Bài giảng Thực hành Vi sinh vật đại cương

Bài giảng Thực hành Vi sinh vật đại cương cung cấp cho người học những kiến thức như: Quan sát hình thái vi sinh vật; Kỹ thuật ria cấy vi sinh vật. Mời các bạn cùng tham khảo!

8/30/2016 Bài 1: Quan sát hình thái vi sinh vật Thực hành Vi sinh vật đại cương Mục đích Giới thiệu kính hiển vi quang học Phương pháp làm tiêu nhuộm Phương pháp nhuộm màu Gram Quan sát tiêu nhuộm I Sử dụng kính hiển vi quang học (light microscope) • Làm quen với cấu tạo kính hiển vi quang học Nắm cách sử dụng • Học cách làm tiêu cố định phương pháp nhuộm Gram • Quan sát số hình thái vi khuẩn, nấm men, nấm mốc 1.1 Cấu tạo kính hiển vi quang học a Phần học • Thân kính: dịch chuyển lên xuống nhờ núm điều chỉnh lớn để đưa ảnh vật quan sát vào tiêu điểm - Bàn xoay (mâm kính): gắn phía thân kính, nơi gắn vật kính - Ống kính: Gắn phía thân kính, xoay quanh trục thẳng đứng tùy theo vị trí quan sát Phía ống kính có gắn thị kính - Bàn kính/khay kính: nơi để tiêu quan sát Trên bàn kính có kẹp giữ tiêu Dưới bàn kính có giá giữ tụ quang kính - Đế kính (chân kính): cấu tạo vững đỡ toàn KHV - Ốc điều chỉnh: gồm + Ốc điều chỉnh tiêu bản; + Ốc điều chỉnh vĩ cấp (điều chỉnh thô/điều chỉnh lớn); + Ốc điều chỉnh vi cấp (điều chỉnh tinh/điều chỉnh nhỏ) b Phần quang học  Bộ phận chiếu sáng: Tụ quang kính: gồm nhiều thấu kính ghép lại với nhau hội tụ tia sáng xuất phát từ nguồn svà tụ quang kính đen phản xạ lại qua gương Có loại tụ quang kính: Tụ quang kính sáng tụ quang kính đen Tụ quang kính sáng Tụ quang kính đen 8/30/2016 c Vật kính c Thị kính - gồm hệ thống thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn khoảng vài mm, đặt vỏ bọc kim loại - Chức năng: Tạo ảnh thực, phóng đại, ngược chiều với vật quan sát - Độ phóng đại vật nghiên cứu phụ thuộc vào tiêu cự độ cong thấu kính ngồi Độ cong lớn, tiêu cự ngắn độ phóng đại vật kính lớn - Các vật kính: 8x, 10x, 40x, 60x (vật kính khơ), 100x (vật kính dầu) - Gồm thấu kính: thấu kính mắt phía trên, thấu kính tụ phía Giữa hai thấu kính có chắn giữ lại tia sáng xung quanh, để tia sáng gần với trục quang qua  hình rõ nét (phóng đại thêm ảnh vật kính-vai trị giống kính lúp) - Các loại thị kính: 7x, 10x, 15x, 20x  Độ phóng đại mẫu quan sát tích số độ phóng đại vật kính với độ phóng đại thị kính 1.2 Giới thiệu số loại kính hiển vi khác a Kính hiển vi điện tử - KHV điện tử truyền qua (Transmission electron microscope – TEM): sử dụng chùm điện tử có lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng sử dụng thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (1.106 lần) Ảnh tạo huỳnh quang, hay film quang học, hay ghi nhận máy chụp kỹ thuật số - KHV điện tử quét (Scanning electron microscope – SEM): loại kính hiển vi điện tử truyền qua khác với TEM: chùm điện tử không truyền qua mẫu mà hội tụ thành chùm hẹp quét mẫu, cho phép ghi ảnh với độ phân giải cao Nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, nguyên tử, virus… Scanning transmission electron microscope (STEM) Phạm vi quan sát KHV quang học điện tử Kính HV điện tử truyền qua (TEM) SIGMA Advanced Analytical Scanning Electron Microscope SEM 8/30/2016 KHV huỳnh quang (fluorescence microscope) Kính hiển soi (stereoscopic microscope) • Kính hiển vi phản pha (Phase contrast microscopy-Nobel prize 1953): Ánh sáng xuyên qua vật thể suốt, không màutiêu khơng cần nhuộm • Kính hiển vi đen (dark field microscope): loại chùm tia sáng không phân tán từ ảnh vật vùng xung quanh vật quan sát thường tối Trái: quan sát với KHV quang học Phải: với KHV phản pha (40x) 1.3 Cách sử dụng kính hiển vi quang học C A D B A B C D Nấm men quan sát vơi KHV quang học Nấm men quan sát KHV đen Nấm men quan sát KHV phản pha Nấm men quan sát KHV huỳnh quang c Quan sát với vật kính dầu (100x) - Nếu dùng vật kính dầu ý: + Nhỏ giọt dầu soi kính vào vị trí vùng định quan sát tiêu (Hình A) + Hạ từ từ vật kính chạm nhẹ vào giọt dầu (Hình B) + Nhìn vào thị kính, nhẹ nhàng điều chỉnh ốc điều chỉnh vĩ cấp nâng vật kính lên thấy chớp ảnh vi trường  Khi nâng vật kính lên phải đảm bảo đầu vật kính ngập dầu soi (Hình C) + Điều chỉnh thêm ốc chỉnh vi cấp cho rõ nét a Chuẩn bị: - Kính hiển vi, dầu soi, dầu lau, sổ ghi chép, bút… - Chuẩn bị tiêu quan sát - Tư ngồi quan sát kính HV: ngồi ngắn, đặt sổ ghi chép bên tay phải (nếu thuận tay phải) b Quan sát với vật kính khơ: - Cắm điện bật cơng tắc đèn - Điều khiển kính tụ quang bàn tay trái: Nâng lên mức hợp lý; + Mở hệ thống chắn sáng tối đa điều chỉnh có tiêu để ảnh mẩu vật đẹp theo ý muốn - Đặt tiêu quan sát lên khay kính, điều chỉnh vị trí cần quan sát tiêu - Chọn vật kính quan sát: Ví dụ Nấm mốc 4x, 10x; Nấm men 40x - Sử dụng ốc điều chỉnh vĩ cấp để nâng tiêu lên sát với vật kính; Mắt nhìn vào thị kính, từ từ hạ vật kính xuống đến nhìn thấy chớp ảnh sử dụng ốc điều chỉnh vi cấp để chỉnh độ nét ảnh d Bảo quản sau sử dụng kính - Nâng vật kính lên lấy tiêu - Nếu vật kính dầu dùng khăn vải/giấy mềm tẩm dầu lau kính xylene lau nhẹ vào đầu vật kính cho thật - Đưa vật kính nhỏ vào vị trí tiêu - Tắt cơng tắc đèn, rút phích cắm khỏi ổ điện - Cho kính vào hộp hay đậy kính bao nilon - Chuyển kính vào tủ lớn có hệ thống đèn bật thường xuyên để chống mốc bụi bẩn 8/30/2016 II Phương pháp làm tiêu nhuộm (tiêu cố định) - Tiêu cố định nhuộm màu dùng để nghiên cứu đặc điểm hình thái học vsv, kiểm tra độ khiết giống… - Tiêu bảo quản lâu dài - VSV quan sát giết chết trình xử lý  an toàn cho người quan sát 2.1 Các bước chuẩn bị: - Chuẩn bị mẫu vật gồm: + Mẫu lỏng: dung dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic + Mẫu rắn: 01 ống thạch nghiêng nuôi cấy TB nấm men - chuẩn bị dụng cụ gồm que cấy, đèn cồn, nước cất vơ trùng, bút viết kính, lam kính - Chuẩn bị lam kính: + chọn lam kính sạch, hơ qua lại lửa đèn cồn để làm + Sử dụng bút viết kính ghi ký hiệu mẫu tiêu cần nhuộm 2.2 Các bước làm tiêu cố định Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: Lấy lam kính tiệt trùng; sử dụng bút viết kính vẽ lên vịng trịn  định vị vùng làm vết bôi Bước 2: Làm vết bôi + Đối với mẫu lỏng: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy giọt mẫu, đặt lên vịng trịn lam kính dàn mỏng + Đối với mẫu rắn: Sử dụng que cấy vô trùng lấy 1-2 giọt nước cất đặt lên vòng tròn; Tiệt trùng que cấy tiếp tục lấy mẫu ống giống; hòa tan với giọt nước cất  dàn mỏng Bước 3:Làm khô: để khơ tự nhiên nhiệt độ phịng Bước 4: Cố định vết bôi: kẹp chặt tiêu bản, hơ qua lại tiêu lửa đèn cồn vài lần Mục đích bước cố định tiêu bản: - Giết chết vsv an toàn cho người quan sát giúp cho vsv bắt màu tốt - Giúp cho vsv gắn chặt vào lam kính  rửa khơng bị trơi - Giữ ngun hình dạng kích thước nhuộm Lưu ý: + tránh đun tiêu ướt lửa đèn cồn + Tiệt trùng que cấy sau sử dụng III Phương pháp nhuộm Gram Cố định tiêu Tiêu sau cố định Bước 1: Nhỏ dung dịch Tím gentian ngập vết bơi  để 1-2 phút Sau rửa thuốc nhuộm thừa với nước sạch: Nghiêng lam kính 45o, cho nước chảy từ đầu đến cuối lam kính, đến khơng cịn màu tím Bước 2: Cố định màu với dung dịch Lugol: nhỏ dung dịch ngập vết bôi, để phút  Rửa với nước  vẩy khô Bước 3: Tẩy màu với cồn 95%: Nghiêng phiến kính 45o, tẩy cồn khơng cịn màu tím Sau rửa lại nước sạch, vẩy khơ Bước 4: Nhuộm màu với đỏ phenol: Nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi, để phút  Rửa thuốc nhuộm thừa với nước làm khô, sử dụng giấy thấm hơ qua lửa đèn cồn 3.1 Lịch sử: - Là phương pháp nhuộm màu nhằm phân biệt vi khuẩn Gram âm Gram dương - Do Christian Gram (1853-1938), nhà vật lý người Đan mạch phát minh 3.2 Chuẩn bị thuốc nhuộm - Dung dịch thuốc nhuộm thứ nhất: Tím gentian/ Crystal violet - Dung dịch cố định màu: Dung dịch lugol - Dung dịch tẩy màu: Cồn axeton - Dung dịch thuốc nhuộm thứ hai: Đỏ phenol/ Fuchsin/ Safranin - Nước rửa: Nước 3.3 Các bước nhuộm Gram Gồm bước Pseudomonas (gram -) Lactobacillus sp (gram +) E coli (gram -) Staphylococcus aureus (gram +) Salmonella (gram -) Bacillus cereus (gram +) 8/30/2016 Nấm men: giả khuẩn ty (mũi tên) Nấm men Saccharomyces nảy chồi (mũi tên) Nấm men nảy chồi (mũi tên) Yêu cầu báo cáo thực hành Quan sát tiêu làm sẵn + Tiêu vi khuẩn (E coli, Staphylococcus…) + Tiêu nấm mốc (vật kính 4x, 10x) Quan sát tiêu cố định + Tiêu vk lactic (vật kính 100x) + Tiêu nấm men (vật kính 100x) Mơ tả hình thái (u cầu vẽ hình) • Hình thái: Hình que, cầu… • Cách thức xếp: đứng riêng rẽ, nối đơi, nối chuỗi … • Tính chất bắt màu: Gram âm/dương • Đặc điểm sinh sản (nấm men, nấm mốc): nảy chồi ?, hình thành bào tử gì? Bài 2: Kỹ thuật ria cấy vi sinh vật Nội dung: • Giới thiệu mơi trường ni cấy vsv • Kỹ thuật ria cấy thạch đĩa thạch ống • Quan sát hình thái khuẩn lạc Mục đích • Nắm kỹ năng, thao tác nuôi cấy vi sinh vật mơi trường khác • Quan sát hình thành khuẩn lạc môi trường nuôi cấy khác 2.1 Giới thiệu môi trường nuôi cấy vsv a Mơi trường đặc (rắn) Mơi trường có sử dụng chất làm đông đặc môi trường: 1,5-2% thạch (agar) Một số loại môi trường chủ yếu:  Môi trường dinh dưỡng: • Mơi trường đơn giản/MT sở  peptone + agar; mơi trường nước thịt peptone • Mơi trường phức tạp: có bổ sung chất dinh dưỡng cao thịt, cao nấm men, casein… + chất khoáng chất đặc hiệu  Môi trường chọn lọc: MT có chứa thành phần ưu tiên sinh trưởng số VSV ức chế VSV khác (ví dụ Mt chọn lọc VK sinh protease có bổ sung gelatin/casein…)  Mơi trường chẩn đốn/ phân biệt: Có thành phần hóa chất giúp phân biệt vsv mắt thường (Ví dụ: mơi trường MacConkey phân biệt E coli Salmonella) 8/30/2016 Một số loại môi trường chọn lọc Mannitol salt agar MT dinh dưỡng MacConkey agar Sabouraud agar: MT chọn lọc cho nấm Casein media: chọn lọc Protease Môi trường thạch nghiêng 2.2 Phương pháp làm môi trường dịch thể b Môi trường dịch thể (lỏng) a Môi trường dinh dưỡng dịch thể (Nutrient broth) • Là mơi trường khơng bổ sung thêm chất đông đặc (thạch) Sử dụng để nuôi cấy vsv dị dưỡng Chuẩn bị: - 500g thịt, loại bỏ xương, mỡ, Thành phần: gân, xay nhỏ Thêm 1000ml nước cất, để Thịt bò (lợn): 500g nhiệt độ phòng 12h Sau đem đun sơi Peptone: 10g 30 phút Đợi nguội lọc bỏ cặn, bã NaCl: 5g - Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1lit, Nước cất: 1000ml thêm 0,5% NaCl 1% pepton Điều pH: 7.5±0.2 (25 °C) chỉnh pH - Hấp khử trùng 121o/1atm/20 phút 33 Sau hấp tiệt trùng, chia vào ông nghiệm bình tam giác để sử dụng b Mơi trường peptone dịch thể (Peptone Water) • Hịa tan Peptone 1% NaCl 0.5% với lít nước • Mơi trường sử cho MT lên men đường (bổ sung thêm 1% đường) MT kiểm tra phản ứng indole 2.3 Phương pháp làm môi trường rắn Môi trường Hansen: Sử dụng để nuôi cấy nấm men Thành phần: Glucose: Pepton: K2HPO4: MgSO4.7H2O: Agar: Nước cất: 50g 10g 3g 2-5g 15-18g 1000ml Chuẩn bị: - Cân xác thành phần mơi trường, hịa tan với nước cất cách đun sôi - Chỉnh pH từ 5-6; Hấp tiệt trùng 121o /1atm/20 phút - MT có màu vàng nhạt - Khi sử dụng, nuôi cấy 30-35oC/24-48h Môi trường Sabouraud: Sử dụng để nuôi cấy nấm mốc, nấm men Thành phần: Glucose: Peptone: Thạch: 40g/l 10g/l 15g/l Chuẩn bị: - Cân xác thành phần mơi trường, đun cho tan thành phần Chỉnh pH từ 5,6±0,2 25o C; Hấp tiệt trùng 121o/1atm/15 phút - MT có màu kem vàng nhạt 8/30/2016 2.4 Kỹ thuật ria cấy 2.4.1 Kỹ thuật ria cấy thạch ống Mục đích: sử dụng kỹ thuật cấy truyền giống, nhân giống, giữ giống, phân lập/chọn lọc giống a Chuẩn bị - Dụng cụ: môi trường thạch nghiêng, que cấy, đèn cồn, bút viết kính - Mơi trường sử dụng: Hansen agar - Ống giống: Nấm men Saccharomyces sp - Tiệt trùng buồng cấy, tay, dụng cụ trước tiến hành - Ghi tên giống, thời gian nuôi cấy lên môi trường Các bước ria cấy thạch ống b Các bước tiến hành: Bước 1: Lấy giống cần cấy + Đốt đèn cồn  tiệt trùng que cấy cách hơ que cấy thẳng đứng lửa đèn cồn đến đầu que cấy nóng đỏ  để nguội + Lấy ống giống cần cấy: sử dụng ngón tay út + má lịng bàn tay lấy nút bông, tiệt trùng miệng ống  Lấy lượng giống cần cấy  tiệt trùng miệng ống, đậy nút Bước 2: Cấy truyền sang môi trường mới: + Đưa que cấy lấy giống xuống đáy ống môi trường Ria que cấy từ trái sang phải theo đường zich zắc chữ chi phía miệng ống + Tiệt trùng miệng ống  đậy nút đem nuôi cấy Lưu ý: + Tiến hành ria cấy giống buồng cấy/phịng vơ trùng + Mọi thao tác kỹ thuật cần tiến hành xung quanh lửa đèn cồn 2.4.2 Kỹ thuật ria cấy thạch đĩa Mục đích: sử dụng kỹ thuật nghiên cứu phân lập, chọn lọc giống nhằm tách khuẩn lạc Các bước chuẩn bị phương pháp ria ống Chỉ khác phần kỹ thuật ria Kỹ thuật ria 2-3 lần đốt que cấy: Bước 1: Sử dụng que cấy vơ trùng, lấy giống cần cấy - Vơ trùng miệng đĩa, mở nắp hộp lồng, đưa que cấy lấy giống vào, ria 1/3 đĩa  dừng lại, đốt que cấy lần Bước 2: Đợi que cấy nguội; Xoay đĩa sang trái1 góc 45o; Đặt que cấy vào đường ria cuối lần ria thứ ria ngang tiếp 1/3 đĩa  đốt que cấy lần Bước 3: Làm tiếp tục bước 2, ria nốt 1/3 đĩa cịn lại  vơ trùng miệng đĩa, nuôi cấy tủ ấm trạng thái úp ngược 8/30/2016 2.5 Đánh giá sinh trưởng vsv môi trường thạch  VSV sinh trưởng mơi trường đặc (rắn) hình thành khuẩn lạc  Khuẩn lạc tập trung số lượng lớn tế bào nơi, hình thành từ tế bào ban đầu  Sự sinh trưởng đánh giá thơng qua tiêu chí: khuẩn lạc vi khuẩn khuẩn lạc vk lactic khuẩn lạc nấm men  Số lượng khuẩn lạc (đếm phương pháp pha loãng nồng độ) Hình thái, kích thước khuẩn lạc Rìa, bề mặt, trạng thái, kết cấu khuân lạc Màu sắc khuẩn lạc; Mùi môi trường Hai dạng khuẩn lạc thường gặp: - Khuẩn lạc láng bóng (dạng S): thường có bề mặt cong lồi, rìa gọn mịn, mặt láng bóng, nhẵn - Khuẩn lạc nhám (dạng R): bề mặt nhám xù xì, rìa nhọn hay có góc cạnh khuẩn lạc nấm mốc 8/30/2016 Yêu cầu báo cáo • Quan sát hình thái khuẩn lạc đĩa ni cấy: - Hình thái khuẩn lạc - Màu sắc - Trạng thái - Rìa - Bề mặt - Kích thước: sử dụng thước đo ...8/30/2016 c Vật kính c Thị kính - gồm hệ thống thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn khoảng vài mm, đặt vỏ bọc kim loại - Chức năng: Tạo ảnh thực, phóng đại, ngược chiều với vật quan sát - Độ phóng đại vật. .. hình rõ nét (phóng đại thêm ảnh vật kính-vai trị giống kính lúp) - Các loại thị kính: 7x, 10x, 15x, 20x  Độ phóng đại mẫu quan sát tích số độ phóng đại vật kính với độ phóng đại thị kính 1.2 Giới... cấp nâng vật kính lên thấy chớp ảnh vi trường  Khi nâng vật kính lên phải đảm bảo đầu vật kính ngập dầu soi (Hình C) + Điều chỉnh thêm ốc chỉnh vi cấp cho rõ nét a Chuẩn bị: - Kính hiển vi, dầu