Bài giảng Thực hành Hóa sinh học - ThS. Cao Ngọc Minh Trang

Bài giảng Thực hành Hóa sinh học gồm các nội dung chính như: Phản ứng biuret xác định liên kết peptid; Biến tính protein; Phương pháp sorensen; Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme; Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa và kìm hãm đến hoạt tính của enzyme;... Mời các bạn cùng tham khảo!

Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ NHỮNG ĐIỂM CẦN CHÚ Ý TRONG THỰC HÀNH HÓA SINH I Đối với sinh viên thực tập - Mỗi nhóm thực tập phải chịu trách nhiệm về: trật tự, an toàn, dụng cụ, hóa chất kết thí nghiệm cho tập thực tập - Sinh viên phải có mặt phịng thí nghiệm qui định, phải có mặt phịng thí nghiệm suốt thời gian thực tập Sinh viên đến trễ 15 phút không vào phịng thí nghiệm Khi kết thúc thí nghiệm sinh viên phải báo cáo kết với giáo viên hướng dẫn trước lúc - Sinh viên vắng mặt phải có giấy phép phải xin thực tập bù bữa khác - Sinh viên phải xem kỹ thực tập trước vào phịng thí nghiệm - Mỗi nhóm thực tập cử sinh viên đại diện ký nhận mượn dụng cụ: kiểm tra tình hình dụng cụ (thiếu, hỏng, vỡ) báo cáo cho giáo viên hướng dẫn Sinh viên phải rửa dụng cụ trước sau thực tập Kết thúc buổi thực tập nhóm phải lau dọn, làm chỗ nhóm làm thí nghiệm, dụng cụ bị mát, hư hỏng phải báo cho phụ trách phịng thí nghiệm biết - Mỗi buổi thực tập, nhóm trực nhật có nhiệm vụ: nhắc nhở nhóm dọn vệ sinh, kiểm tra điện, nước cửa trước - Mỗi nhóm sinh viên làm báo cáo kết theo yêu cầu thực tập, nộp kết cho giáo viên hướng dẫn vào cuối buổi thực tập buổi - Kết thúc thực tập có kiểm tra kết đánh giá cho điểm II Đối với phịng thí nghiệm Cẩn thận tiến hành thí nghiệm, khơng sử dụng máy móc, dụng cụ chưa biết rõ cách sử dụng Phải hiểu biết rõ tính chất hóa chất để tránh tai nạn đáng tiếc Tất chai lọ đựng hóa chất có nhãn, dùng phải đọc kỹ tên nồng độ, dùng xong phải đậy nút để lại chỗ cũ Phần lớn hóa chất độc nên phải cẩn thận Đối với chất kiềm, acid đậm đặc phải lưu ý: - Không hút miệng - Phải dùng ống đong bình nhỏ giọt ThS Cao Ngọc Minh Trang Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ - Phải đổ acid kiềm vào nước cần pha loãng chúng - Phải đặt nghiêng miệng ống nghiệm cốc phía khơng có người - Khi acid bị đổ ngồi cho nhiều nước để làm loãng acid Khi theo dõi dung dịch sôi không đưa mặt gần hay để chất lỏng (chất kiềm) vào cốc phải đưa xa Khi đun chất lỏng ống nghiệm hay cho acid, kiềm vào phải đặt ống nghiệm nghiêng góc 45 độ Khi đung phải lắc hướng miệng ống nghiệm phía khơng có người Khi làm việc với chất dễ cháy: Khi sử dụng chất dễ cháy ether, xăng, benzene, chloroform, natri, kali cần lưu ý: - Không dùng lửa tránh xa lửa - Không để chất dễ cháy bên cạnh nguồn sinh nhiệt (chất dễ cháy, dễ bốc làm nổ máy hay bật nút, bốc gặp lửa cháy, lửa xa) - Khi chữa cháy phải bình tĩnh dập tắt lửa khăn ướt hay bình chữa cháy Khi làm việc với dụng cụ thủy tinh: - Kiểm tra dụng cụ kỹ trước dùng - Tránh đổ vỡ - Dụng cụ dùng cho việc Khi đun, đun dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt - Dụng cụ phải rửa trước sau sử dụng - Không dùng dụng cụ thủy tinh, chai lọ để chứa chất kiềm mạnh acid đậm đặc có tác dụng bề mặt ăn mòn thủy tinh HF Khi làm việc với dụng cụ điện sử dụng điện tay phải khô, chỗ làm việc phải khô Kiểm tra kỹ nguồn điện dây dẫn điện sử dụng III An tồn phịng thí nghiệm hóa sinh Những tai nạn xảy phịng thí nghiệm nói chung labo hóa sinh nói riêng bao gồm: - Nhiễm khuẩn, ký sinh trùng virus từ mẫu bệnh phẩm - Tai nạn gây hóa chất độc hóa học, chất ăn mịn, thủy tinh bị gẫy hay bị điện giật ThS Cao Ngọc Minh Trang Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ - Cháy nổ hóa chất hay dung môi dễ cháy, dễ nổ - Để đảm bảo an toàn, hạn chế tai nạn làm việc phịng thí nghiệm cần phải ý điểm sau đây: Tránh bị nhiễm khuẩn Đối với cá nhân: - Rửa tay xà phòng sau làm thí nghiệm - Mặc áo chồng phịng thí nghiệm - Khơng ăn uống, hút thuốc phịng thí nghiệm Khơng để thức ăn hay đồ uống tủ lạnh phịng thí nghiệm Đối với mẫu bệnh phẩm: Các bệnh phẩm mẫu xét nghiệm lấy từ bệnh nhân thường gây nhiễm khuẩn, virus viêm gan, ký sinh trùng … Vì vậy: - Khơng hút trực tiếp bệnh phẩm pipet, dùng pipet có lắp bóp cao su - Nếu ống ly tâm đựng bệnh phẩm bị vỡ ly tâm, phải dùng kẹp để gắp mảnh vỡ - Khử trùng dụng cụ bị nhiễm khuẩn sau làm xét nghiệm theo qui định phần rửa dụng cụ An toàn sử dụng hóa chất thuốc thử Đối với chất dễ cháy dung môi (ete, toluene, methanol, ethanol, aceton) số hóa chất khác có ghi biểu tượng tránh lửa nhãn: - Trước mở nút phải tránh xa lửa trần từ – m - Không đun trực tiếp lửa, phải đun cách thủy bếp điện kín - Đối với chất ăn mòn acid (H2SO4, HNO3, CCl3COOH, H3PO4 …) kiềm (NaOH, KOH): - Không hút trực tiếp mồm, phải dùng pipet tự động có lắp bóng cao su - Khi đổ dung dịch vào chai hay ống nghiệm phải từ từ, thận trọng, làm tầm mắt để tránh dung dịch bị bắn vào mắt - Khi hòa tan chất ăn mịn thể đặc vào nước Ví dụ: hịa NaOH vào nước hay hịa lỗng acid đặc vào nước cần phải tiến hành thận trọng phản ứng tỏa nhiệt Đặc biệt cần ý hòa loãng acid, phải đổ acid vào nước, đổ từ từ, tuyệt ThS Cao Ngọc Minh Trang Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ đối không đổ nước vào acid, cần đổ lượng nhỏ nước vào acid gây vỡ bình thủy tinh Đối với chất độc chất gây chết người gây bệnh nặng ngửi hay nuốt phải dính vào da Ví dụ chất độc phổ biến phịng thí nghiệm như: kali cyanua, nitrat thủy ngân II, natri azid, natrinitropusiat, thiosemicarbazid, chloroform, methanol, acid clohydric…: - Cần thận trọng thao tác với chất độc - Những chất độc phải cất vào tủ khóa sau sử dụng Khơng để tự bàn thí nghiệm hay đĩa cân Những chất oxy hóa (chlorat, pechlorat, peroxyd mạnh, kali dichromat, acid chromic…) phải thao tác cẩn thận chúng gây nguy hiểm cho da mắt Những hóa chất gây ung thư: chất có khả gây ung thư hít hay nuốt phải, dính vào da Ví dụ: benzen, benzidin, o-toludin (khác với o – tuluidin), α- β-naphtylamin, nitrosamin, nitrosophenyl … Khả gây ung thư chất tỷ lệ với thời gian tiếp xúc nồng độ hóa chất gây ung thư Vì phải cẩn thận, nên dùng găng tay trang tiếp xúc với chúng IV Các biện pháp sơ cấp cứu phịng thí nghiệm Sơ cấp cứu biện pháp tạm thời trường hợp thương tích nhẹ trước đưa bệnh nhân đến bệnh viện như: Bỏng a Bỏng nhiệt (hay vật nóng) - Bỏng nhẹ: Lấy vải gạc y tế tẩm dung dịch acid picric bão hòa đắp lên mặt vết bỏng - Bỏng nặng: Đắp nhẹ vải gạc y tế tẩm dung dịch acid picric lên vết bỏng, sau chuyển bệnh viện b Bỏng hóa chất Việc trước tiên ngâm vết thương vào chậu nước to để vết thương vòi nước chảy thật nhẹ Sau trung hịa hóa chất Chú ý trường hợp sau: - Bỏng acid: Đắp vải gạc y tế tẩm dung dịch bicarbonate natri 8% - Bỏng kiềm: Đắp vải gạc y tế tẩm dung dịch acid picric 3% ThS Cao Ngọc Minh Trang Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ Tai nạn mắt - Acid hay brom vào mắt: Rửa mắt tức khắc nhiều lần nước sạch, sau tẩm mắt dung dịch bicarbonat natri 1% - Chất kiềm vào mắt: Xử lý tẩm mắt dung dịch acid boric 1% Ngộ độc Khi bị chất độc vào miệng: - Acid: Xúc miệng nhiều lần dung dịch bicarbonate natri 1% - Kiềm: Xúc miệng nhiều lần dung dịch acid 1% - Các hóa chất khác: Xúc miệng nhiều lần nước lạnh Nhiễm độc Đưa nạn nhân nơi thống khí, nới rộng quần áo cho dễ thở Hô hấp nhân tạo lúc di chuyển đến bệnh viện Điện giật Trước hết ngắt cầu dao điện có liên quan đến phịng thí nghiệm Nới rộng quần áo nạn nhân sau đem nơi thống Hơ hấp nhân tạo chờ chuyển đến bệnh viện trường hợp nặng Hỏa hoạn - Ngọn lửa nhỏ: dập tắt khan, vải bố ướt hay cát - Lửa bắt đầu cháy quần áo: lăn vài vòng đất để dập tắt lửa, bạn lấy vải ướt trùm lên chỗ cháy ép sát lửa tắt Tránh chạy hoảng - Dùng bình chửa cháy trước phịng thí nghiệm để dập lửa Lưu ý: Sinh viên phải báo cho nhân viên phòng thí nghiệm giáo viên hướng dẫn cố phịng thí nghiệm Xử lý chất thải - Hóa chất thừa: Phần lớn thuốc thử, hóa chất thừa đổ vào bể rửa xả nước Một số hóa chất kiềm acid phải trung hòa trước đổ vào bể rửa - Bệnh phẩm thừa: Những bệnh phẩm dùng để làm xét nghiệm máu, nước tiểu, dịch não tủy … thường chất truyền nhiễm Sau làm xét nghiệm, mẫu bệnh phẩm thừa lại phải hủy cẩn thận để tránh lây lan Phương pháp ThS Cao Ngọc Minh Trang Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ đơn giản bảo đảm chôn đốt thành tro (kể dụng cụ đựng khơng cần thu hồi) - Hóa chất bệnh phẩm nguy hiểm: hoá chất độc có khả gây ung thư, gây nổ cần chứa vào bình chuyên dụng xử lý theo phương thức riêng CÁC DỤNG CỤ THƯỜNG DÙNG TRONG THỰC TẬP HĨA SINH Cách rửa dụng cụ: • Cần phải biết tính chất chất làm bẩn dụng cụ để chọn phương pháp rửa trường hợp riêng (trong nước nóng hay nước lạnh, dd kiềm, muối hay acid dung mơi hữu cơ) • Các dụng cụ sau rửa ngâm vào dd sulfocromic hỗn hợp K2Cr2O7 10% acid sulfuric đđ thể tích ngày Sau đó, đem rửa với nước máy tráng lần với nước cất, xong sấy khô tủ sấy dụng cụ Ống nghiệm (tube) • Có thể tích khác nhau, hình trụ ( Ø = 16, 18,…) • Lưu ý đun nóng dd ống nghiệm: dd không đầy 1/3 ống nghiệm ống giữ nghiêng 450, lắc Khơng đun nóng đáy ống nghiệm mà lửa phải để vào thành ống nghiệm Ống hút (pipette) • Loại có vịng mờ đầu ống: dung tích ống gồm giọt cuối dính ống nên phải thổi giọt • Loại có bầu an tồn: dùng để hút dd độc • Loại có hai vạch: thể tích ghi ống thể tích vạch • Loại thơng thường có chia độ Ống chuẩn ( burette) • Được gắn giá có khóa để điều chỉnh lượng chất lỏng chảy ống có phân độ ThS Cao Ngọc Minh Trang Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ Ống đong (eprouvette) • Có dung tích thay đổi từ 5ml đến 2l, có mặt đáy phân độ gần thể tích tồn phần • Không dùng ống đong để chia lượng nhỏ Bình nón ( erlenmeyer) • Được sử dụng rộng rãi thí nghiệm phân tích • Bình nón có nút mài gọi bình xác định số iode Phễu chiết hay bình lóng • Dùng để tách riêng chất lỏng khơng hịa tan vào • Khi lắc bình lóng tay phải giữ nút đầu đầu bình Bình hút ẩm • Là dụng cụ thủy tinh có thành dày có nắp dùng để làm khô từ từ để bảo quản chất dễ hút ẩm từ khơng khí Phần bình có đặt chất hút ẩm • Khi mở nắp bình phải đẩy nắp phía tránh nhấc nắp lên cao Ống sinh hàn • Là dụng cụ để làm lạnh ngưng • Khi nối ống sinh hàn cần tuân theo nguyên tắc: nước vào từ đầu thấp bên từ đầu phía Bình định mức (fiole jaugé) • Dùng để pha loãng dd đến thể tích xác định để hịa tan chất thể tích xác định dung mơi thích hợp Chén nung (creuset) • Dùng để nung chất khác nhau, để đốt hợp chất hữu xác định hàm lượng tro • Có thể đốt trực tiếp lửa mà không cần lưới amian ThS Cao Ngọc Minh Trang Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ Chương I: Bài 1: PROTEIN PHẢN ỨNG BIURET XÁC ĐỊNH LIÊN KẾT PEPTID Trong mơi trường kiềm, liên kết peptide protein phản ứng với Cu2+ tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ dạng anion Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide Một số hợp chất có hai nhóm amid Biuret, oxamid cho phản ứng Biuret dương tính Phản ứng biure thường ứng dụng để định lượng protein có màu bền vững ổn định Nguyên liệu hóa chất: - Dung dịch protein trứng khoảng 1% (Pha lỗng lịng trắng trứng với 15 thể tích nước cất, lọc qua vài lần vải gạc, bảo quản 4oC Khi dùng pha loãng 0,1%) - Dung dịch gelatin 0,1% nước - Dung dịch glycin 0,1% nước - Dung dịch CuSO4 1% nước - Dung dịch NaOH 10% nước Dụng cụ: - Ống nghiệm, giá ống nghiệm, cặp ống nghiệm - Pipet Pasteur Cách tiến hành: Cho vào ống nghiệm đánh số: Dung dịch protein trứng 0,1% (giọt) Dung dịch gelatin 0,1% nước (giọt) Dung dịch glycin 0,1% nước (giọt) Dung dịch NaOH 10% nước (giọt) 3 Dung dịch CuSO4 1% nước (giọt) 1 Nhận xét màu sắc, giải thích thí nghiệm ThS Cao Ngọc Minh Trang Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ Bài 2: BIẾN TÍNH PROTEIN Sự biến tính protein ứng dụng xét nghiệm lâm sàng, kiểm nghiệm thuốc thực nghiệm hóa sinh như: - Kết tủa protein nguyên liệu sinh vật để tiếp tục nghiên cứu cấu trúc tính chất sinh học chúng - Định tính định lượng protein dịch chiết dịch sinh vật (đặc biệt phản ứng xác định protein niệu để thăm dò chức thận) - Giải độc muối kim loại nặng (Hg, Cu, Pb) protein (trứng, sữa) trường hợp thể chưa kịp hấp thu sử dụng phòng bệnh cho người phải tiếp xúc với hóa chất Thơng thường biến tính protein khơng thuận nghịch, số trường hợp loại bỏ tác nhân gây biến tính protein giữ cấu dạng tính chất ban đầu Thuốc thử vật liệu thí nghiệm: - Dung dịch protein trứng khơng có NaCl (Lọc lòng trắng trứng gà qua vải thưa Trộn lẫn thể tích lịng trắng với 15 thể tích nước cất Trộn kỹ lọc lại thu dung dịch protein trứng khoảng 1% Bảo quản 4oC) - Dung dịch acid acetic 1% 10% - Dung dịch NaOH 10% - Dung dịch NaCl bão hòa - Acid nitric đặc - Dung dịch acid trichloracetic 10% - Dung dịch acid sulfosalicylic 20% - Dung dịch CuSO4 5% nước - Dung dịch Pb(CH3COO)2 5% nước - Ethanol 96o - Aceton Dụng cụ: - Ống nghiệm nhỏ - Pipet 10mL ThS Cao Ngọc Minh Trang Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ - Pipet Pasteur - Quả bóp cao su – mL - Phễu nhỏ - Giấy lọc 2.1 Biến tính protein nhiệt độ Protein bị kết tủa đun sơi mơi trường trung tính hay acid yếu bị lớp áo nước phần lớn protein có pI  (trừ protamin histon có chứa nhiều acid amin kiềm nên có pI  8), cho thêm chất điện giải làm trung hòa điện tích gây tủa protein dễ dàng Tiến hành: Dùng ống nghiệm ghi số: Thuốc thử Protein trứng khơng có NaCl (mL) CH3COOH 1% (giọt) 1 1 5 CH3COOH 10 % (giọt) Dung dịch NaCl bão hòa (giọt) Dung dịch NaOH 10% (giọt) Đun sôi ống nghiệm nhận xét kết tủa 2.2 Biến tính protein acid vô mạnh Dưới tác dụng acid vô đậm đặc, protein bị kết tủa Tủa hòa tan trở lại cho thừa acid, trừ acid nitric Vì HNO sử dụng để định tính protein nước tiểu Tiến hành: Tủa protein HNO3 H2SO4 ThS Cao Ngọc Minh Trang 10 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ Bài 3: XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ Các loại đường khử có khả khử Ferricyanur (Fe3+) thành Ferrocyanur (Fe2+) ion có màu xanh đậm (xanh prusse) Do ta dùng phương pháp so màu để định lượng đường Chuẩn bị mẫu: 1g nguyên liệu (thơm, nho, chuối) + H2SO4 10% (ngập mẫu), đun cách thủy khoảng 1giờ, lấy cho NaOH vào để trung hịa đến pH =7, lọc có cặn ta dung dịch mẫu Lấy 1ml dd mẫu pha loãng thành 30 – 100ml dd dùng để xác định đường khử Dụng cụ: - Ống nghiệm, giá ống nghiệm, cặp ống nghiệm, - Bếp đun cách thủy, cối giã, chày - Pipet 1ml, pipet 2ml - Cốc 250ml, cốc thủy tinh 500 ml - Máy quang phổ - Giấy lọc, bình tam giác, ống đong 100ml Hóa chất: • Dung dịch glucose 0,02mg/ml • Nước cất, nước đá • Thuốc thử A (Na2CO3 + KCN / H2O cất) • Thuốc thử B (K3Fe(CN)6 / H2O cất) • Thuốc thử C (Fe[NH4(SO4)2] + Lauryl sulfat / H 2SO4) Cách tiến hành Thực ống nghiệm theo mẫu sau: ThS Cao Ngọc Minh Trang 21 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ Số ống ml glucose 0,02mg/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 ml nước cất 1 0,95 0,9 0,8 0,6 0,4 ml đường định nồng độ Nồng độ đường ống 0 12 X1 X2 chuẩn (g/ml) Dùng bóp cao su cho vào ống ml thuốc thử A ml thuốc thử B, lắc đều, đun sôi cách thủy 15 phút Làm lạnh, thêm ml thuốc thử C, lắc đều, để yên 15 phút Đo Mode “Absorbance” với độ dài sóng 690 nm Vẽ đồ thị theo nồng độ đường độ hấp thu ThS Cao Ngọc Minh Trang 22 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ Chương 4: VITAMIN Bài 1: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN A Dưới tác dụng H2SO4 đậm đặc, vitamin A bị nước tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu khơng bền Sau biến đổi nhanh thành màu đặc trưng lipocrom (nâu đen) Nguyên liệu hóa chất - Dung dịch H2SO4 đđ - Cloroform đđ - Dầu cá Dụng cụ: - Ống nghiệm, kẹp ống nghiệm, bình tia Cách tiến hành: Nhỏ giọt dầu cá hòa tan 25 giọt Cloroform, sau cho giọt H2SO4 đđ vào lắc Nhận xét kết Bài 2: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN C Khi trộn dd acid ascorbic với dd xanh metylen dd màu Phản ứng xảy acid ascorbic bị oxy hóa thành acid dehydro ascorbic xanh metylen trở thành dạng khơng màu Hóa chất: - Dd Vitamin C - Xanh metylen 0,01% - Dd NaOH 5% Dụng cụ: - Ống nghiệm, kẹp ống nghiệm, bình tia, ThS Cao Ngọc Minh Trang 23 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ - Bếp đun cách thủy - Nhiệt kế, bình tia, cốc 250ml Cách tiến hành: - Ống 1: 1ml dd vitamin C - Ống 2: 1ml nước cất Thêm vào ống – giọt xanh metylen – giọt NaOH 5% Lắc Quan sát màu Nếu khơng có thay đổi màu, đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy 37 – 400C Quan sát màu dd ống nghiệm sau vài phút Giải thích ghi kết Bài 3: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C Để xác định hàm lượng vitamin C nguyên liệu phương pháp chuẩn độ iod người ta cho tất acid ascorbic bị oxy hóa iod, phần iod cịn thừa cho màu xanh với dung dịch tinh bột Điều nói lên phản ứng kết thúc Nguyên liệu hóa chất: - Dd HCl 5% - Dd I2 0,01N - Dd tinh bột 1% - Chanh trái, bưởi, cam Dụng cụ: - Cối sứ, chày sứ - Bình tam giác 250ml - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml - Cốc thủy tinh 250ml, 500ml - Burette 25ml, bình định mức 50ml - Dao nhỏ ThS Cao Ngọc Minh Trang 24 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ Cách tiến hành: - Cho vào cối sứ 5g thịt trái chanh 10ml HCl 5%, nghiền nhỏ đến dạng đồng thể, dùng nước cất chuyển toàn dịch chiết đồng thể vào bình định mức 50ml, thêm nước cất đến vạch Lắc đều, lọc cặn vào tam giác 250ml, ta có dd mẫu hay dd nguyên liệu - Nạp dd I2 0,01N vào burette - Hút 20 ml dd nguyên liệu cho vào bình nón, thêm - 10 giọt hồ tinh bột 1% - Chuẩn độ dung dịch I2 0,01N xuất màu xanh lam nhạt - Lập lại chuẩn độ lần, lấy kết trung bình ta V(ml) số ml I2 0,01N dùng để chuẩn độ vitamin C Tính kết quả: V V1 0,00088 100 X (%) = V2 m X: hàm lượng vitamin C (%) m: lượng mẫu thí nghiệm (5gr) 0,00088: số gram acid ascorbic ứng với 1ml dd I2 0,01N V1: thể tích dd mẫu (50ml) V2: thể tích dịch mẫu lấy để xác định (20ml) V: số ml dd Iode 0,01N dùng để chuẩn độ Tính hàm lượng vitamin C mẫu thí nghiệm ThS Cao Ngọc Minh Trang 25 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ Chương 5: LIPIT XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ PEROXIDE Bài 1: Khi có oxy khơng khí acide béo có thành phần mỡ, acide béo không no dễ dàng bị oxy hóa phần tạo thành peroxide Hiện tượng xảy mỡ bị ôi hay bị khô.Việc xác định số peroxide dựa vào phản ứng sau: R-CH-CH-R’-COOH + 2KI + 2CH3COOH O- O R-CH-CH-R’-COOH + I2 + 2CH3COOK + H2O O Lượng iode giải phóng chuẩn độ dung dịch natri hiposulfit: 2Na2S2O3 + I2 = 2NaI + Na2S4O6 Theo lượng hyposulfite cần để liên kết iode giải phóng ra, tính số peroxide Chỉ số peroxide số gam iode giải phóng peroxide có 100g lipide Nguyên liệu hóa chất: - Dầu thực vật - Acide acetide đặc - Clorofom tinh khiết - Dung dịch KI bão hòa (pha dung ngay) - Dung dịch Na2S2O3 0,002N - Dung dịch tinh bột 0,5% Dụng cụ: - Bình tam giác - Pipet , ống đong - Burrette ThS Cao Ngọc Minh Trang 26 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ Cách tiến hành Lấy bình tam giác đánh số thứ tự 1, sau làm sau: - Cho vào bình (bình thí nghiệm): 2g dầu thực vật - Cho vào bình (bình kiểm tra): 2ml nước cất - Thêm vào bình 20ml hỗn hợp acide acetic đặc: clorofom (tỷ lệ 2:1) thể tích, 5ml dd KI bão hòa, lắc đều, đậy nút đặt chỗ tối 10 phút - Sau them 30ml nước cất, vài giọt dd tinh bột 0,5%, chuẩn độ iode giải phóng dd Na2S2O3 0,002N đến màu xanh Chỉ số peroxide tính theo cơng thức: (A – B) 0,0002538.100 X= A Trong đó: A: số ml Na2S2O3 dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm B: số ml Na2S2O3 dùng để chuẩn độ bình kiểm tra 0,0002538 số gam iode tương ứng với 1ml dd Na2S2O3 0,002N a: số gam dầu lấy để xác định thí nghiệm Tính số peroxide thí nghiệm ThS Cao Ngọc Minh Trang 27 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ Bài 2: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ IOD CỦA CHẤT BÉO Chỉ số iod chất béo số gram iod kết hợp với 100gr chất béo Xác định số iod dựa khả iod kết hợp với acid béo chỗ liên kết đơi, nối đơi lipit cho phản ứng cộng với nguyên tử nhóm halogen Do đó, ta cho chất béo tác dụng với lượng thừa iod xác định lượng thừa giúp ta suy số iod Như số iod xác định tổng quát acid béo không no chất béo Nguyên liệu hóa chất: - Dầu ăn - Cồn 960 - Dd I2 0,1N - Dd Na2S2O3 0,1N chuẩn - Dd tinh bột 1% Dụng cu: - Bình tam giác có nút nhám - Pipet 2ml, pipet 1ml, pipet 10 ml - Cốc 100ml, 250ml - Burette, ống đong Cách tiến hành: Lấy bình tam giác có nút nhám: - Cho vào bình (mẫu trắng): ml nước cất - Cho vào bình (mẫu nguyên liệu): 2g dầu ăn - Thêm vào bình 10ml cồn 960 lắc đều, thêm 10ml I2 0,1N - Để yên tối từ 10 đến 15 phút, sau chuẩn độ Na2S2O3 0,1N đến dung dịch có màu vàng nhạt thêm vào bình 1ml dd tinh bột 1%, tiếp tục chuẩn độ đến màu xanh - Lập lại thí nghiệm lần ThS Cao Ngọc Minh Trang 28 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ Tính số iod: ( B – A ) 0,0127 100 Chỉ số I2 = m Trong đó: A: số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ mẫu trắng B: số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ mẫu nguyên liệu m: trọng lượng mẫu tính gram 0,0127: số gram iod ứng với 1ml Na2S2O3 0,1N Giải thích tính số I2 thí nghiệm Bài 3: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ ACID CỦA CHẤT BÉO Chỉ số acid chất béo số miligram KOH cần thiết để trung hòa hết acid béo tự chứa 1gam chất béo Dùng KOH 0,1N để trung hòa acid béo tự nguyên liệu với phenolphtlein làm chất thị màu Nguyên liệu hóa chất: - Dầu ăn tinh luyện - Cồn tuyệt đối 980 - Dd KOH 0,1N chuẩn - Chỉ thị phenolphtalein 1% Dụng cụ: - Bình tam giác 250ml - Pipet 2ml, pipet 1ml, pipet 10 ml ThS Cao Ngọc Minh Trang 29 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ - Cốc 100ml, 250ml - Burette 25ml - Cân Cách tiến hành: Trong bình tam giác 250ml, cân khoảng từ 5gam dầu ăn thêm vào 50ml cồn 980 để hịa tan dầu ăn Đun nhẹ 600C nồi cách thủy, vừa đun vừa lắc Nạp dd KOH 0,1N vào burette Chuẩn độ nhanh KOH 0,1N chuẩn dung dịch ấm, với thị phenolphtalein 1% có màu hồng nhạt bền 30 giây Làm lập lại lần lấy thể tích trung bình Tính số acid: 5,61 V Chỉ số Acid = m 5,61: số mg KOH ứng với ml KOH 0,1N V: số ml KOH 0,1N dùng để chuẩn độ m: trọng lượng chất béo cân Giải thích tính số acide thí nghiệm ThS Cao Ngọc Minh Trang 30 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ Bài 4: XÁC ĐỊNH LIPIT TỔNG SỐ (LẮP BỘ SOXHLET, GIẢNG TRÊN MƠ HÌNH) Dùng dung mơi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipide từ nguyên liệu nghiền nhỏ Một số thành phần hòa tan chất béo trích ly theo, bao gồm sắc tố, vitamin tan chất béo, chất mùi… nhiên hàm lượng chúng thấp Do có lẫn tạp chất, phần trích ly gọi lipide tổng hay lipide thơ Có phương pháp để xác định: • Phương pháp xác định trực tiếp: chiết xuất lipide khỏi nguyên liệu cân trực tiếp • Phương pháp xác định gián tiếp: chiết xuất lipide khỏi nguyên liệu cân lại nguyên liệu Nguyên liệu hóa chất: - Dung môi chiết xuất lipide thường dùng ether etylic - Nguyên liệu nghiền nhỏ, sấy khô đến khối lượng khơng đổi Thiết bị Soxhlet: - Bình cầu dung tích 100 – 300ml - Trụ chiết - Ống sinh hàn Cách tiến hành: - Chuẩn bị túi giấy lọc để đựng nguyên liệu dùng ống hình trụ đựng mẫu có sẵn (túi giấy lọc cắt hình chữ nhật, chiều dài gấp 2,5 lần chiều rộng, gấp thành túi trụ có đường kính bé trụ chiết) Túi sấy khô đến khối lượng không đổi cân cân phân tích (nếu xác định theo phương pháp gián tiếp) - Cân xác – 5g cho mẫu vào túi giấy Gấp kín mép túi, đặt túi có mẫu phân tích vào trụ chiết ThS Cao Ngọc Minh Trang 31 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ Phương pháp xác định trực tiếp: Trước chiết, bình cầu sấy khơ đến khối lượng khơng đổi Đặt bình cầu lên nồi cách thủy cho ete vào ½ thể tích bình Cho túi nguyên liệu vào trụ chiết Lắp trụ chiết vào bình cầu Cho dung mơi vào trụ chiết đến ngập túi nguyên liệu Mức dung môi đến phần ống xifon trụ chiết Lắp ống sinh hàn, ngâm nguyên liệu dung môi vài Đặt máy Soxhlet vào nồi cách thủy cho số lần dung môi rút từ trụ chiết xuống bình cầu khoảng 10 – 15 lần Thử lipide chiết hết chưa cách lấy vài giọt ete từ đầu cuối trụ chiết cho lên đĩa kính đồng hồ Cho bay hết ete Nếu khơng có lipide đĩa kính, xem lipide chiết hồn tồn Khi chiết xong, lấy bình cầu ra, lắp ống sinh hàn vào cất lấy ete Sấy bình cầu có chứa lipide (60 -700C 30 phút) đến khối lượng không đổi đem cân Tính kết quả: Hàm lượng lipide có 100g mẫu nguyên liệu: (a – b) 100 X= c X: hàm lượng lipide tính theo % a: khối lượng bình lipide (g) b: khối lượng bình (g) c: khối lượng mẫu tách lipide (g) ThS Cao Ngọc Minh Trang 32 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ Phương pháp xác định gián tiếp: Sau kết thúc thí nghiệm trên, lấy túi mẫu nguyên liệu khỏi bình chiết, cho bay hết dung môi, sấy khô đến trọng lượng không đổi Tính kết quả: Hàm lượng lipide có 100g mẫu nguyên liệu: (a – b) 100 X= c X: hàm lượng lipide tính theo % a: khối lượng túi mẫu nguyên liệu trước chiết (g) b: khối lượng túi mẫu nguyên liệu sau chiết (g) c: lượng nguyên liệu lấy để xác định số chất béo (lipide) ThS Cao Ngọc Minh Trang 33 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ TÀI LIỆU THAM KHẢO PGS.TS Đào Kim Chi cộng (2015) Giáo trình Thực tập Hố Sinh Trường ĐH Dược Hà Nội Nguyễn Quang Vinh, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa (2007) Thực tập Hóa Sinh Học NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội ThS Cao Ngọc Minh Trang 34 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Cơng nghệ PHỤ LỤC Cách pha số loại thuốc thử hóa chất thực hành 1) Dung dịch phenolphtalein 1%: hòa tan 0,1g phenolphtalein ttrong 80ml ethanol 96% thêm nước cất vừa đủ 100ml 2) Thuốc thử Fehling: Fehling A : Fehling B = 1:1 ( pha trộn làm thí nghiệm) Fehling A: 40g CuSO4.5H2O định mức đến 1l Fehling B: 200g Natri Kali tartrate + 150g NaOH, định mức đến 1l 3) Dung dịch Lugol: ThS Cao Ngọc Minh Trang 35 ... nước - Dung dịch Pb(CH3COO)2 5% nước - Ethanol 96o - Aceton Dụng cụ: - Ống nghiệm nhỏ - Pipet 10mL ThS Cao Ngọc Minh Trang Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ - Pipet Pasteur - Quả bóp cao. .. Nghĩa (2007) Thực tập Hóa Sinh Học NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội ThS Cao Ngọc Minh Trang 34 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ PHỤ LỤC Cách pha số loại thuốc thử hóa chất thực hành 1) Dung... khơng màu Hóa chất: - Dd Vitamin C - Xanh metylen 0,01% - Dd NaOH 5% Dụng cụ: - Ống nghiệm, kẹp ống nghiệm, bình tia, ThS Cao Ngọc Minh Trang 23 Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ - Bếp đun