Bài giảng thực hành vi sinh môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT ********* BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH MƠI TRƯỜNG GVHD: ThS HỒ BÍCH LIÊN - 2021 - MỤC LỤC Bài mở đầu Các quy tắc an toàn thực hành vi sinh vật Bài Giới thiệu kính hiển vi quang học quan sát vi sinh vật mơi trường nước kính hiển vi Bài Chuẩn bị dụng cụ-pha chế môi trường dinh dưỡng Bài Xác định tổng vi sinh vật Phân lập vi sinh vật chất thải rắn nước thải 21 Bài Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 28 Bài Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi sinh vật kính hiển vi 36 Bài Phân loại vi sinh vật phương pháp Nhuộm Gram 47 Bài Định lượng Coliform tổng số nước thải phương pháp MPN 51 Bài Kiểm tra E.coli mẫu đất 59 BÀI MỞ ĐẦU CÁC QUY TẮC AN TOÀN KHI THỰC HÀNH VI SINH VẬT Thao tác an toàn yêu cầu quan trọng thực hành vi sinh vật Khi làm việc với vi sinh vật, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào/ml) Nhiều chủng vi sinh vật tác nhân gây bệnh nên cần luôn cẩn thận với tất chủng thao tác Mặt khác, sinh viên thực hành phải sử dụng nhiều loại hóa chất, có acid hóa chất có độc tính Do vậy, cần tuân thủ số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho thân cho người khác phịng thí nghiệm sau: - Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật - Khơng nói chuyện, khơng ăn uống, khơng hút thuốc phịng thí nghiệm - Mặc áo blouse suốt thời gian thực tập phịng thí nghiệm - Khi làm việc phịng thí nghiệm vi sinh vật phải tuyệt đối giữ vệ sinh, không chạm vào vật dụng khác chưa cho phép giáo viên hướng dẫn - Khi sử dụng trang thiết bị, dụng cụ, phải thận trọng , tránh làm đổ vỡ hư hỏng - Trước bắt đầu làm cần sát trùng mặt bàn giấy lau tẩm cồn 70o dung dịch chất diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), để khô Thực tương tự cho hai tay Chú ý chưa đốt đèn cồn tay chưa khô cồn Lặp lại việc sát trùng sau hồn thành cơng việc - Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau thực khử trùng lại bàn làm việc - Cần ghi tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất hộp petri, ống nghiệm môi trường, bình ni cấy - Cẩn thận thao tác với đèn cồn Tắt lửa chưa có nhu cầu sử dụng sau thực xong thao tác Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua lửa Cần có cách bảo vệ tóc thích hợp trường hợp tóc dài - Sử dụng bóp cao su thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút miệng - Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất mảnh vỡ vào túi rác riêng - Tách riêng chất thải rắn chất thải lỏng - Tất chất thải rắn, môi trường chứa nhiễm vi sinh vật cần hấp khử trùng trước thải bỏ vào bãi rác Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn (nước javel) trước rửa tái sử dụng - Cần gói ràng băng keo đặt chồng đĩa petri lên - Không mở hộp petri dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hô hấp - Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng đầu que cấy vào chân lửa để tránh văng nhiễm vi sinh vật vào không khí - Sau kết thúc thực hành, phải vệ sinh nơi làm việc mình, vệ sinh dụng cụ máy móc, dụng cụ thí nghiệm xếp vào nơi quy định - Sát trùng rửa tay trước rời phịng thí nghiệm BÀI GIỚI THIỆU KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC VÀ QUAN SÁT VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC BẰNG KÍNH HIỂN VI I/ GIỚI THIỆU KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC KHÁI NIỆM KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC Là dụng cụ quang học hỗ trợ cho mắt gồm có nhiều lăng kính với độ phóng đại khác nhau, có tác dụng làm tăng góc trơng ảnh vật nhỏ mà ta khơng thể nhìn thấy mắt thường CẤU TẠO Kính hiển vi gồm có hệ thống: Hệ thống giá đỡ Hệ thống phóng đại Hệ thống chiếu sáng Hệ thống điều chỉnh Hệ thống giá đỡ gồm: Bệ, thân, Revonve mang vật kính, bàn để tiêu bản, kẹp tiêu Hệ thống phóng đại gồm: - Thị kính: phận kính hiển vi mà người ta để mắt để soi kính, có loại ống đơi ống đơn (Bản chất thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn, dùng để tạo ảnh thật vật cần quan sát) - Vật kính: phận kính hiển vi quay phía có vật mà người ta muốn quan sát, có độ phóng đại vật kính: x10, x40, x100 (Bản chất thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn, đóng vai trị kính lúp để quan sát ảnh thật) Hệ thống chiếu sáng gồm: - Nguồn sáng (gương đèn) - Màn chắn, đặt vào tụ quang dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng qua tụ quang - Tụ quang, dùng để tập trung tia ánh sáng hướng luồng ánh sáng vào tiêu cần quan sát Vị trí tụ quang nằm gương bàn để tiêu Di chuyển tụ quang lên xuống để điều chỉnh độ chiếu sáng Hệ thống điều chỉnh: - Ốc vĩ cấp - Ốc vi cấp - Ốc điều chỉnh tụ quang lên xuống - Ốc điều chỉnh độ tập trung ánh sáng tụ quang - Núm điều chỉnh chắn - Ốc di chuyển phiến kính mang tiêu (trước, sau, trái, phải) CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI - Đặt tiêu lên bàn để tiêu bản, dùng kẹp để giữ tiêu bản, nhỏ giọt dầu soi để soi chìm phiến kính soi vật kính x100 - Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu mục đích quan sát để chọn vật kính thích hợp - Điều chỉnh ánh sáng - Điều chỉnh tụ quang: vật kính x10 hạ tụ quang đến tận cùng, vật kính x40 để tụ quang đoạn giữa, vật kính x100 - Điều chỉnh cỡ chắn tương ứng với vật kính - Hạ vật kính sát vào tiêu (mắt nhìn tiêu bản) - Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc vĩ cấp để đưa vật kính lên nhìn thấy hình ảnh mờ vi trường - Điều chỉnh ốc vi cấp để hình ảnh rõ nét BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI - Sử dụng bảo quản kính hiển vi cách thận trọng - Đặt kính nơi khơ thống, vào cuối ngày làm việc đặt kính hiển vi vào hộp có gói hút ẩm silicagel để trách bị mốc - Lau hệ thống giá đỡ hàng ngày khăn lau sạch, lau vật kính dầu giấy mềm chuyên dụng có tẩm xylen cồn - Bảo dưỡng, mở kính lau hệ thống chiếu sáng phía II/ QUAN SÁT VI SINH VẬT TRONG MƠI TRƯỜNG NƯỚC BẰNG KÍNH HIỂN VI 1/ MỤC ĐÍCH –YÊU CẦU - Sử dụng thành thạo kính hiển vi quang học - Xác định diện vi sinh vật môi trường nước 2/ CHUẨN BỊ a/ DỤNG CỤ, HĨA CHẤT - Kính hiển vi quang học - Lame - Lamelle - Ống hút nhựa - Que cấy - Bình tia - Giấy thấm - Nước cất b/ NGUYÊN VẬT LIỆU Ba mẫu nước: Nước thải sinh hoạt, nước giếng, nước ao hồ 3/ CÁCH TIẾN HÀNH - Dùng que cấy ống hút lấy giọt nước từ loại nước thu thập cho lên lame Đậy lamelle lại cách nghiêng 45o, hạ từ từ xuống để tránh có bọt khí kính - Quan sát vật kính có độ phóng đại nhỏ (4X, 10X) Chuyển sang vật kính có độ phóng đại lớn (40X, 100X) 4/ CÂU HỎI - Xác định thành phần cấu tạo nên kính hiển vi quang học chức chúng - Cách tiến hành quan sát vi sinh vật mẫu nước kính hiển vi quang học - So sánh mật độ vi sinh vật loại mẫu nước: nước sông, nước mưa, nước uống tiệt trùng, nước thải, - Vẽ phát họa hình ảnh vi sinh vật xem kính hiển vi BÀI SỐ CHUẨN BỊ DỤNG CỤPHA CHẾ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG A CHUẨN BỊ DỤNG CỤ I MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU - Biết cách bao gói, làm nút bơng, khử trùng dụng cụ nồi hấp khử trùng áp suất cao tủ sấy - Nắm vững yêu cầu, nguyên tắc, bước thực pha chế khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật II THỰC HÀNH BAO GÓI DỤNG CỤ Nguyên tắc - Dụng cụ bao gói phải đảm bảo sạch, khơ khơng bị nứt mẻ - Bao gói phải kín cẩn thận để sau khử trùng đảm bảo vô trùng dụng cụ lớp giấy gói lấy sử dụng dễ dàng Phương pháp bao gói dụng cụ Việc bao gói dụng cụ gồm khâu: - Làm nút bông: cho ống nghiệm, bình tam giác, pipet, - Bao gói: cho hầu hết dụng cụ thủy tinh a Cách làm nút - Với ống nghiệm ➢ Lấy bơng (gịn) khơng thấm nước cuộn lại ➢ Đẩy cuộn gập đôi từ từ vào miệng ống nghiệm u cầu: ➢ Nút có kích thước độ chặt vừa phải ➢ Đầu nút tròn, gọn, phần lớn phần ➢ Lấy nút hay đóng vào dễ dàng - Với chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự sử dụng lượng nhiều - Với pipet: dùng sợi dây thép nhỏ nhét bơng vào đầu lớn pipet b Cách bao gói dụng cụ Với dụng cụ sau làm nút bơng cần bao gói phần có nút giấy báo để khử trùng nút không bị ướt đảm bảo điều kiện vô trùng tốt Cách làm sau: ➢ Cắt mảnh giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói ➢ Quấn quanh phần đầu nút ➢ Gập giấy sát vào nút ➢ Cột lại thật chặt Yêu cầu: ➢ Phần giấy bao bên ngồi phải chặt kín ➢ Bao giấy dầu giấy nhôm bao giấy báo cho vào nylon bóng có khả chịu nhiệt với dụng cụ hấp ướt ➢ Bao giấy báo với dụng cụ sấy khô khử trùng ướt Với dụng cụ pipet, que trang phải dùng giấy bao kín tồn Có thể dùng hộp nhơm để đựng dụng cụ để khử trùng Thực hành Thực hành làm nút bơng bao gói dụng cụ nhóm? CÂU HỎI Việc bao gói dụng cụ phải đảm bảo nguyên tắc nào? Trình bày cách thức làm nút bơng với tất dụng cụ học? Việc làm nút bơng phải đạt u cầu nào? Trình bày cách thức bao gói dụng cụ học? Bao gói dụng cụ phải đạt yêu cầu nào? 56 trường hợp xác định MPN hệ dãy nồng độ ống nghiệm lặp lại (hệ x hay ống nghiệm) Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms mẫu cao, phải sử dụng mẫu có bậc pha lỗng cao Ủ ống nghiệm 370C ± 10C 24h ± 1h Ghi nhận số ống có sinh Với ống khơng sinh hơi, tiếp tục ủ 370C ± 10C 24h ± 1h Sau 48h ± 2h, loại bỏ ống khơng sinh hơi, (-) tính Ghi nhận số lượng ống (+), (-) tính Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB (+) sang ống có chứa canh BGBL ủ 37oC ± 10C 24h ± 1h Ghi nhận số ống có sinh Với ống khơng sinh hơi, tiếp tục ủ 370C ± 10C 24h ± 1h Sau 48h ± 2h, loại bỏ ống khơng sinh hơi, (-) tính Ghi nhận số lượng ống (+), (-) tính • Cách đọc kết Ở tất trường hợp nêu trên, từ số lượng ống nghiệm có (+) (sinh hơi/mơi trường ni cấy bị đục) độ pha loãng mẫu, dùng Bảng MPN thích hợp (bảng x tức ống nghiệm) để tính mật độ vi sinh vật mẫu biểu diễn dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha lỗng Ví dụ: nồng độ 10-1 có ống dương tính, 10-2 có ống dương tính, 10-3 có ống dương tính, ta số ống dương tính 0, tra bảng MPN cho kết 43 MPN/ml Nếu nồng sử dụng khác so bảng tra Ta thực công thức MPN (tra bảng) x 10-1/ độ pha lỗng thấp = MPN/ml Ví dụ: nồng độ 10-3 có ống dương tính, 10-4 có ống dương tính, 10-5 có ống dương tính, ta số ống dương tính 0, tra bảng MPN ta 43 MPN/ml Kết quả: 43 (tra bảng) x 10-1/ 10-3 = 300 MPN/ml CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 1) Trình bày khái niệm nguyên tắc phương pháp MPN 2) Nêu định nghĩa coliform tổng số 4) Tóm tắt phương pháp MPN 5) Thực hành phương pháp MPN? 57 6) Cách đọc kết phương pháp MPN? 7) Vai trò ống durham? 8) so sánh phương pháp MPN phương pháp khác? BẢNG MPN BẢNG TRA MPN DÙNG CHO LOẠT ỐNG NGHIỆM Ở NỒNG ĐỘ PHA LOÃNG LIÊN TIẾP Số lượng ống dương tính Độ pha lỗng 10-1 10-2 10-3 0 0 0 Số MPN/ml Số lượng ống dương tính Độ pha lỗng Số MPN/ml 10-1 10-2 10-3