tài liệu thực hành hóa sinh học đầy đủ và rõ ràng nhất

Bộ tài liệu thực hành hóa sinh học tổng hợp kiến thức đã học trên lớp và mở rộng thêm kiến thức bên ngoài để sinh viên có thể hiểu rõ và áp dụng vào thực tế một cách cụ thể và rõ ràng nhất. Ngoài ra có hệ thống bài rõ ràng phân theo từng bậc nhằm giúp sinh viên có thể sử dụng thành thạo kĩ năng từ dễ đến khó, phục vụ cho mục đích học tập và trao dồi khả năng tư duy

BÀI 2: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA LIPID VÀ ỨNG DỤNG

Thí nghiệm 2.1: Khảo sát tính hòa tan của lipid……… ………….3

Thí nghiệm 2.2: Phản ứng xà phòng hóa……….………… 4

Thí nghiệm 2.3: Sự nhũ tương hóa……….……….……….…….6

Thí nghiệm 2.6: Tìm các thể ceton trong nước tiểu………

…….8

BÀI 3: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA GLUCID VÀ ỨNG DỤNG Thí nghiệm 3.1: Phản ứng Molish……… ……… 11

Thí nghiệm 3.2:Phản ứng Fehling……….……….…….13

Thí nghiệm 3.3: Phản ứng Seliwanoff (Đặc hiện cho cetose)……….……16

Thí nghiệm 3.4: Thủy phân Saccharose……….….18

Thí nghiệm 3.5: Phản ứng màu polysacchrid (Tác dụng của Iod trên tinh bột) ……… 21

Thí nghiệm 3.7: Phản ứng Glucose trong nước tiểu (Phản ứng BENEDICT)… 23

BÀI 4: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA PROTID VÀ ỨNG DỤNG Thí nghiệm 4.1: Phản ứng Ninhydrin……….….26

Thí nghiệm 4.2: Phản ứng Biuret (Xác nhận các liên kết peptid)……….……… 28

Thí nghiệm 4.3: Phản ứng tủa protein bởi nhiệt và môi trường acid yếu…… … 29

Thí nghiệm 4.4: Phản ứng tủa bởi acid mạnh và không đun nóng……… 31

Thí nghiệm 4.5: Tìm protein trong nước tiểu……… ………… 32

Thí nghiệm 4.6: Định lượng Albumin trong huyết thanh (Phương pháp BIURET) ……….35

BÀI 5: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA HEMOGLOBIN VÀ MỘT SỐ XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN, THEO DÕI BỆNH GAN MẬT

Thí nghiệm 5.2: Phản ứng tìm sắc tố mật trong nước tiểu (Kỹ thuật FOUCHET)

BÀI 2: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA LIPID VÀ CÁC

 Cách tiến hành : Cho vào 2 ống nghiệm các dung dịch sau:

Lắc kỹ

 Hiện tượng, giải thích:

- Ống 1: dầu ăn không tan trong nước tạo thành các hạt nhũ tương

 Vì dầu ăn (lipid) là chất không phân cực mà nước là dung môi phân cực nên dầu

ăn không tan trong nước tạo thành nhũ tương

- Ống 2: dầu ăn tan trong alcol (ether)

 Vì dầu ăn (lipid) là chất không phân cực mà alcol (ether) là dung môi khôngphân cực nên dầu ăn tan được trong alcol (ether)

Khi đun nóng chất béo với dung dịch kiềm (NaOH hoặc KOH) thì tạo ra

glixerol và hỗn hợp muối của các acid béo Phản ứng của chất béo với dung dịch

kiềm được gọi là phản ứng xà phòng hóa

(Đun hỗn hợp trên bếp điện)

* Hòa tan xà phòng trong 10 ml nước, đun cho tan rồi chia ra 2 phần:

- Lấy 1 nữa (khoảng 5ml) cho vào ống nghiệm đun cách thủy, thêm vào 10 giọtHCl đậm đặc, tiếp tục đun sẽ có phần đặc nổi lên trên và phần lỏng ở dưới

(Đun cách thủy)

- Còn 1 nữa (khoảng 5ml) để lại làm phản ứng nhũ tương hóa

 Hiện tượng và giải thích:

Dung dịch tách thành 2 lớp: phần đặc nổi lên trên là xà phòng và phần lỏng ở dưới là tạp chất gồm Glycerol, NaCl…Việc cho HCl vào ống nghiệm nhằm trung

hòa lượng NaOH còn dư trong phản ứng xà phòng hóa

THÍ NGHIỆM 2.3: SỰ NHŨ TƯƠNG HÓA

 Ý nghĩa:

Vai trò của muối mật trong tiêu hóa và hấp thu mỡ ở ruột

 Nguyên tắc:

- Nhũ tương là một hệ phân tán cao của hai chất lỏng mà thông thường không hòa

tan được vào nhau

- Nhũ tương dầu trong nước không bền để tạo độ bền cho nhũ tương có thể cho

thêm các chất hoạt tính bề mặt (chất nhũ hóa) như: xà phòng, muối mật, protein,

lecithin, Na 2 CO 3 … các chất này ngăn trở hỗn hợp lại tự tách ra thành các thành

 Cách tiến hành : Cho vào 3 ống nghiệm

Nước cất Dầu ăn Na 2 CO 3 10% Xà phòng

- Ống 2: dầu ăn không tan trong nước cất, cho xà phòng vào hỗn hợp 1 phần xà

phòng lắng xuống đáy, 1 phần nổi trên mặt nước

* Muối mật có vai trò quan trọng trong tiêu hóa và hấp thu mỡ bởi vì:

Muối mật có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của các hạt mỡ trong thức ăn

Các muối mật đóng vai trò như xà phòng (chất nhũ tương hóa) kết hợp với

các phospholipid làm vỡ các giọt mỡ trong quá trình nhũ tương hoá mỡ, tạo thànhcác hạt micelle, nhờ đó hỗ trợ hấp thu mỡ

THÍ NGHIỆM 2.6: TÌM CÁC THỂ CETON TRONG NƯỚC TIỂU

 Ý nghĩa:

Ứng dụng phản ứng để tìm thể ceton trong nước tiểu

 Nguyên tắc:

Natri nitroprussiat tác dụng với các chất ceton cho phức chất màu tím, phản

ứng này xảy ra trong môi trường kiềm

Ceton + Natri nitroprussiat phức chất có màu tím

 Cách tiến hành: Cho vào 1 ống nghiệm:

- 10 giọt nước tiểu

- Acid acetic đậm đặc 2 giọt

- Natri nitroprussiat 10% 2 giọt

Trộn đều, nghiêng ống nghiệm 45°, nhỏ cẩn thận theo thành ống 15 giọt NH3

đậm đặc ( khoảng 0.5 ml) Sau vài phút, nếu có ceton sẽ thấy phần màu tím ở mặtphân cách hai dung dịch

Nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành ceton là do sự thiếu hụt insulin.

Thiếu insulin sẽ làm tăng các hocmon đối kháng với insulin như (glucagon,cathecolamin, cortisol,…) Mặt khác, khi thiếu insulin sẽ ức chế quá trình tổng hợplipid, các glycerol của lipid sẽ chuyển thành glucose dẫn đến đường máu lại càngtăng đồng thời kéo theo sự bài xuất thể ceton qua nước tiểu

Trong điều kiện rối loạn chuyển hóa, acetyl coenzyme A cũng có thể tích tụ lại

để tạo thành những sản phẩm acid aceto acetic, acid hydroxybutyric và acetone, 3chất này có tên chung là cetonic (thể cetone)

 Biện luận:

- Bình thường không có các chất ceton trong nước tiểu

- Có trong trường hợp:

+ Bệnh tiểu đường nặng hoặc điều trị bằng insulin không đủ liều, bệnh nhân đe dọa

bị hôn mê

+ Nhịn đói lâu, nôn nhiều

+ Vận động cơ nhiều, Cushing…

 Triệu chứng của bệnh đái tháo đường:

- Rối loạn tri giác

- Khó thở, khát dữ dội, sụt cân nhiều

- Da khô nhăn nheo

- Vết thương khó lành có thể hoại tử

(Bệnh gai đen) (Xơ cứng ngón tay) (Hoại tử)

BÀI 3: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA GLUCID VÀ

Dung dịch glucide 1ml glucose 1% 1ml fructose 1% 1ml hồ tinh bột 1%

(Thứ tự ống nghiệm từ trái qua phải)

 Giải thích và phương trình phản ứng:

- Do các glucose, fructose và hồ tinh bột dưới tác dụng của acid H2SO4 đậm đặc chúng sẽ bị khử nước cho ra 5-hydroxymethyl furfural và các chất này trong môi trường acid sẽ phản ứng thế thân điện tử trên α-Napthol và cho ra phức màu tím

- Do fructose có cấu trúc vòng 5 cạnh nên trong môi trường acid đậm dặc dễ bị phá

vỡ tạo thành furfural, glucose có cấu trúc vòng 6 cạnh nên bền hơn còn hồ tinh bột khá bền vì có liên kết α-1,4 glycozit

- KOH hoặc NaOH 135g

- Natri kali tartrat 150g

- Nước cất vừa đủ 1000 ml

 Cách tiến hành: Chuẩn bị 5 ống nghiệm:

0.5mlglucose 1%

0.5mlfructose 1%

0.5ml lactose1%

0.5mlsaccharose1%

0.5ml hồtinh bột 1%

Đun sôi cách thủy 3 phút

 Hiện tượng, giải thích và phương trình phản ứng:

Khi trộn 2 dung dịch Fehling A và Fehling B với thể tích bằng nhau, natri kalitartrat sẽ hòa tan tủa Cu(OH)2 do CuSO4 trong môi trường kiềm sinh ra Tạo mộtphức chất Cu2+ alcolat màu xanh thẫm, lần lượt cung cấp Cu2+ cho phản ứng oxyhóa khử nói trên

- Ống 1,2: đều xảy ra kết tủa đỏ gạch nhưng ống 1 có kết tủa đậm hơn.

Glucose và frutose đều là monosacharid có –OH bán acetal  có tính khử Mặtkhác, glucose có nhóm -CHO có tính khử mạnh hơn nhóm -C=O trong fructosenên ống của Glucose có màu đậm hơn

- Ống 3: có kết tủa đỏ gạch nhưng chậm hơn ống 1, 2 do lactose bị thủy phân

tạo ra 2 phân tử β-D-galactose và D-glucose có tính khử do có nhóm -OH bánacetal tự do ở C1

Lactose + H2O Galactose + Glucose

β-D-Galactopyranose β-D-Glucopyranose

(Công thức cấu dạng của Lactose) -Ống 4: không hiện tượng Do saccharose không có nhóm –OH bán acetal để

chuyển thành aldehyde Do đó không tác dụng được với thuốc thử Fehling

(Công thức cấu dạng của saccharose)

- Ống 5: không hiện tượng Do tinh bột là polysacchraide không có tính khử.

(Thứ tự ống nghiệm từ trái qua phải)

THÍ NGHIỆM 3.3: PHẢN ỨNG SELIWANOFF (Đặc hiệu cho cetose)

 Thuốc thử:

Thuốc thử Seliwanoff

- Resorcinol (hay resorcin) 0,05 g

- HCl pha loãng 1/3 100 ml

 Cách tiến hành : Lần lượt cho vào 2 ống nghiệm

 Hiện tượng và giải thích:

-Ống 1: xuất hiện màu đỏ anh đào Vì dưới tác dụng của HCl đặc và t°

Seliwanoff Dung dịch đường

Đun sôi cách thủy 10 phút

các cetol hexose & ceto pentose tạo thành hydroxy methyl fufural & fufural Cácchất này ngưng tự với resorxinol tạo sản phẩm ngưng tụ có màu đỏ anh đào.

- Ống 2: không hiện tượng Các aldose cũng có thể tạo thành

hydroxymetyl-furfural khi đun nóng với acid, nhưng phản ứng xảy ra rất chậm

 Phương trình phản ứng:

Đỏ anh đào Thí nghiệm 3.4: THỦY PHÂN SACCHAROSE

Tạo dung dịch thủy phân: Cho vào ống nghiệm 2 ml dung dịch saccharose 1%

và 4 giọt HCN 1N, đun sôi cách thủy 5 phút lấy dịch thủy phân này làm phản ứngFehling và Seliwanoff

Tiến hành trên 4 ống nghiệm:

Dung dịch thuốc thử Phản ứng Fehling Phản ứng Seliwanoff

 Hiện tượng và giải thích:

- Ống 1: Tạo kết tủa màu đỏ gạch do khi thủy phân saccharose bằng acid tạo

thành Glucose và Frutose đều có tính khử nên phản ứng được với thuốc thửFehing

- Ống 2: Không hiện tượng Do saccharose không có OH bán acetal nên không có

tính khử  Không phản ứng được với thuốc thử Fehling

- Ống 3: Tạo kết tủa màu đỏ anh đào Do khi saccharose khi thủy phân có tạo

thành Fructose (có gốc cetose)

- Ống 4: Tạo kết tủa màu đỏ anh đào Do trong thuốc thử Saliwanoff có chứa 1/3

HCl pha loãng, trong điều kiện đung cách thủy 10 phút =>sacchrose bị thủy phân

Saccharose Glucose Fructose

Chuyển từ cetol aldol trong mt kiềm

Oxy hóa với thuốc thử Fehling:

Phản ứng Saliwanoff:

THÍ NGHIỆM 3.5: PHẢN ỨNG MÀU POLYSACCHARID

(Tác dụng của Iod trên tinh bột)

 Nguyên tắc:

Đỏ gạch

Các Polysaccharid kết hợp với Iod cho những phức tạp có màu khác nhau tùytheo độ lớn của phân tử Polysaccharid

- Với tinh bột: cho màu xanh dương tím

- Với glycogen: cho màu đỏ nâu

Nhận xét có những cách gì để phân biệt giữa monosaccharide, disaccharide &polysaccharide?

 Hiện tượng:

- Dung dịch xuất hiện màu xanh dương tím

- Khi đun nóng dd dần mất màu, khi làm nguội dd màu xanh xuất hiện trở lại

(Dd xanh dương) (Đun nóng) (Mất màu dd)

 Giải thích :

Mạch phân tử của amylose không phân nhánh và xoắn thành dạng hình trụ Các

phân tử iod đã len vào, nằm phía trong lòng xoắn và tạo thành chất bọc có màuxanh Liên kết giữa iod và amylose trong hợp chất bọc là liên kết yếu Ngoài ra,amylopectin còn có khả năng hấp thụ iod trên bề mặt các mạch nhánh Hợp chấtbọc không bền ở t° cao Khi đun nóng các mạch xoắn sẽ duỗi thẳng ra giải phóngcác phân tử iod nên dd bị mất màu, khi để nguội lại tạo thành dạng ống iod lại bịnhốt trong ống này Vì thế xuất hiện màu xanh trở lại

* Cách phân biệt giữa monosaccharide, disaccharide & polysaccharide

- Đầu tiên ta cho vào 3 ống nghiệm tương ứng với từng chất thể tích bằng nhau

- Nhỏ 5-10 giọt thuốc thử Lugol (ống 3 xuất hiện màu xanh dương, 2 ống còn lại chưa hiện tượng)

- Tiếp đến nhỏ vào 2 ống còn lại 5-10 giọt thuốc thử Felhing ( ống 1 xuất hiện kết tủa đỏ gạch, ống còn lại là ống 2 disaccharide).

Thí nghiệm 3.7: PHẢN ỨNG GLUCOSE TRONG NƯỚC TIỂU (Phương pháp Benedict)

Thuốc thử benedict: Dung dịch A: Natri citrat 173 g

Natri carbonat (Na2CO3) 200 gNước cất đun nóng 700 mlDung dịch B: CuSO4.5H2O 17,3 g

- Đổ dung dịch B từ từ vào dung dịch A, lắc đều, thêm nước cất vào vừa đủ1000ml

- Đun sôi cách thủy

- Thuốc thử phải không có tủa đỏ Bảo quản được lâu dài

Cách tiến hành:

- Cho vào ống nghiệm 1 ml thuốc thử benedict (hoặc thuốc thử Fehling)

- Thêm vào 0,1 ml (2 giọt) nước tiểu

- Đun sôi cách thủy

Nhận xét sự chuyển màu

 Kết quả:

- Ống 1: Thuốc thử trong, màu lam: phản ứng âm tính (-) => Không có glucose

trong nước tiểu

- Ống 2: Có ít tủa, thuốc thử vấy màu xanh lá: phản ứng dương tính (+)

=> lượng glucose trong nước tiểu không quá 5 g/l

- Ống 3: Đun sôi trong 1 phút có tủa màu vàng sẫm: phản ứng dương tính (++)

=> lượng glucose trong nước tiểu 5-10 g

- Ống 4: Đun sôi, tủa đỏ gạch: phản ứng dương tính (+++)

=> lượng glucose trong nước tiểu 10-20 g/l

- Ống 5: Tủa màu nâu sẫm ngay mới bắt đầu đun sôi Phản ứng dương tính (+++

+)

=> lượng glucose trong nước tiểu lớn hơn 20 g/l

(Thứ tự ống nghiệm từ trái qua phải)

 Phân biệt:

- Phản ứng Benedict là phản ứng định lượng vì: thông qua phản ứng định tính

người ta có thể ước chừng lượng glucose trong nước tiểu

- Phân biệt thuốc thử Benedict và thuốc thử Fehling: Thuốc thử Fehling chỉ có

thể định tính Glucose trong nước tiểu

BÀI 4: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA PROTID VÀ

ỨNG DỤNG

THÍ NGHIỆM 4.1 : PHẢN ỨNG NINHYDRIN

 Ý nghĩa:

Đây là phản ứng chung cho các protid và acid amine tự do Phản ứng này cho

phép nhận dạng tất cả các acid amine có nhóm -NH2 và -COOH tự do Ngoại trừ,prolin và -OH prolin tác dụng với ninhydrin cho màu vàng

 Nguyên tắc:

Dung dịch protein, peptide hoặc axit amin khi đun nóng với ninhydrin 0,2% sẽcho màu xanh tím

Ninhydrin là một chất oxi hóa nên có thể tạo nên phản ứng khử carboxyl oxi

hóa của acid amine với H2O, để cuối cùng cho ra CO2 , NH3 và aldehyde ngắn đi 1

C so với acid amine gốc và ninhydrin bị khử Sau đó, ninhydrin bị khử lại tác dụnglại với NH3 vừa được phóng thích và kết hợp với 1 phân tử ninhydrin thứ 2, tạo

thành sản phẩm ngưng kết có màu xanh tím.

(Cơ chế phản ứng Ninhydrin)

 Cách tiến hành:

Phản ứng Biuret dùng để định lượng protein và xác nhận các liên kết peptide.

 Nguyên tắc:

Protein tác dụng với Cu2+ trong môi trường kiềm tạo phản ứng màu tím hồng,

phản ứng xảy ra do các liên kết peptide

Sở dĩ gọi phản ứng Biuret (có nhóm CO-NH, giống như một liên kết peptide)

cũng cho phản ứng tương tự, tạo phức hợp có màu giống như protein

Sự tạo thành biuret

 Cách tiến hành: Cho vào ống nghiệm

+ Dung dịch lòng trắng trứng 1ml

+ Dung dịch NaOH 40% 0.5ml

+ Dung dịch CuSO4 1% 3 giọt

- Lắc đều, quan sát màu, nhận xét & giải thích?

 Hiện tượng và giải thích:

- Xuất hiện dd màu tím hồng đặc trưng Trong môi trường kiềm các protein có

chứa từ 2 liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất

có màu tím xanh, tím hồng, tím đỏ Tùy thuộc vào độ dài của mạch peptide.

 Làm mất điện tích của protein bằng cách

- Thêm chất điện giải như NaCl, ( NH4)2SO4 …

- Hoặc đưa pH của môi trường chứa protein về pHi đẳng điện của protein

- Các tiểu phân protein khi đã mất điện tích chỉ còn lớp áo nước thì dễ bị kết tủa,nếu làm mất áo lớp áo nước thì protein sẽ kết tủa

 Làm mất lớp áo nước của protein bằng cách

- Thêm chất khử nước vào môi trường chứa protein (Vd: alcolhol, aceton,(NH4)2SO4 , )

- Hoặc làm biến tính protein bằng cách đun sôi, thêm acid hay kiềm mạnh hoặcmuối kim loại nặng

Acid acetic 10% 5 giọt 5 giọt

Đun sôi cách thủy 5 ống

 Cách tiến hành: Cho vào 5 ống nghiệm

Nhận xét, ghi kết quả từng ống và giải thích ống nào tủa, ống nào không tủa?

 Hiện tượng và giải thích:

-Tốc độ phản ứng của các ống: Ống 4 > ống 3 > ống 2 > ống 1 > ống 5

- Ống 1: kết tủa trắng đục, protein bị ảnh hưởng bởi t° và bị mất lớp áo nước bên

ngoài nhưng vẫn còn tích điện

- Ống 2: có kết tủa trắng đục vì khi cho 2 giọt acid acetic 1% sẽ tạo nên môi

trường acid yếu Nhóm -COO- sẽ bị ức chế sự phân ly nên tiểu phân protein mấtđiện tích pH môi trường đạt gần tới điểm đẳng điện

- Ống 3: Có kết tủa trắng đục khá nhanh khi đun.

- Ống 4: Tạo kết tủa trắng đục nhanh và nhìu Khi cho 5 giọt acid acetic 10% và

2 giọt NaCl bão hòa sẽ tạo nên môi trường trung hòa về điện Nên tạo kết tủa

- Ống 5: Dung dịch kết tủa chậm trong môi trường kiềm.

( Các ống theo số thứ tự từ trái qua phải)

THÍ NGHIỆM 4.4: PHẢN ỨNG TỦA BỞI ACID MẠNH VÀ KHÔNG ĐUN NÓNG

 Cách tiến hành:

Acid vô cơ

- Ống 1: Cho vào ống nghiệm 2 ml dung dịch lòng trắng trứng, để nghiêng ống

nghiệm 45o, nhỏ từ từ lên thành ống nghiệm chảy xuống 1 ml HNO3 đậm đặc

Quan sát hiện tượng ở mặt phân cách 2 dung dịch

Acid hữu cơ

- Ống 2: Cho vào ống nghiệm các dung dịch sau và trộn đều:

Dung dịch acid trichloracetic 3% 1ml

Quan sát và giải thích hiện tượng?

 Hiện tượng, giải thích và phương trình phản ứng:

Acid vô cơ

- Ống 1: Khi thêm acid nitric đặc vào lòng trắng trứng thấy có kết tủa màu vàng

xuất hiện là sản phẩm polynitro thu được trong quá trình nitro hóa nhân thơm trongprotein