư Brơm chứa bình dầy, màu tối có nút nhám, rót brơm phải tiến hành tủ hút, đeo kính bảo hiểm gang tay Mỗi lần lấy brơm khơng q 10mL, cho vào bình phản ứng phải dùng phễu nhỏ giọt thử độ kín Khi làm việc với H2SO4 đặc phải rót cẩn thận qua phễu tủ hút Pha loãng acid H2SO4 phải bình chịu nhiệt rót từ từ acid vào nước khuấy Bao đổ acid (bazơ) vào nước pha lỗng Khơng dùng miệng để hút acid (bazơ) Khơng hút pipette cịn hóa chất lọ Sử dụng chất dễ cháy bezen, enter, axeton, etylacetat, cacbondusunfua, ether dầu hỏa phải để xa lửa, khơng dun nóng trục tiếp lửa mà phải dùng bếp cách thủy III Sơ cứu phịng thí nghiệm Bỏng acid đặc phải rửa vết bỏng vòi nước lạnh từ – phút, dùng tẩm KMnO4 3% bôi nhẹ lên vết bỏng, dùng natricacbonat loãng (1%) rửa vết bỏng Bỏng kiềm đặc tiến hành thay nước dung dịch acid axêtic (acid acetic) 1% Khi bị Hóa chất bắn vào mắt phải rửa mắt dòng nước NaCl 1% chảy liên tục đưa đến bệnh viện Bỏng vật nóng (thủy tinh, kim loại) phải bơi dung dịch KMnO4 3% bôi mỡ chống bỏng Bỏng P bôi chỗ bỏng dung dịch CuSO4 2% Trường hợp uống phải acid phải súc miệng uống nước lạnh có MgO Trường hợp uống phải bazơ phải súc miệng uống nước lạnh có acid axêtic (acid axetic) 1% Ngộ độc khí Clo, brơm đưa chỗ thống khí lành Ngộ độc asen, thủy tinh, muối xianua… phải nhanh chóng đưa đến bệnh viện 10 Bị đứt tay phải lau máu, sát trùng cồn hay dung dịch KMnO4 3% cầm máu dung dịch FeCl3 băng lại 11 Khi bị cháy quần áo người với diện tích lớn tuyệt đối khơng chạy chỗ gió phải nằm xuống mà lăn để dập tắt lửa, diện tích cháy bé dùng nước, giẻ lau để dập tắt Trang Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm NỘI DUNG THỰC HÀNH Buổi BÀI THỰC HÀNH NỘI DUNG Dụng cụ thiết bị phịng thí nghiệm Hóa sinh Hóa chất- Cách chuẩn bị dung dịch hóa chất Phân tách nhận dạng casein Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl Xác định hoạt tính enzyme Protease thu nhận từ Dứa Định lượng đường khử phương pháp DNS Xác định hàm lượng lipid tổng số Xác định số chất béo Trang Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Bài DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ Các loại dụng cụ cách sử dụng Ống nghiệm (test tube): dụng cụ chứa làm loại thủy tinh khác nhau, thường có dạng hình trụ tích khác Ống nghiệm gồm: ống nghiệm thường, ống nghiệm chia độ ống nghiệm dùng để ly tâm… Hình: Ống nghiệm giá đỡ ống nghiệm Người ta dùng giá gỗ, chất dẻo kim loại để đặt ống nghiệm Ống nghiệm thường dùng để thực phản ứng phân tích với lượng hóa chất sử dụng ít, thường cho vào khoảng 1/4 hay 1/8 dung tích ống nghiệm Muốn cho chất rắn vào ống nghiệm, ta làm máng giấy (gập đôi băng giấy có chiều rộng bé đường kính ống nghiệm chút), cho chất rắn vào máng giấy Dùng tay trái cầm ống nghiệm để nằm ngang cho máng giấy vào ống nghiệm đến gần đáy, đặt ống nghiệm đứng lên, dùng tay đập nhẹ vào máng giấy Trường hợp đun nóng: Phải dùng kẹp để kẹp ống nghiệm, ta khơng đun nóng đáy ống nghiệm mà lửa phải để vào thành ống nghiệm Ống hút (pipette): dụng cụ hút chuyển dung dịch Kiểu thông thường ống thủy tinh dạng ống dài, có thang chia độ (pipette vạch), khơng có thang chia độ (pipette bầu) Có nhiều loại ống hút thơng dụng là: - Loại có vịng mờ đầu ống, dung tích ống gồm giọt cuối dính ống nên phải thổi giọt - Loại có bầu an tồn, dùng để hút dung dịch độc - Loại có hai vạch, thể tích ghi ống thể tích hai vạch - Loại thơng thường, có phân độ Trang Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Vị trí mắt nhìn sai Vị trí mắt nhìn Vị trí mắt nhìn sai (a) (b) (c) a Pipette thông thường (bulb pipette, volumetric pipette) b Pipette chia độ (graduated pipette) c Phương pháp đọc pipette Cách sử dụng pipette: -Tráng ống hút lượng nhỏ dung dịch cần hút - Sử dụng bóp cao su dụng cụ trợ pipette (stripettor) để hút dung dịch lên đến vạch ngang ứng với thể tích dung dịch muốn hút khoảng 2-3 cm - Lấy ngón tay trỏ bịt đầu ống hút lại (ngón trỏ phải khơ) Lau bên ngồi pipette khăn giấy thấm - Điều chỉnh cho vạch tầm mắt - Mang pipette sang bình chứa bên kia, đầu ống hút chạm nhẹ vào thành bình từ từ bng ngón trỏ để chất lỏng chảy tự vào bình Trang Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Hình Burette - Khi dung dịch ngưng không chảy nữa, xoay đầu pipette vài vịng vào thành bình, sau lấy pipette khỏi bình chứa Ống chuẩn độ (Burette): dạng ống dài, gắn giá, dùng để đo thể tích xác Cấu tạo có khóa để điều chỉnh lượng chất lỏng chảy ống có phân độ Cách sử dụng: - Kiểm tra xem khóa bơi Vaseline hay chưa Mục đích để trách rị rỉ nước q rít khơng vặn - Tráng lần với nước cất lần với dung dịch đổ vào ống - Đổ đầy ống lên đến mức số - Lưu ý cần phải đuổi hết bọt khí ống https://www.youtube.com/watch?v=sFpFCPTDv2w Ống đong (graduated cylinder): dụng cụ định lượng có dung tích thay đổi từ 5ml đến lít, thường có hình trụ, có mặt đáy phân độ Sự phân chia vạch gần thể tích tồn phần Do khơng nên dùng ống đong để chia lượng nhỏ Trang Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Ống đong a Ống đong thường b Ống đong có nút nhám Bình nón hay bình tam giác (erlenmeyer flask): dụng cụ chứa hình nón, có khơng có vạch chia thể tích, thường có dung tích khác nhau, có mỏ khơng có mỏ, cổ rộng cổ hẹp, cổ nhám không, sử dụng rộng rãi thí nghiệm phân tích (chuẩn độ) Bình nón (Erlenmeyer) Phễu thường (funnel): dụng cụ dùng để rót, lọc,… Phễu lọc có góc 60o có cuống dài, mặt phễu lọc phẳng khơng phẳng (để lọc nhanh hay lọc từ từ) Khi lọc ta đặt phễu lên giá Hình: Phễu (a) Giá đỡ; (b) Phễu thường Phễu chiết hay bình lóng (separating funnel) Thường có dạng lê, hình ống có nút nhám thủy tinh, gần cuối phễu (sau cuống phễu) có khóa nhám Phễu thường Trang Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm dùng để tách riêng chất lỏng khơng hịa tan với (ví dụ: nước dầu) Tùy theo hình dạng mà ta có cách đặt phễu giá sử dụng Khi lắc bình long, lưu ý phải giữ nút đầu Hình: Các loại bình lóng khác Phễu nhỏ giọt: Phễu nhỏ giọt khác phễu chiết chỗ: nhẹ hơn, thành phễu mỏng có cuống dài Người ta sử dụng phễu cho thí nghiệm phải thêm vào hỗn hợp phản ứng lượng nhỏ Vì phễu nhỏ giọt thường phận kèm dụng cụ Hình Các loại phễu nhỏ giọt Cốc thủy tinh (becher): Là cốc hình trụ, có thành mỏng có dung tích khác Chúng thường có dạng: có mỏ khơng có mỏ, thường sản xuất từ loại thủy tinh khó chảy bền hóa học Lưu ý: Khơng nên đun cốc thủy tinh lửa trần mà đun nóng qua lưới amiăng dùng bình cách thủy Trang Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Hình: Cốc thủy tinh (Becher) Bình định mức: dụng cụ tối cần thiết đa số thí nghiệm phân tích Thường dùng để pha loãng dung dịch đến thể tích xác định, để hịa tan chất Khi cho chất lỏng vào bình định mức phải dùng phễu, sau đậy nắp lại dốc ngược bình nhiều lần để trộn Hình: Bình định mức Bình cầu đáy bằng: Là dụng cụ cần thiết thí nghiệm phân tích, chúng bình cầu đáy có nút thủy tinh mài nhám có dung tích khác nhau, từ 50ml đến hàng chục lít Có thể làm từ loại thủy tinh thường thủy tinh đặc biệt Trang Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Ống nghiệm Hóa chất Thử thật (1) Thử khơng (2) Dung dịch Casein 1% (mL) Dung dịch TCA 5% (mL) Dung dịch enzyme mẫu (mL) Lắc giữ 35,5 C 30 phút Dung dịch TCA 5% (mL) 10 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên 10 Lấy ống nghiệm mới, sạch, đánh dấu A B Cho vào ống A 5mL dịch lọc từ ống nghiệm cho vào ống B 5mL dịch lọc từ ống nghiệm Thêm vào ống 10mL NaOH 0,5N Lắc hút từ ống nghiệm ml cho vào ống nghiệm khô khác Thêm vào 0,3 ml thuốc thử Folin Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm 720nm Tính ΔOD = ODT-OD0 Dựa vào đồ thị chuẩn suy µmol Tyrosin 2.3.4 Kết quả: Hoạt độ Enzyme Protease tính theo cơng thức: Hoạt độ P = Vi: V: v: t: m: L: àmol Tyrosin: molTyrosinìVìL t×m×v (UI/g) Tổng thể tích hỗn hợp ống nghiệm (mL) Thể tích dịch lọc đem phân tích (mL) Thời gian thủy phân (phút) Khối lượng mẫu thơm đem xác định hoạt tính (g) Độ pha lỗng mẫu enzyme Lượng µmol Tyrosin v (mL) suy từ đường chuẩn Trang 37 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI THỰC HÀNH Dựng đường chuẩn Tyrosine Xác định hoạt độ Bromelin giải thích kết Hoạt độ enzyme Bromelin (IU/g): Anh chị giải thích kết trên? Trang 38 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm CÂU HỎI NÂNG CAO BÀI THỰC HÀNH Nêu ý nghĩa đường chuẩn phương pháp xác định hoạt độ enzyme Có cách xác định khác phương pháp xác định hoạt độ enzyme mà không dùng đường chuẩn Giải thích phản ứng màu Folin sản phẩm thủy phân Protease Trình bày yếu tố ảnh hưởng lên phương pháp xác định hoạt độ enzyme Trang 39 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Bài ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNS Lý thuyết: Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường tổng đường khử với thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS) Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử acid dinitrosasylic tính đường khử mẫu nghiên cứu Thực hành: 2.1 Hóa chất: - Nguyên liệu: Trái giàu đường H2SO4 10% Glucose mẫu (0,5 mg/ml): cân 0,05 g D-glucose pha nước thành 100 ml Thuốc thử acid ditrosalisylic(DNS):Cân 1g DNS pha 20ml NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất 30g muối Sodium potaaium tartrate, đun cách thủy cho tan định mức tới 100ml 2.2 Dụng cụ: - Quang phổ kế Ống nghiệm: Bình định mức 250mL: Bình định mức 100mL Erlen 100mL: Cối chày sứ: Phễu thủy tinh: Pipette 1mL: Pipette 5mL: Nồi cách thủy: cái cái cái cái 2.3 Tiến hành: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: Cân xác g mẫu nguyên liệu cần phải định lượng đường Cắt nhỏ nghiền nguyên liệu sau cho lượng H2SO4 10% cho vừa ngập mẫu Đem đun cách thủy khoảng Lấy mẫu cho vào NaOH (nồng độ 20 %) để trung hòa mẫu (thử giấy q tím, pH 6,5-7,5) Mẫu sau trung hịa pha lỗng định mức thành thể tích định (50ml 100ml) Nếu dung dịch có cặn cần phải đem lọc Dung dịch dùng để định lượng đường khử Nếu nồng độ dung dịch đường khử q cao ngồi đồ thị chuẩn cần phải pha loãng dung dịch đường +Xây dựng đồ thị chuẩn Từ dung dịch glucose chuẩn 0,5 mg/ml (hay 500 g/ml), pha dung dịch glucose có nồng độ từ 0-500 (g/ml) Ống nghiệm Nồng độ glucose tương ứng (g/ml) 100 200 300 400 500 Dung dịch glucose (0,5 mg/ml) (ml) Trang 40 Thực hành Hóa sinh học Nước cất (ml) Viện CN Sinh học & Thực phẩm Lắc hút từ ống nghiệm 0,5 ml cho vào ống nghiệm khô khác; thêm vào ống 0,5 ml thuốc thử DNS Đem đun cách thủy dung dịch ống nghiệm chuyển sang màu nâu đỏ, làm nguội thêm ml nước cất; tiến hành đo mật độ quang bước sóng 540nm mẫu thử mẫu trắng nên làm đồng thời với Vẽ đồ thị chuẩn glucose với trục tung mật độ quang, trục hoành nồng độ glucose Xác định hàm lượng đường khử dịch trích Phản ứng dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS tiến hành tương tự phần xây dựng đồ thị chuẩn (0,5 ml dung dịch đường, 0,5 ml dung dịch thuốc thử DNS, đun cách thủy dung dịch ống nghiệm chuyển sang màu nâu đỏ, để nguội, thêm ml nước cất đem đo mật độ quang bước sóng 540nm) Nồng độ đường mẫu xác định nhờ vào đường chuẩn glucose dựng bên 2.4 Tính kết quả: Vẽ đồ thị chuẩn độ hấp thu A nồng độ C Sau xác định số đường mẫu đo cách dóng đồ thị Trị số lượng đường thật có mẫu nguyên liệu lúc đầu cách nhân với hệ số pha loãng K Trang 41 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI THỰC HÀNH Vẽ đồ thị chuẩn glucose: Dựa vào kết đường chuẩn anh chị tính hàm lượng đường khử mẫu trái bao nhiêu? (mg/g): Dựa vào kết tính hàm lượng đường khử mẫu, anh chị giải thích so sánh kết với thực tế biết Trang 42 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm CÂU HỎI NÂNG CAO BÀI THỰC HÀNH Có lọai saccharide? Cho ví dụ nêu ứng dụng chúng đời sống sản xuất Đường khử gì? Vai trị đường khử sản xuất thực phẩm? Viết phương trình tổng quát việc xác định hàm lượng đường khử phương pháp DNS Giới thiệu số phương pháp xác định đường khử khác mà anh chị biết Trang 43 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Bài ĐỊNH LƯỢNG LIPID TỔNG I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT Nguyên lý phương pháp Soxhlet: Nguyên liệu làm khơ, sau trích ly lipid khỏi nguyên liệu eter etylic eter dầu hoả Soxhlet, xác đinh khối lượng chất béo trích ly hai cách: - Tính khối lượng chênh lệch mẫu trước sau trích ly chất béo (sau đuổi hết dung mơi) - Tính khối lượng chênh lệch bình cầu Soxhlet trước sau tiến hành trích ly mẫu (sau đuổi hết dung môi) II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ Thiết bị Soxhlet - Tủ sấy - becher 100ml - Cân phân tích - Đũa thủy tinh - Bình hút ẩm - nồi cách thủy III HÓA CHẤT - 2g nguyên liệu - 150ml eter etylic eter dầu hoả aceton - tờ giấy lọc IV THỰC HÀNH Chuẩn bị mẫu: - Làm khô nguyên liệu cách sấy nguyên liệu tủ sấy nhiệt độ 100 -105°C khoảng 30phút (với sữa khoảng 100°C) đến khối lượng khơng đổi, để nguội bình hút ẩm Cắt mảnh giấy lọc kích thước 8x10cm, gấp thành bao nhỏ, sấy nhiệt độ 105oC đến khối lượng khơng đổi, để nguội bình hút ẩm, cân bao giấy Ghi nhận khối lượng giấy sấy khơ hồn tồn ( Hai q trình sấy thực lần để tiết kiệm thời gian ) - Cân lượng xác cân phân tích lượng mẫu khoảng gam cho vào bì giấy sấy khơ Trang 44 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Chuẩn bị dụng cụ: - Rửa dụng cụ, tráng lại aceton phần bình đun, bình chiết ống xi phơng thiết bị Soxhlet - Sấy khô tủ sấy nhiệt độ 105oC - Lau phần dụng cụ tiếp xúc với nguyên liệu miếng giấy lọc có tẩm eter (lau lần miếng giấy lọc khác nhau) Chuẩn bị mẫu thiết bị Soxhlet: - Đặt bình đun lên nồi cách thủy - Lắp bình chiết khớp với miệng bình đun - Đặt bao mẫu vào đáy bình chiết - Lắp ống sinh hàn vào bình chiết - Đặt phễu thủy tinh lên miệng ống sinh hàn - Lắp hệ thống dẫn nước ống sinh hàn - Cho nước chảy vào, kiểm tra hoạt động hệ thống sinh hàn, tạm thời tắt nước - Cho eter vào qua phễu thủy tinh, cho eter đủ ngập mẫu chiếm khoảng 2/3 dung tích bình đun - Kiểm tra lại độ kín tồn hệ thống Q trình chiết rút lipid thiết bị Soxhlet: - Làm nút bơng gịn nút phía phễu ống sinh hàn - Bật bếp cách thủy nhiệt độ 45 – 50oC - Mở nước hệ thống sinh hàn - Eter sôi, chuyển thành dạng hơi, theo xi phơng dẫn lên bình chiết, bay vào ống sinh hàn, gặp lạnh, ngưng tụ lại rơi vào bình chiết, hịa tan lipid ngun liệu bình chiết (Chú ý: cho eter sôi nhẹ, không để sôi mạnh) - Khi mức eter có chứa lipid bình chiết dâng lên, ngập xi phông dẫn dung môi xuống bình đun, eter chảy xuống bình đun Tại eter đun sôi, chuyển thành dạng hơi, theo xi phơng dẫn dung mơi bay lên bình chiết, bay vào ống sinh hàn, gặp lạnh, ngưng tụ lại rơi vào bình chiết Quá trình lặp lặp lại chiết hết lipid - Kiểm tra nguyên liệu chiết hết lipid cách sau: Trang 45 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm  Eter ống trụ không màu  Lấy vài giọt dung môi ống trụ nhỏ vào miếng giấy lọc Nếu vết loang dung môi sau khô không phân biệt giấy trắng coi trích ly hết lipid  Lấy vài giọt dung môi nhỏ miếng thuỷ tinh, bay hết dung mơi khơng cịn đọng lại vết chất béo coi trích ly hết lipid Kết thí nghiệm: a Xác định lipid theo phương pháp gián tiếp - Tháo bình chiết, gắp mẫu đũa thủy tinh, đặt lên becher, để tủ hút cho bay hết eter - Để tủ sấy, sấy nhiệt độ độ 105°C giờ, để nguội bình hút ẩm, cân bao giấy có chứa mẫu Tính kết quả: - Hàm lượng lipid có nguyên liệu: % lipid  100  m1  m2  m Trong đó:  m : Khối lượng mẫu đem phân tích (g)  m1: Khối lượng bao giấy có chứa mẫu độ khơ tuyệt đối (g) (khối lượng giấy khô tuyệt đối, khối lượng mẫu khô tuyệt đối)  m2 : Khối lượng bao giấy có chứa mẫu chiết lipid độ khô tuyệt đối (g) b Xác định lipid theo phương pháp trực tiếp - Lắp hệ thống chưng cất thu hồi eter - Khi cặn lipid eter bình cầu, ta đun cách thủy nhẹ để đuổi eter Khi eter bay hết, cho vào tủ sấy, sấy 100-105°C Để nguội 30 phút bình hút ẩm Cân xác Tính kết quả: - Hàm lượng lipid thô nguyên liệu: % lipid  (m1  m2 )  100 m Trong đó:    m1 m2 m : Khối lượng bình cầu có chứa lipid (g) : Khối lượng bình cầu khơng (g) : khối lượng ngun liệu (g) Trang 46 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Bài ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ CHỈ SỐ DẦU MỠ Xác định số xà phịng (Savon) hóa (TCVN 6126:2015) 1.1 Lý thuyết: Định nghĩa: Chỉ số xà phịng hóa số mg KOH cần thiết để trung hòa acid béo tự acid béo dạng kết hợp ester có 1g chất thử Nguyên lý: Cho chất cần thử kết hợp với lượng KOH thừa để chất béo chuyển thành xà phòng Phần KOH thừa định lượng dung dịch acid chuẩn, với phenolphthalein làm thị màu 1.2 Thực hành: 1.2.1 Dụng cụ: 1.2.2 - Pipette 10mL, Buret 25mL, Giá đỡ buret, Erlen 250mL, Thiết bị cất sinh hàn hồi lưu Hóa chất: KOH 0,5N cồn 960 HCl 0,5N Phenolphthalein 1% 1.2.3 Phương pháp tiến hành: Cân xác 2g mẫu thử, xác đến mg cho vào bình cầu thiết bị cất Phần mẫu thử 2g để xác định số xà phòng từ 170 đến 200 Đối với số xà phòng khác lượng phần mẫu thử cần thay đổi cho phù hợp cho khoảng dung dịch KOH ethanol trung hòa Thêm 25mL KOH 0,5 N ethanol 96% (v/v) Lắp ống sinh hàn hồi lưu vào bình cầu đun cách thủy, cho sôi nhẹ 0,5 – phản ứng xà phịng hóa kết thúc (xác định thấy dung dịch bình suốt đồng khơng biến đổi pha lỗng với nước) Đối với chất khó xà phịng hóa, thêm – 10mL xylol đun lâu tùy theo trường hợp Tiến hành song song mẫu trắng khơng có chất khử với 25mL dung dịch KOH 0,5N cồn điều kiện Ngay sau xà phịng hóa hồn tồn, pha lỗng bình với 25mL nước đun sôi để nguội, cho vào vài giọt PP, định phân dung dịch HCl 0,5N màu hồng I.2.4 Tính kết quả: Chỉ số xà phịng hóa: S = (V0−V1)×c×56,1 m Trong đó: V0 : số mL HCl sử dụng mẫu trắng V1 : số mL HCl sử dụng mẫu cần thử c : Nồng độ xác dung dịch HCl tính mol/lít m : trọng lượng mẫu thử tính gam Xác định số acid (TCVN 6127:1996) 2.1 Lý thuyết: Trang 47 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Định nghĩa: Chỉ số acid lượng mg KOH cần thiết để trung hòa acid tự chứa 1g chất cần thử Nguyên lý: Dùng NaOH 0,1N để trung hòa acid tự chất cần thử, với phenolphthalein làm thị màu 2.2 Thực hành: 2.2.1 Dụng cụ: - Buret 25mL, Giá đỡ buret, Erlen 250mL, Cốc 100mL, Ống đong 50mL, Pipette 5mL 2.2.2 Hóa chất: - Cồn 960, - Ether trung tính, - KOH 0,1 N - Phenolphtalein 1% 2.2.3 Phương pháp tiến hành: Cân 5g dầu mỡ, hòa tan 50mL hỗn hợp gồm 25mL cồn 25mL ether trung tính Chuẩn độ NaOH 0,1N có màu hồng bền vững với phenolphtalein sau 10 giây Đối với loại tinh dầu có nhiều ester dễ bị xà phịng hóa, ta sử dụng dung dịch NaOH 0,05N để chuẩn độ 2.2.4 Kết quả: Chỉ số acid: A = 5,61.a b (hay A = 2,805 a b ) Chỉ số ester: E = số S – số A Trong đó: 5,61 2,805: số mg KOH tương ứng với 1mL NaOH 0,1N 0,05N a: số mL NaOH 0,1N hay 0,05N sử dụng định lượng b: trọng lượng chất thử để định lượng (g) 3.Chỉ số peroxide 3.1 Lý thuyết Khi có mặt O2 khơng khí, acid béo có thành phần dầu mỡ acid béo khơng no dễ dàng bị hóa phần tạo thành peroxide Hiện tượng xảy làm dầu mỡ bị ôi hay bị khô Việc xác định số peroxide dựa vào phản ứng sau: RC-H-C-H-R’-COOH + 2KI + 2CH3COOH → RCH-CH-R’-COOH + I2 O-O O + 2CH3COOK + H2O Lượng Iodine phóng thích chuẩn đọ dung dịch natrithiosunfat: Trang 48 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm Na2S2O3 + I2 → 2NaI+ Na2S4O6 3.2 Dụng cụ - hóa chất 3.2.1 Dụng cụ - Erlen 250mL Erlen nút nhám Bóp cao su Ống đong Buret 25mL Becher 100mL 3.2.2 Hóa chất - EDTA 5% Cloroform Acid acetid Dung dịch KI bão hòa (59,8g KI/100mL) Na2S2O3 0,002n Chỉ thị hồ tinh bột 1% 3.2.3 Thực hành - - Cân 5g dung dịch dầu đem xác định số peroxide Thêm vào 30mL hỗn hợp Cloroform – Acid acetid tỉ lệ 1:2 Lắc Thêm tiếp 1mL dung dịch KI bão hào Đậy nắp Lắc hỗ hợp cẩn thận phút (thỉnh thoảng mở nắp), để yên phút bóng tối Thêm vào hỗ hợp khoảng 50mL nước cất Định phân iod dung dịch Na2S2O3 0,002N vài giọt thị hồ tinh bột 1% dung dịch màu xanh tím hồn tồn Nếu lượng Na2S2O3 0,002N dùng q nhiều chuẩn độ lại với dung dịch Na2S2O3 0,1N Đồng thời làm thí nghiệm kiểm chứng khơng có chất béo Nếu chuẩn màu trắng vượt 0,1mL Na2S2O3 phải pha loại hóa chất 4.Kết quả: Chỉ số peroxide biểu thị số milimol peroxide 1kg chất khử PoV= 0,05  (V  v) 1000 p  500 Với: 0,05 số milimol peroxide tương ứng với 1mL Na2S2O3 chuẩn (dung dịch 1N) V: Số mL Na2S2O3 0,002N dùng để chuẩn độ mẫu thử v: Số mL Na2S2O3 0,002N dùng để chuẩn độ mẫu trắng p: Trọng lượng mẫu thử dùng để định lượng 500: chuyển từ dung dịch 0,002N sang dung dịch 1N 3.Yêu cầu Báo cáo giải thích kết Trang 49 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI THỰC HÀNH Tách chiết lipide từ hạt: Hạt Trọng lượng giấy lọc Trọng Trọng lượng lượng hạt giấy lọc với hạt Trọng lượng giấy lọc hạt sau tách chiết dầu Trọng % Lipid lượng hạt tách sau chiết tách chiết dầu Chỉ số xà phịng hóa dầu: Thể tích KOH dùng để chuẩn độ Mẫu thử Thể tích KOH Trung bình thể tích KOH Chỉ số xà phịng hóa mẫu vật = Chỉ số acid chất béo: Thể tích KOH cần thiết để chuẩn độ mẫu thử thật Mẫu Trọng lượng chất béo (g) Thể tích dung mơi hịa tan chất béo (ml) Thể tích KOH trung hịa chất béo (ml) Thể tích KOH trung hịa chất béo (ml) Thể tích KOH cần thiết để chuẩn độ mẫu thử khơng có chất béo Mẫu Trọng lượng chất béo (g) Thể tích dung mơi hịa tan chất béo (ml) Thể tích KOH trung hịa chất béo (ml) Thể tích KOH trung hòa chất béo (ml) Chỉ số acid mẫu vật = Trang 50 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm CÂU HỎI NÂNG CAO BÀI THỰC HÀNH Các dạng lipid thường gặp thực phẩm? Trình bày nguyên lý phương pháp kiểm lipid nói Trình bày ý nghĩa thực tiễn thí nghiệm Trang 51 ... tắt Trang Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm NỘI DUNG THỰC HÀNH Buổi BÀI THỰC HÀNH NỘI DUNG Dụng cụ thiết bị phịng thí nghiệm Hóa sinh Hóa chất- Cách chuẩn bị dung dịch hóa chất... dương tính với thuốc thử? _ Trang 28 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm CÂU HỎI NÂNG CAO BÀI THỰC HÀNH Nêu thành phần hóa học sữa đơng tụ whey protein? ... Dựa vào kết thí nghiệm 1, sinh viên tiến hành tính tốn pha dung dịch NaOH 0,01N Trang 20 Thực hành Hóa sinh học Viện CN Sinh học & Thực phẩm BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI THỰC HÀNH Thí nghiệm 1: Lần Lần