TÀI LIỆU THỰC HÀNH HÓA SINH CƠ SỞ

TÀI LIỆU TRẮC NGHIỆM, BÀI GIẢNG PPT CÁC MÔN CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC VÀ CÁC NGÀNH KHÁC HAY NHẤT CÓ TẠI “TÀI LIỆU NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT” ;https:123doc.netusershomeuser_home.php?use_id=7046916. TÀI LIỆU TÀI LIỆU THỰC HÀNH HÓA SINH CƠ SỞ. DÀNH CHO SINH VIÊN CÁC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC VÀ CÁC NGÀNH KHÁC, GIÚP SINH VIÊN HỆ THỐNG, ÔN TẬP VÀ HỌC TỐT KHI HỌC TÀI LIỆU TÀI LIỆU THỰC HÀNH HÓA SINH CƠ SỞ

Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở BÀI 01: HỐ HỌC GLUCID 1.Thí nghiệm 01 : Phản ứng Molish 1.1 Nguyên tắc : Các hợp chất glucid cho màu tím với dung dịch α - naphtol môi trường H2SO4 đậm đặc 1.2 Thuốc thử (tt) : Molish Dung dịch α - naphtol 01 g pha alcol 900 1.3 Tiến hành : Chuẩn bị : 04 ống nghiệm , khô Các hợp chất khác glucid Thuốc thử Molish 1% Tiến hành : Ống nghiệm 01 : 01 ml ( or 20 giọt) dd glucose % Ống nghiệm 02 : 01 ml ( or 20 giọt) dd fructose or Maltose % Ống nghiệm 03 : 01 ml ( or 20 giọt) dd lactose % Ống nghiệm 04 : 01 ml ( or 20 giọt) dd Hồ tinh bột 1% Tiếp theo cho vào mỗii ống nghiệm giọt tt molish , lắc Tiếp theo nghiêng ống cho vào từ từ ( chảy theo thành ống ) 10 –15 giọt H2SO4đđ Chú ý : Lúc không làm xáo trộn 02 lớp dd ống nghiệm Quan sát lớp ranh giới dd ống ngiệm Kết luận ý nghĩa phản ứng Molish ? 2.Thí nghiệm 02 : Phản ứng Fehling 2.1 Nguyên tắc : Các monosaccharide (MS) chứa nhóm chức khử (aldehyd ceton ) , chúng có khả khử ion kim lọai nặng (Cu 2+ ) môi trường kiềm mạnh , đun nóng để giải phóng kim lọai oxyd kim lọai có hóa trị thấp MS bị oxyhóa thành acid 2.2 Thuốc thử : Thuốc thử Fehling : Gồm 02 dung dịch + Dd A : CuSO4 5H2O kết tinh 35 g H2SO4 đđ 06 ml Nước cất vừa đủ 1000 ml + Dd B : KOH or NaOH 135 g Muối Na Kali Tartrat 150 g Nước cất vừa đủ 1000 ml Trước dùng , trộn 02 dd A B vớI thể tích 1:1 Thuốc thử Felling suốt có màu xanh lam Chú ý : Sinh viên khơng phải pha ( GV chuẩn bị trước ) Trang Bộ môn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở 1.3 Tiến hành : Chuẩn bị : - 05 ống nghiệm sạch, khô đánh số từ 01 tớii 05 - thuốc thử Fehling - Các hợp chất khác glucid - Bếp điện , pipette v…v… Tiến hành : Ống nghiệm 01 : 01 ml ( or 20 giọt) dd glucose % Ống nghiệm 02 : 01 ml ( or 20 giọt) dd Maltose % Ống nghiệm 03 : 01 ml ( or 20 giọt) dd lactose % Ống nghiệm 04 : 01 ml ( or 20 giọt) dd Hồ tinh bột 1% Ống nghiệm 05 : 01 ml ( or 20 giọt ) dd Saccarose 1% Tiếp theo cho vào ống 01 ml dd thuốc thử Fehling , lắc ống nghiệm Tiếp theo đem đun sôi 05 ống nghiệm / phút Nhận xét ống nghiệm giải thích 3.Thí nghiệm 03 :Phản ứng màu Polysaccharide 3.1 Nguyên tắc : Các Polysaccharide (PS) kết hợp với Iode cho phức hợp có màu khác tuỳ mức độ phân tử PS Nếu tinh bột : có màu xanh dương Nếu Glycogen : có màu đỏ nâu 3.2 Thuốc thử : Dung dịch hồ tinh bột 1% Dung dịch Lugol 0.1 % : gồm Iode 0.1g KI 0.2 g trộn chung , tán nhỏ cho tan hết với nước cất (ED) thêm vừa đủ 100 ml 3.3 Tiến hành : Chuẩn bị : - 01 ống nghiệm - 01 miếng khoai lang luộc chín cắt mỏng Tiến hành : a- Cho vào ống nghiệm 01 ml ( or 20 giọt ) dd hồ tinh bột 1% , thêm vào giọt dd Lugol 0,1% Quan sát màu xuất b - Trên 01 miếng khoai cho vào giọt Lugol 0,1 % Quan sát giải thích hai thí nghiệm Thí nghiệm 04 : Phản ứng Barfoed 4.1 Nguyên tắc : Sự khử môi trường acid acetic giúp phân biệt MS DS Với MS tủa đỏ xuất sớm , tủa nhiều thời gian –7 phút Với DS mà có tính khử , tủa chậm ,ít sau –12 phút Trang Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở 4.2 Thuốc thử : Thuốc thử Barfoed gồm có - Acetat đồng 60g - CH3COOH glacial : 13ml - Nước cất 900 ml 4.3 Tiến hành : Chuẩn bị : 02 ống nghiệm sạch, khô - thuốc thử Barfoed - Các hợp chất khác glucid - Bếp điện , pipette v…v… Tiến hành : Ống nghiệm 01 : 01 ml ( or 20 giọt) dd glucose % Ống nghiệm 02 : 01 ml ( or 20 giọt) dd lactose % Tiếp theo cho vào ống 02 ml dd thuốc thử Barfoed, lắc ống nghiệm Đem đun sôi cách thủy Ghi nhận thời gian mức độ tủa xuất ống , quan sát sau phút / 01 lần , nhận xét BÀI 02 HĨA HỌC LIPID Thí nghiệm 01 : Khảo sát tính hịa tan 1.1 Ngun tắc : Dựa vào tính chất vật lý hợp chất lipid có khả hịa tan lọai dung mơi khác 1.2 Tiến hành : Chuẩn bị : 02 ống nhiệm sạch, khô Nước cất, Alcool or Acetone Các bước tiến hành : Ống nghiệm 01 : 01 ml ( or 20 giọt ) Nước cất Ống nghiệm 02: 01 ml (or 30 giọt dung môi Alcool or Acetone ) Tiếp theo cho vào ống 02 giọt dầu ăn Lắc kỹ , nhận xét kết 02 ống nghiệm Thí nghiệm 02 : Phản ứng xà phịng hóa acid béo 2.1 Ngun tắc : Dưới tác dụng môi trường kiềm , glycerid bị thủy phân tạo thành glycerol muối acid béo 2.2 Tiến hành : Chuẩn bị : 01 bình nón , khô Dung dịch dầu ăn Trang Bộ môn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở Dung dịch NaOH 10% ( pha alcoo 900 ) Dung dịch nước cất , bếp điện , pipette Dung dịch HCl đđ Các bước tiến hành : Cho vào bình nón : 0,5 ml (or 10 giọt ) dầu ăn , cho vào 2,5 ml dd NaOH 10% Đun cách thủy khỏang 10 phút , sau 02 phút lắc bình dầu tan hết dd NaOH 10% , tiếp tục đun đến dung dịch trở nên quánh Lấy Chú ý : Cẩn thận trình thao tác, tránh cố xảy Tiếp theo hòa tan xà phịng bình nón vớii 10 ml nước cất , đun cho tan thành dung dịch lỏng Phân chia vào 01 ống nghiệm khỏang ml ( để dành làm thí nghiệm 03) , phần cịn lại bình nón (5 ml) Tiếp theo cho vào bình nón 10 giọt HCl đđ , lắc mạnh , tiếp tục đun – phút Quan sát tượng cho biết thành phần chúng bình nón Viết phương trình phản ứng xảy Thí nghiệm 03 : Khảo sát nhũ tương hóa lipid 3.1 Ngun tắc : Dầu (or mỡ) khơng hịa tan nước , tác động mạnh tạo thành nhữ tương không bền ( để yên thời gian chúng phân chia làm 02 lớp dầu , nước ) Nếu thêm chất làm nhũ tương hóa ( Na2CO3 , protein , muối mật) tạo thành nhữ tương bền 3.2 Tiến hành : Chuẩn bị : - Dung dịch xà phòng ( ống nghiệm 05 ml chuẩn bị TN ) - Nước cất - Dung dịch Na2CO3 10% - Lòng trắng trứng Các bước tiến hành : - Tiến hành theo bước mô tả bảng sau : Nước cất Dầu ăn Na2CO3 10% Xà phòng TN 02 Lòng trắng trứng Ống N0 01 10 ml 02 giọt 02 giọt Ống N0 02 10 ml 02 giọt Ống N0 03 10 ml 02 giọt 02 giọt 02 giọt Tiếp theo : Lắc mạnh , để yên 05 phút Trang Ống N0 04 10 ml 02 giọt Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở Quan sát tượng xảy ống giải thích Thí nghiệm 04 : Phản ứng màu định tính Cholesterol ( P.ứng Liebermann Burchard) 4.1 Nguyên tắc : Cholesterol tác dụng anhydric acetic vớii diện H2SO4 cho phức hợp có màu xanh lục 4.2 Tiến hành : Chuẩn bị : 01 ống nghiệm khô Dung dịch H2SO4 đđ Dung dịch Anhydric acetic Dung dịch Sulfo salycilic 12% Các bước tiến hành : Ống nghiệm 01 Dd cholesterol 200 mg% Dung dịch Sulfo salycilic 12% Anhydric acetic H2SO4 đđ giọt 0,5 ml 1,5 ml 0,2 ml ( or giọt) Lắc để bóng tốii 10 phút Quan sát màu dung dịch BÀI 03 HÓA HỌC PROTID Thí nghiệm 01 : Phản ứng Ninhydrin 1.1 Nguyên tắc : Ninhydrin chất oxyhóa mạnh , có khả khử carboxyl oxy hóa acid amin tạo thành CO2 , NH3 andehyd 01 carbon so với acid amin ban đầu Sau Ninhydrin bị khử tác dụng lại với NH3 vừa phóng thích kết hợp với phân tử Ninhydrin thứ hai ,tạo thành sản phẩm ngưng kết có màu xanh tím 1.2 Thuốc thử : Dung dịch Ninhydrin 0,1% Ninhydrin 0,1g Alool 96 10 ml Hòa tan thêm Nước cất vừa đủ 100 ml 1.3 Tiến hành : Chuẩn bị : 04 ống nghiệm sạch, khô đánh số 01 đến 04 Dung dịch glycin 0,1% Dung dịch tryptophan 0,1% Trang Bộ môn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở Dung dịch protein lịng trắng trứng 0,1% Dung dịch gelatin 0,1% Tiến hành : Ống N0 01 Ống N0 02 Ống N0 03 Dung dịch glycin 0,1% Dung dịch tryptophan 0,1% Dung dịch protein lòng trắng trứng 0,1% Dung dịch gelatin 0,1% Thuốc thử Ninhydrin 0,1% Ống N0 04 01 ml 01 ml 01 ml giọt giọt giọt 01 ml giọt Lắc đều, đun sôi cách thủy –10 phút Quan sát màu phản ứng , giải thích Thí nghiệm 02 : Phản ứng Adamkewich 2.1 Nguyên tắc : Các acid amin có chứa nhóm Indol ( Tryptophan ) dướii tác dụng acid mạnh H2SO4 , Tryptophan phản ứng với acid glyoxylic phức chất có màu tím Acid glycoxylic chất tạp thường theo acid acetic phản ứng xảy nhiệt độ thường 2.2 Tiến hành Chuẩn bị : - 02 ống nghiệm sạch, khô - Dung dịch Tryptophan 0,1% - Dung dịch Lòng trắng trứng 0,1% - Dung dịch H2SO4 đđ - Dung dịch CH3COOH đđ Tiến hành : Dung dịch Tryptophan 0,1% Dung dịch Lòng trắng trứng 0,1% Dung dịch CH3COOH đđ Dung dịch H2SO4 đđ nhỏ từ từ vào thành ống tránh làm xáo trộn lớp dung dịch Ống N0 01 01 ml Ống N0 02 01 ml 01 ml 01 ml 01 ml 01 ml Quan sát màu mặt phân cách 02 lớp dung dịch Thí nghiệm 03 : Phản ứng Biuret 3.1 Nguyên tắc Trong môi trường kiềm , liên kết peptid protein kết hợp Ion kim lọai nặng Cu2+ cho phức chất màu tím Trang Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở 3.2 Tiến hành : Chuẩn bị : 01 ống nghiệm sạch, khô Dung dịch CuSO4 1% Dung dịch NaOH 40 % Lòng trắng trứng 0,1% Tiến hành : Cho vào ống nghiệm theo trình tự : Dung dịch lịng trắng trứng 0,1% Dung dịch NaOH 40 % Dung dịch CuSO4 1% ml 0,5 ml 03 giọt Lắc quan sát màu phản ứng Thí nghiệm 04 : Phản ứng tủa Protein nhiệt với môi trường acid nhẹ 4.1 Nguyên tắc Protein hòa tan nước thành dung dịch keo ưa nước, dung dịch tiểu phân protein lọai tích điện dấu , xung quanh tiểu phân protein có lớp áo nước ( phân tử lưỡng cực liên kết nhóm phân cực –OH , - COOH, -NH2 ,=NH…).Nhờ hai yếu tố , protein tồn dạng dung dịch keo bền vững Sự tủa protein : Protein kết tủa rõ ràng đồng thời làm hai yếu tố hịa tan sau: • Làm điện tích tiểu phân protein cách: - Đưa pH dung dịch protein pH đẳng điện (pHi) protein , Khi pH dd với pHi protein, đa số protein dạng lưỡng cực , khơng mang điện tích - Thêm chất điện giải NaCl, NH4SO4 … ion trung hịa điện tích tiểu phân protein • Làm lớp áo nước cách : - Gây biến tính protein , cấu trúc protein bị đảo lộn cách đun sôi, thêm muối kim lọai nặng , thêm acid, kiềm mạnh … - Thêm chất hút nước : NH4SO4 , alcool etylic … 4.2 Thuốc thử Dung dịch Acid acetic 1% Dung dịch Acid acetic 10% Dung dịch NaCl bão hòa Dung dịch NaOH 10% 4.3 Tiến hành Chuẩn bị 05 ống nghiệm khô Làm theo bước trình tự mơ tả bảng sau : Ống N0 01 Trang Ống N0 02 Ống N0 03 Ống N0 04 Ống N0 05 Bộ môn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở Lịng trắng trứng Dung dịch Acid acetic 1% Dung dịch Acid acetic 10% Dung dịch NaCl bão hòa Dung dịch NaOH 10% 01 ml 01 ml 02 giọt 01 ml 01 ml 01 ml 05 giọt 02 giọt 02 giọt Lắc đều, đun sôi cách thủy ống nghiệm –5 phút Quan sát tủa hình thành nhận xét mức độ khác ống nghiệm Giải thích Thí nghiệm 05 : Phản ứng tủa Protein bởii Acid mạnh khơng đun nóng 5.1 Ngun tắc Các acid vơ cơ, hữu mạnh làm biến tính đại đa số protein 5.2 Thuốc thử Dung dịch Lòng trắng trứng 0,1% Dung dịch TCA 30% Dung dịch H2SO4 đđ 5.3 Tiến hành : Dung dịch Lòng trắng trứng 0,1% Dung dịch TCA 30% Dung dịch H2SO4 đđ (nhỏ từ từ vào thành ống nghiệm ) Ống N0 01 02 ml 01 ml Ống N0 02 02 ml 01 ml Trộn quan sát BÀI 04 ENZYM Thí nghiệm 01 : Họat động enzym thủy phân (α - Amylase) 1.1 Nguyên tắc Dưới tác dụng Amylase , tinh bột glycogen bị thủy phân qua sản phẩm trung gian dextrin , cuối maltose Dưới tác dụng maltase , maltose bị thủy phân thành glucose Sản phẩm trung gian dextrin có nhiều lọai nên tác dụng với iode cho phức hợp có màu sắc khác Tinh bột + Iode Amylodextrin Erythrodextrin Acrodextrin Maltose Trang Bộ môn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở ( Xanh Tím Đỏ nâu 1.2 Thuốc thử Dung dịch tinh bột 0,5% Dịch nước bọt 1/10 Dung dịch Iode N/200 Thuốc thử Fehling 1.3 Tiến hành Chuẩn bị : - vàng nâu Vàng ) Một ống nghiệm sạch, khô Một khay sứ có nhiều lỗ Pipette, đồng hồ bấm giây Tiến hành : A- Trong ống nghiệm cho vào: Dung dịch tinh bột 0.5% ml Dịch nước bọt chứa enzym ml Trộn để nhiệt độ phịng thí nghiệm , sau 01 phút lấy giọt dung dịch ống nghiệm nhỏ lên lỗ khay sứ cho sẵn giọt dung dịch iode 1/200 Khi dung dịch không chuyển màu iode nghĩa tinh bột ban đầu thủy phân hết thành maltose B – Tiến hành kiểm tra phản ứng Fehling Thêm ml thuốc thử Fehling vào ống nghiệm cịn lại , đem đun sơi / phút Quan sát phản ứng màu khay sứ ống nghiệm Nhận xét 2.Thí nghiệm 02 : Khảo sát yếu tố ảnh hưởng nhiệt lên họat tính enzym 2.1 Nguyên tắc Dưới tác dụng urease , ure bị thủy phân tạo thành NH3 CO2 , sản phẩm thủy phân làm pH môi trường trở thành kiềm Phát sản phẩm tạo thành phenolphtalein 2.2 Thuốc thử Dung dịch Urê 1.5% Dung dịch phenolphtalein 0.5% Dung dịch Urease : nghiền đậu tương với nước , lọc lấy nước 2.3 Tiến hành : Cho vào 03 ống nghiệm : Dung dịch Urease Để phút nhiệt độ Dung dịch Urê 1.5% Để tiếp phút nhiệt độ , sau lấy Dung dịch phenolphtalein 0.5% Ống N0 01 0,5 ml 280C ml Ống N0 02 0.5 ml 60 0C ml Ống N0 03 0,5 ml 1000C 2ml giọt giọt giọt Nhận định kết : Quan sát đổi màu 03 ống nghiệm , nhận xét giải thích Trang Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở Thí nghiệm 03 : Đo họat tính enzym AST huyết tương Nguyên tắc α - Ceto glutarat + L Aspartat 3.1 AST L Glutamat + Oxaloacetat Oxaloacetat + NADH + H+ 3.2 3.3 3.4 L Malat + NAD+ MDH Mẫu thử Huyết or huyết tương ( kháng đông Heparine ) Thuốc thử Dạng kit pha sẵn , gồm hóa chất sau : A – Buffer/ Substrate ( Reagent 01) Tris buffer pH 7.5 L Aspartate B- Enzym/Coenzym ( Reagent 02) α - ceto glutarate Tiến hành Thuốc thử pha sẵn (R2 pha R1 ) Huyết ( hay huyết tương) Ống nghiệm sạch, khơ 500 µ l 50 µ l Trộn , Chú Ý : đọc nhanh để tránh sai lệch kết Chương trình máy Humalyzer 2000 số 33 or 34 Họat độ AST Huyết tương ( U/L) : = 1746 x ∆A /min Ý nghĩa lâm sàng : AST có nhiều gan tim Họat độ AST bình thường huyết tương đo 370 C Nam: < 37 U/L Nữ < 35U/L Họat độ AST tăng chủ yếu gặp bệnh lý sau Nhồi máu tim Bệnh nhu mô gan Bệnh lý xương Thí nghiệm 04 : Đo họat tính enzym ALT huyết tương Nguyên tắc α - Ceto glutarat + L.Alanin 4.1 ALT L Glutamat + Pyruvat Pyruvat + NADH + H+ L Lactat + NAD+ LDH Trang 10 Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở Mẫu thử Huyết or huyết tương ( kháng đông Heparine ) 4.3 Thuốc thử Dạng kit pha sẵn , gồm hóa chất sau : A – Buffer/ Substrate ( Reagent 01) Tris buffer pH 7.5 L Alanin B- Enzym/Coenzym ( Reagent 02) α - ceto glutarate 4.2 4.4 Tiến hành : Thuốc thử pha sẵn (R2 pha R1 ) Huyết ( hay huyết tương) Ống nghiệm sạch, khơ 500 µ l 50 µ l Trộn , Chú Ý : đọc nhanh để tránh sai lệch kết Chương trình máy Humalyzer 2000 số 33 or 34 Họat độ ALT Huyết tương ( U/L) : = 1746 x ∆A /min Ý nghĩa lâm sàng : ALT có nhiều gan mơ khác Họat độ ALT bình thường huyết tương đo 370 C Nam: < 40 U/L Nữ < 35U/L Họat độ ALT tăng chủ yếu gặp bệnh lý sau Viêm gan cấp tính mạn tính Bệnh họai tử gan Tắc mật … BÀI ĐỌC THÊM NGUYÊN TẮC CÁC XÉT NGHIỆM HÓA SINH LÂM SÀNG THƯỜNG DÙNG QUA PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG 1.Phương pháp đo điểm cuối ( End-point method) Đo số lượng sản phẩm tạo thành từ thời điểm t0 bắt đầu đến thời điểm t kết thúc phản ứng , tất chất cần xác định ( substrate ) tiêu thụ hết Có thể đo tính kết : So với chuẩn (standard) or so với hệ số (Factor) • kỹ thuật thực : 1.1 Phương pháp hóa học : Dùng phản ứng hóa học đặc hiệu cho chất cần xác định Trang 11 Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở Phương VD : Định lượng protein phản ứng Biuret Định lượng glucose phản ứng Ortho- Toluidine 1.2 Phương pháp Enzym Dùng enzym thuốc thử tác dụng đặc hiệu , chuyên biệt chất cần xác định VD : Định lượng Urê dùng enzym Urease Định lượng Cholesterol sử dụng enzym cholesterol oxidase pháp động học ( Kinetic Method) Theo dõi động học, cách liên tục trình diễn tiến phản ứng , qua thời điểm t0, t1, t2 v…v khoảng tiến tính phản ứng • Kỹ thuật thực : Đo vận tốc tạo thành sản phẩm từ thời điểm t0, t1, t2 … Hoạt tính enzym tính cách : F x ∆ A/min Đơn vị : UI/L Kỹ thuật áp dụng để xác định hoạt tính thơng số enzym ( ALT, AST, amylase, CPK, ALP …) Lưu ý : Trị số đối chiếu ( giá trị bình thường ) thơng số tùy thuộc vào loại kỹ thuật xét nghiệm , điều kiện tiến hành, nhiệt độ… ngòai biến thiên sinh lý gây ảnh hưởng lên kết XN Khi nhận định kết lưu ý yếu tố BÀI 05 CHUYỂN HÓA GLUCID Thí nghiệm 01 : Định lượng glucose huyết 1.1 Phương pháp Somogyi Nelson : Nguyên tắc Glucose khử dung dịch thuốc thử sulfate đồng thành Oxyt đồng (Cu2O) Tủa màu đỏ Cu2O dễ bị oxy hóa không đo trực tiếp tác dụng với arsenomolybdate , khử chất thành oxid molybdin màu xanh , đo máy quang phổ kế Phản ứng thực mơi trường kiềm nóng 1.2 Phương pháp O Toluidin Ngun tắc Trong mơi trường acid acetic đun nóng với diện Thiourea Glucose huyết kết hợp với O.Toluidin cho phức chất màu xanh lục , màu tỉ lệ thuận với nồng độ Glucose huyết đọc máy quang phổ kế 1.3 Phương pháp Enzym 1.3.1 Nguyên tắc Glucose huyết bị oxy hóa enzym glucose oxidase cho Gluconic acid hydrogen peroxide Hydrogen peroxide kết hợp vớp phenol amino antipyrin với diện enzym peroxidase cho phức chất có màu hồng tím 1.3.2 Thuốc thử Trang 12 Bộ môn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở Dạng kit có sẵn bao gồm : Reagen 01 (R1) Phosphate buffer pH = 7.4 Phenol Reagen 02 (R2) Enzym Glucose oxidase Enzym Peroxidase 4.amino antipyrin Chai dung dịch chuẩn (standard ) nồng độ 100 mg/dl ( 5,55 mmol/L) 1.3.3 Kỹ thuật tiến hành Ống N0 Bệnh nhân (Unknoun 500 µl µl Thuốc thử pha sẵn Huyết BN Glucose Standard Ống N0 chuẩn ( Standard) 500 µl µl Trộn đều, để nhiệt độ PTN Đọc kết sau 10 phút Chương trình máy Humalyze 2000 số 09 1.3.4 Ý nghĩa lâm sàng Trị số bình thường : 75 –115 mg/dl - Glucose máu tăng ( > 6,1 mmol/L) gặp bệnh : Tiểu đường tụy Bệnh cường tuyến thượng thận U tuyến yên Nhiễm độc tuyến giáp - Glucose máu giảm (< 4,2 mmol/L) gặp bệnh : Nhịn đói kéo dài U thân tụy ( u adenoma, carcinoma) Thiểu tuyến nộI tiết ( vỏ thượng thận, tuyến yên, tuyến giáp) Tổn thương vùng dướI đồI Bệnh lý gan (xơ gan nặng) Nhiễm độc chất Asen, CCl4 Định tính sơ glucose nước tiểu 2.1 Phương pháp Benedict 2.1.1 Nguyên tắc Glucose nước tiểu khử dung dịch đồng sulfate môi trường kiềm,tạo thành hợp chất Cu2O có tủa màu đỏ gạch 2.1.2 Thuốc thử Thuốc thử Benedict CuSO4 17.3g Na2CO3 100g Trang 13 Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở Na Citrate Nước cất cho đủ 173 g 1000 ml Hòa tan riêng CuSO4 vào 100ml ED , xong đổ từ từ vào hỗn hợp Na2CO3 + Na citrate 2.1.3 2.1.4 Tiến hành Trong ống nghiệm sạch, khô (19 x 150 mm) cho vào: Thuốc thử Benedict 2.5 ml Nước tiểu (BN) giọt Đun sôi, cách thủy , thời gain phút Lấy làm nguội, đọc kết Kết : Âm tính (-) : Dung dịch có màu xanh dương Dương tính (+) : Dung dịch đổi xanh lục có tủa màu vàng xanh Dương tính (++):Dung dịch đổi màu vàng có tủa màu vàng nhạt Dương tính (+++): Tủa vàng đậm Dương tính (++++): Tủa vàng cam đến đỏ gạch 2.2 Phương pháp giấy nhúng ( xem nước tiểu) BÀI 06 CHUYỂN HĨA LIPID Thí nghiệm 01 : Định lượng Cholesterol huyết 1.1 Phương pháp Rappoporrt Eichhorn Nguyên tắc : Dùng acid sulfosalysilic để phá hủy protein cầu nối lipoprotein huyết phóng thích cholesterol Cholesterol kết hợp với H2SO4 đđ hợp chất Cholestadien sulfonic acid có màu xanh lục 1.2 Phương pháp enzym ( PP CHO-PAP với hóa chất kit Human) 1.2.1 Nguyên tắc Cholesterol huyết tác dụng enzym cholesterol esterase cholesterol oxidase chuyển thành Cholesteron H2O2 Sau H2O2 kết hợp chất tạo màu amino antipyrin có diện enzym peroxidase tạo phức chất có màu đỏ Đo trực tiếp máy quang phổ kế 1.2.2 Thuốc thử Dạng kit pha sẵn gồm có : - Đệm phosphate ( pH =6,5) 100 mmol/ L - – Amino-antipyrin 0,25 mmol/L - Phenol mmol/L - Peroxidase > 5U/L Trang 14 Bộ môn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở - Cholesterol esterase > 150 U/L - Cholesterol oxidase > 100 U/L - Sodium azid 0,05% Dung dịch cholesterol chuẩn 200 mg/dl ( 5,17 mmol/L) 1.2.2 Kỹ thuật tiến hành : Ống N0 Bệnh nhân (Unknoun) 500 µl µl Thuốc thử pha sẵn Huyết BN Cholesterol Standard Ống N0 chuẩn ( Standard) 500 µl µl Trộn đều, để nhiệt độ PTN Đọc kết sau 10 phút Chương trình máy Humalyze 2000 số 06 1.2.3 Ý nghĩa lâm sàng - Trị số bình thường Cholesterol < 200 mg/dl ( or < 5,7 mmol/L) - Khi nồng độ cholesterol tăng cần phối hợp với xét nghiệm để biện luận - Cholesterol tăng trường hợp sau + Cao thứ phát : Đái tháo đường , thiểu tuyến giáp , viêm tụy cấp , viêm tụy mạn , thận hư nhiểm mỡ + Cao nguyên phát : Bệnh bẩm sinh tăng lipoprotein - Cholesterol giảm gặp chủ yếu suy giảm chức tế bào gan (xơ gan) 2.Thí nghiệm 2.1 Nguyên tắc 02 : Định lượng Triglycerid huyết Phản ứng xảy theo phương trình sau : Triglyceride + H2O Lipoprotein Lipase glycerol + AB (1) Glycerol + ATP Glycerolkinase Glycerol-3-Phosphate + O2 Glycerol-3-phosphate + ADP (2) G-3-P oxidase H2O2 + amino- antipyrin + ESPA Peroxidase H2O2 + Dihydroxyacetone phosphate (3) Red quinone + H2O (4) 2.2 Thuốc thử Reagent 01 (R1) Pipes buffer pH7 N-Ethyl-N-Sulfopropyl –N – Anisidine ( ESPA) Reagent ( R2) Lipoprotein Lipase Glycerokinase Glycerol –3- phosphate Oxidase Peroxidase Trang 15 Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở – amino -antipyrin ATP Dung dịch Triglyceride standard 200 mg/dl 2.3 Kỹ thuật tiến hành Thuốc thử pha sẵn Huyết BN Triglyceride standard Ống N0 Bệnh nhân (Unknoun) 500 µl µl Ống N0 chuẩn ( Standard) 500 µl µl Trộn đều, để nhiệt độ PTN Đọc kết sau 10 phút Chương trình máy Humalyze 2000 số 21 2.4 Ý nghĩa lâm sàng - Trị số bình thường : Nam : 60 –165 mg/dl ( 0.68 – 1.88 mmol/L) Nữ : 40 –140 mg/dl ( 0.46 – 1.60 mmol/L) - Trị số tăng thường gặp bệnh : Bệnh lý tim mạch : Xơ mỡ động mạch Bệnh nhân tiểu đường nặng Các bệnh có tổn thương gan Trong bệnh Buerger Griitz , tăng gấp 20 lần BÀI 07 CHUYỂN HĨA PROTID Thí nghiệm 01 : Định lượng Protein huyết 1.1 Nguyên tắc : dựa phản ứng Biure Protein ( có chứa từ liên kết peptid trở lên ) + Cu2+ OH- tạo phức chất màu xanh tím Độ đậm màu ( mật độ quang) phức hợp màu xanh tím tỷ lệ thuận với nồng độ protein 1.2 Thuốc thử Thuốc thử reagent : Kali natri tartrat Natri hydroxyd Kali iodur Thuốc thử reagent : CuSO4 mmol/L 1.3 Kỹ thuật tiến hành Ống N0 Bệnh nhân (Unknoun) Trang 16 21 mmol/L 58 mmol/L mmol/L Ống N0 chuẩn ( Standard) Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở Thuốc thử pha sẵn Huyết BN Protein Standard 500 µl µl 500 µl µl Trộn đều, để nhiệt độ PTN Đọc kết sau 10 phút Chương trình máy Humalyze 2000 số …19 1.4 Ý nghĩa lâm sàng Trị số protein toàn phần huyết bình thường 62 – 80 g/l Trị số tăng trường hợp sau : • U tủy • Mất nước • Thiểu vỏ thượng thận Trị số giảm thường gặp có ý nghĩa bệnh sau : • Suy dinh dưỡng • Bệnh gan ( viêm gan, xơ gan) • Giảm bệnh thận ( viêm thận, thận hư …) • Giảm protein qua đường ruột • Giảm tăng phân hủy ( đái đường, suy kiệt ung thư, sốt kéo dài ) Thí nghiệm 02 : Định tính protein nước tiểu ( Phương pháp dùng Acid Sulfosalicylic 3% nhiệt độ phòng ) 2.1 Nguyên tắc Protein nước tiểu bị kết tủa bởI Acid Sulfosalicylic 3% mà không cần yếu tố đun nóng 2.2 Thuốc thử dụng cụ Ống nghiệm 13 x 100 Giá đựng Ống hút 01 ml Acid Sulfosalicylic 3% 2.3 Kỹ thuật Cho vào ống nghiệm : ml nước tiểu ml Acid Sulfosalicylic 3% Trộn , đọc kết 2.4 Kết Đưa ống nghiệm chổ ánh sáng , đọc độ đục đen Âm tính : Dung dịch Dương tính : Dung dịch đục có tủa - Biện luận kết : Nước tiểu có Mucin, Bence Jone Protein, Acid Uric cho phản ứng dương giả Xét nghiệm nhạy, thực đơn giản , áp dụng xét nghiệm hàng loạt cộng đồng Trang 17 Bộ môn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở BÀI 08 XÉT NGHIỆM NƯỚC TIỂU 1.Phân tích mẫu nước tiểu với loại giấy nhúng 10 thông số Tùy theo nhà cung cấp mà có loại giấy nhúng khác Tuy nhiên chúng có đặc điểm chung sau : 1.1 Đặc điểm chung : - Test phân tích nước tiểu 10 thơng số ( Urine Reagent Strips viết tắc :URS)là phim nhựa mà vùng thuốc thử khác gắn chặt vào - Sản phẩm sử dụng độc lập - Một test URS cung cấp thông số sau : Glucose ,Bilirubine, keton ( Acid acetoacetic) ,Specific Gravity ,Blood, pH ,Protein , Urobilinogen ,Nitrite, leukocyte Acid ascorbic mẫu nước tiểu - Test URS cho thơng tin chuyển hóa đường, chức thận , chức gan,sự cân acid- bazơ vi trùng 1.2 Nguyên tắc thông số: 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 Glucose : Xét ghiệm dựa enzym tham gia phản ứng gồm có Glucose oxidase enzym peroxidase với chất tạo màu potassium iodine Nếu có diện glucose nước tiểu chuyển từ màu xanh sang màu nâu nhạt – nâu – nâu đen Bilirubin : Xét nghiệm dựa kết hợp cuả bilirubin nước tiểu với dichloroaniline môi trường acid Nếu có diện Bilirubin mẫu nước tiểu chuyển màu từ trắng vàng tới đỏ nâu Ketone: Xét nghiệm dựa phản ứng acetoacetic nước tiểu với Sodium nitroprussside mơi trường trung tính Nếu có diện ketone mẫu nước tiểu chuyển từ màu hồng da bị (âm tính) sang màu hồng tía (dương tính) Specific Gravity : Tỉ trọng nước tiểu tỉ lệ với số lượng , tỉ trọng trọng lượng chất hòa tan nước tiểu Xét nghiệm tỉ trọng phản ánh nồng độ ion nước tiểu Đo tỉ trọng nước tiểu đánh giá khả đặc pha lõang thận Với diện chất thị màu (xanh bromothymol) nồng độ chất điện ly tạo màu từ xanh lục qua xanh đến vàng nâu Tỉ trọng nước tiểu bình thường 1.003 –1.030 Khi nước tiểu có pH >7 tỉ trọng đo được cộng thêm 0,005 Khi có diện protein 100 – 500 mg/dl nước tiểu nhiễm toan chuyển hóa tỉ trọng nước tiểu có khuynh hướng gia tăng Tỉ trọng nước tiểu vượt gam màu ( nồng độ glucose niệu > 1000 mg/dl Tỉ trọng nước tiều giảm 1.005 bệnh đái tháo nhạt Máu : Trang 18 Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở Xét nghiệm đo lượng hồng cầu, hemoglobin tự từ hồng cầu ly giải myoglobin Xét nghiệm dựa nguyên tắc hoạt động hemoglobin giống peroxidase, giấy thử biểu diễn hai dạng đốm lấm chấm màu thay đổi màu ( hồng cầu tươi biểu thị ô thuốc thử xuất đốm lấm chấm tương ứng thay đổi màu ) Một hợp đốm lấm xảy có 250 hồng cầu /ml Âm tính giả xảy xuất formalin mẫu thử Dương tính giả lây nhiễm mẫu thử nước tiểu từ máu kinh nguyệt phụ nữ, tỉ trọng nước tiểu cao , tập thể dục nặng nhiều nước , vitamin có khả tạo chất oxy hóa với nồng độ cao 1.2.6 Protein Xét nghiệm dựa nguyên tắc thay đổi nồng độ protein phụ thuộc vào số chất thị pH Chất thị đặc biệt nhạy với albumin globulin , hemoglobin ,protein Bence Jones ,mucoprotein Phản ứng có độ nhạy với lượng protein khoảng 10 mg/dl Do nước tiểu người bình thường khơng phản ứng với giấy thử tìm protein Phản ứng dương tính giả xảy với mẫu nước tiểu kiềm (pH> 9) , số chất sát trùng , tỉ trọng nước tiểu cao mẫu thử sau xoa bóp tuyến tiền liệt, v…v… 1.2.7 pH nước tiểu : Xét nghiệm pH nước tiểu dựa nguyên tắc chất thị màu kép đỏ methyl xanh bromothymol , kỹ thuật cho màu sắc phân biệt rõ ràng với thay đổi pH từ - Xác định pH nước tiểu giúp theo dõi điều trị nhiễm trùng niệu sỏi đường tiểu Nước tiểu xuất , bình thường có pH toan khoảng 5,8 –6,2 Nước tiểu kiềm (pH> 9) nghĩ đến nhiểm trùng nhóm vi khuẩn phân giải urê : Proteus sp, dòng Klebsiella sp , Pseudomonas … sinh urease gây nên pH nước tiểu kiềm 1.2.8 Các bạch cầu ( leukocytes) Xét nghiệm dựa nguyên tắc : Sự diện enzym esterase bạch cầu có hạt (granulocyte) Các enzym có tác dụng thủy phân este indoxyl , indoxyl giải phóng phản ứng với muối diazonium sản phẩm có màu tím Phản ứng khơng bị ảnh hưởng có mặt vi khuẩn , trichomonas , hồng cầu có mặt nước tiểu Tuy nhiên độ nhạy xét nghiệm giảm theo thời gian sau lấy mẫu, ly giải bạch cầu 1.2.9 Nitrit : Nước tiểu bình thường khơng chứa nitrit, nhiên nhiều loại vi khuẩn gram âm biến đổi nitrat thành nitrit ,do xét nghiệm sử dụng để phát vi khuẩn niệu Xét nghiệm dương tính với lượng nitrit từ 0,06 – 0,1 mg/dl Một xét nghiệm dương tính với nitrit phụ thuộc ba yếu tố : (1) diện đủ số lượng vi khuẩn khử nitrat, (2) diện nitrit nước tiểu , (3) vi khuẩn tiếp xúc với nước tiểu khoảng thời gian thỏa đáng (> giờ) 1.2.10 Urobilinogen : Xét nghiệm dựa nguyên tắc muối diazodium phản ứng tức với Urobilinogen để tạo nên chất azo có màu đỏ Xét nghiệm đặc hiệu Urobilinogen không bị ảnh hưởng yếu tố gây nhiễu Kết khơng có màu có màu nhạt màu nồng độ urobilinogen mg/dl xem bình thường Trang 19 Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở 1.3 Thực hành : Phân tích mẫu nước tiểu với giấy nhúng 10 thơng số ( nhóm –3 mẫu nước tiểu) 10 Thông số\ mẫu 01 – Glucose 02 – Bilrubine 03 – Ketone 04- Specific Gravity 05 – Blood 06 – pH 07 – Protein 08 – Urobilinogen 09 – Nitrite 10 – Leukocytes Mẫu 01 Mẫu 02 THE END PHỤ LỤC BÀI 01 : HÓA HỌC GLUCID BÀI 02 : HÓA HỌC LIPID BÀI 03: HÓA HỌC PROTID Trang 20 Mẫu 03 Bộ môn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở BÀI 04: ENZYM BÀI 05: CHUYỂN HÓA GLUCID BÀI 06: CHUYỂN HÓA LIPID BÀI 07 : CHUYỂN HÓA PROTID BÀI 08: XÉT NGHIỆM NƯỚC TIỂU Tài liệu tham khảo : Thực tập hóa sinh học –Khoa Y –Đại học Y Dược TPHCM Thực tập hóa sinh – BM Hóa Sinh – Đại học Y Hà Nội Trang 21 ... 01 : HÓA HỌC GLUCID BÀI 02 : HÓA HỌC LIPID BÀI 03: HÓA HỌC PROTID Trang 20 Mẫu 03 Bộ mơn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở BÀI 04: ENZYM BÀI 05: CHUYỂN HÓA GLUCID BÀI 06: CHUYỂN HÓA LIPID... HÓA LIPID BÀI 07 : CHUYỂN HÓA PROTID BÀI 08: XÉT NGHIỆM NƯỚC TIỂU Tài liệu tham khảo : Thực tập hóa sinh học –Khoa Y –Đại học Y Dược TPHCM Thực tập hóa sinh – BM Hóa Sinh – Đại học Y Hà Nội Trang... hệ số (Factor) • kỹ thuật thực : 1.1 Phương pháp hóa học : Dùng phản ứng hóa học đặc hiệu cho chất cần xác định Trang 11 Bộ môn Xét nghiệm Tài liệu thực hành hóa sinh sở Phương VD : Định lượng