Tài liệu hướng dẫn thực hành vi sinh vật học thực phẩm tài liệu đào tạo cử nhân xét nghiệm y học dự phòng

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG H P U TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM Tài liệu đào tạo Cử nhân xét nghiệm y học dự phòng H Hà Nội, 2016 TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM Chủ biên: ThS Phạm Thị Vinh Hoa Biên soạn: ThS Phạm Thị Vinh Hoa CN Nguyễn Thị Huyền Trang CN Nguyễn Phƣơng Thoa Thư ký biên soạn: H P CN Phan Thị Quỳnh H U MỤC LỤC BÀI 1: CÁC KỸ THUẬT PHA LOÃNG MẪU VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH HUYỀN PHÙ BAN ĐẦU MỤC TIÊU HỌC TẬP PHẠM VI ÁP DỤNG ĐỊNH NGHĨA .6 2.1 Huyền phù ban đầu .6 2.2 Dung dịch pha loãng thập phân .6 NGUYÊN TẮC THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ DUNG DỊCH PHA LOÃNG THƢỜNG DÙNG .7 CHUẨN BỊ MẪU .7 H P 6.1 Sản phẩm đông lạnh .7 6.2 Sản phẩm cứng sản phẩm khô 6.3 Sản phẩm dạng lỏng sản phẩm không sánh đặc 6.4 Sản phẩm không đồng (chứa nhiều thành phần thực phẩm khác nhau) 7 QUY TRÌNH CHUNG .8 U 7.1 Phần mẫu thử huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng ban đầu) 7.2 Các dung dịch pha loãng thập phân .8 7.3 Thời gian tiến hành .9 CÁC NGUYÊN TẮC CỤ THỂ ĐỂ CHUẨN BỊ CÁC MẪU THỊT (THỊT TƢƠI, THỊT NGUYÊN LIỆU, CHẾ BIẾN, GIA CẦM) VÀ MẪU SẢN PHẨM THỊT (KHÔNG BAO GỒM ĐỒ HỘP) H 8.1 Chuẩn bị loại mẫu thử khác 8.2 Quy trình với sản phẩm chế biến đƣợc bảo quản lạnh 10 8.3 Quy trình thịt đơng lạnh 11 CÁC NGUYÊN TẮC CỤ THỂ ĐỂ CHUẨN BỊ CÁC MẪU THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN .12 9.1 Cá, động vật giáp xác, động vật thân mềm loại khác dạng nguyên liệu 12 9.2 Các sản phẩm cá, động vật giáp xác, thân mềm sản phẩm khác chế biến .14 10 CÁC NGUYÊN TẮC CỤ THỂ ĐỂ CHUẨN BỊ CÁC MẪU SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA 15 10.1 Sữa sản phẩm sữa dạng lỏng 15 10.2 Sữa bột 15 10.3 Bánh custard, tráng miệng cream (pH > 5) 16 10.4 Sữa lên men cream chua (pH < 5) .16 10.5 Sữa bột dành cho trẻ sơ sinh .16 10.6 Phomát phomát chế biến 17 10.7 Kem thực phẩm, bánh kem .17 TÀI LIỆU THAM KHẢO 18 BÀI 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT 19 MỤC TIÊU HỌC TẬP 19 PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT TRÊN ĐĨA THẠCH – PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ BÀO TỬ NẤM MEN, NẤM MỐC 19 1.1 Phạm vi áp dụng 19 1.2 Nguyên lý phƣơng pháp .19 1.3 Nội dung .19 1.4 Biểu mẫu áp dụng cho phép thử 22 1.5 Báo cáo thí nghiệm .22 H P PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT – PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA – PHƢƠNG PHÁP ĐẾM MÀNG LỌC .22 2.1 Phạm vi áp dụng 22 2.2 Định nghĩa 22 2.3 Thiết bị dụng cụ .22 2.4 Môi trƣờng thuốc thử .23 2.5 Lấy mẫu thử nghiệm 23 2.6 Quy trình .24 2.7 Tính tốn biểu thị kết 24 2.8 Kiểm soát chất lƣợng 25 2.9 Biểu mẫu áp dụng cho phép thử 25 2.10 Báo cáo thí nghiệm 25 U H PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT TÍNH THEO SỐ CĨ XÁC SUẤT LỚN NHẤT – ĐỊNH LƢỢNG E COLI GIẢ ĐỊNH 25 3.1 Phạm vi áp dụng 26 3.2 Nguyên lý phƣơng pháp 26 3.3 Thiết bị, dụng cụ 26 3.4 Mẫu thử nghiệm chủng vi sinh vật .26 3.5 Môi trƣờng nuôi cấy 26 3.6 Quy trình thí nghiệm 29 3.7 Biểu mẫu áp dụng cho phép thử 35 3.8 Báo cáo thí nghiệm .35 PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT – PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA SPP TRÊN ĐĨA THẠCH 35 4.1 Phạm vi áp dụng 35 4.2 Nguyên lý phƣơng pháp .35 4.3 Nội dung .36 4.4 Biểu mẫu áp dụng cho phép thử 45 4.5 Báo cáo thí nghiệm .45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 Phụ lục 1: Biên thử nghiệm đếm tổng số bào tử nấm men, nấm mốc 47 Phụ lục 2: Biên thử nghiệm định lƣợng Pseudomonas aeruginosa .48 Phụ lục 3: Biên thử nghiệm định lƣợng E coli 50 Phụ lục 4: Biên thử nghiệm phát Salmonella spp .51 H P H U BÀI 1: CÁC KỸ THUẬT PHA LOÃNG MẪU VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH HUYỀN PHÙ BAN ĐẦU MỤC TIÊU HỌC TẬP Thực thành thạo kỹ thuật xử lý mẫu với số mẫu bản: mẫu thịt sản phẩm từ thịt, sữa, ngũ cốc rau Thực thành thạo kỹ thuật pha loãng mẫu chuẩn bị dung dịch huyền phù ban đầu PHẠM VI ÁP DỤNG Kỹ thuật áp dụng cho việc chuẩn bị huyền phù ban đầu dung dịch pha lỗng thập phân điều kiện hiếu khí để kiểm tra vi sinh vật sản phẩm dùng cho ngƣời thức ăn chăn nuôi H P ĐỊNH NGHĨA 2.1 Huyền phù ban đầu Huyền phù, dung dịch nhũ tƣơng thu đƣợc sau cân đong lƣợng sản phẩm cần kiểm tra (hoặc mẫu đƣợc lấu từ sản phẩm) đƣợc trộn với lƣợng dung dịch pha lỗng lớn gấp chín lần hạt to lắng xuống, có U 2.2 Dung dịch pha loãng thập phân Dung dịch thu đƣợc trộn phần huyền phù ban đầu với phần dung dịch pha loãng, lặp lại thao tác với độ pha loãng thu đƣợc dãy dung dịch pha lỗng thập phân thích hợp cho việc cấy môi trƣờng NGUYÊN TẮC H - Huyền phù ban đầu đồng tốt - Dung dịch pha loãng thập phân nhằm giảm bớt số lƣợng vi sinh vật có đơn vị thể tích, để sau ủ quan sát đƣợc có hay khơng có phát triển chúng (trong ống lọ) định lƣợng đƣợc khuẩn lạc (trên đĩa thạch) - Nếu dự đoán đƣợc số lƣợng vi sinh vật, cần cấy hai độ pha lỗng liên tiếp THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ - Nồi hấp ƣớt - Máy vortex - Máy dập mẫu - Máy khuấy từ - Máy xay, máy nghiền dao - Máy đo pH, độ xác ± 0,1 đơn vị pH - Ống nghiệm có nắp vặn - Pipet - Cân, xác đến 0,01 g DUNG DỊCH PHA LOÃNG THƢỜNG DÙNG - Dịch muối pepton - Dung dịch đệm pepton - Dung dịch muối pepton với Bromocresol tía (dùng với sản phẩm giàu acid) H P Chú ý: Phân phối dịch pha loãng vào ống nghiệm cho sau khử trùng ống nghiệm chứa 9,0 mL Sai số cho phép đo thể tích sau khử trùng không đƣợc vƣợt ± 0,2% CHUẨN BỊ MẪU 6.1 Sản phẩm đông lạnh - Đƣa mẫu nhiệt độ 18°C đến 27°C (nhiệt độ phòng thử nghiệm) tối đa h, 2°C ± 2°C tối đa 24 h Sau mẫu đƣợc thử nghiệm sớm tốt U - Nếu lấy mẫu, sản phẩm cịn đơng lạnh sử dụng dịch pha lỗng nhiệt độ phòng thử nghiệm để làm tan băng H 6.2 Sản phẩm cứng sản phẩm khô - Với sản phẩm cứng khô không đồng chất, xay nghiền mẫu không phút không làm tăng nhiệt độ mẫu 6.3 Sản phẩm dạng lỏng sản phẩm không sánh đặc - Lắc mẫu 6.4 Sản phẩm không đồng (chứa nhiều thành phần thực phẩm khác nhau) - Lấy mẫu đại diện cho phần sản phẩm ban đầu - Hoặc đồng hóa tồn mẫu phần thử nghiệm để lấy đƣợc mẫu thử đồng nhất, xay nghiền mẫu tránh nhiệt độ tăng quá, không xay nghiền phút Chú ý: - Đối với sản phẩm giàu acid: + Phải đảm bảo pH đƣợc đƣa trung tính Sử dụng dịch pha lỗng với chất thị độ pH bổ sung để tránh tạp nhiễm dùng que thử pH: thêm natri hydroxit (NaOH) để trả lại màu huyền phù chất thị bắt đầu đổi màu + Nồng độ NaOH đƣợc bổ sung phụ thuộc độ acid sản phẩm Nồng độ thích hợp (ví dụ: 0,1 mol/L mol/L) nồng độ gần với tỷ lệ với dịch pha lỗng - Đối với sản phẩm có hàm lƣợng chất béo cao (tổng khối lƣợng chất béo 20 %): + Sử dụng dịch pha loãng với sorbitan monoleat bổ sung từ g/L đến 10 g/L (Tween 80) tùy theo mức chất béo (ví dụ, hàm lƣợng chất béo 40 % bổ sung g/L) QUY TRÌNH CHUNG 7.1 Phần mẫu thử huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng ban đầu) H P 7.1.1 Đối với mẫu thử dạng rắn - Cân m g ± 5% (tối thiểu 10 g) mẫu thử đại diện vào túi dập mẫu vô trùng - Bổ sung x mg (± 5%.) dịch pha loãng - Đồng máy dập mẫu 7.1.2 Đối với mẫu thử dạng lỏng U - Đong V mL ± 5% (tối thiểu 10 mL) mẫu thử đại diện vào bình/ ống nghiệm vơ trùng - Bổ sung x V mL (± 5%.) dịch pha loãng - Đồng máy vortex máy khuấy từ Chú ý: H - Nhiệt độ dịch pha loãng suốt trình thao phải giữ xấp xỉ nhiệt độ phòng - Để hạt to lắng xuống 15 phút, cần Có thể sử dụng hệ thống lọc để có kết tƣơng đƣơng - Trong số trƣờng hợp cụ thể, tỷ lệ pha lỗng khác Điều phải đƣợc tính đến thao tác và/hoặc phải đƣợc tính đến phần tính kết 7.2 Các dung dịch pha loãng thập phân - Hút mL huyền phù ban đầu (sai số đo cho phép ± 5%) vào ống nghiệm chứa mL dung dịch pha lỗng vơ trùng (tỷ lệ huyền phù ban đầu : dung dịch pha loãng) - Trộn máy vortex - Lặp lại thao tác để đƣợc dung dịch pha loãng Chú ý: - Để có độ xác tối ƣu, khơng nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu cm - Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha lỗng vơ trùng - Với độ pha lỗng sử dụng đầu cơn/ pipet vơ trùng 7.3 Thời gian tiến hành - Thời gian tính từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu chất cấy tiếp xúc với môi trƣờng không vƣợt 45 phút - Thời gian kể từ chuẩn bị huyền phù ban đầu đến bắt đầu chuẩn bị dung dịch pha loãng thập phân không đƣợc vƣợt 30 phút H P Chú ý: - Nếu nhiệt độ phòng phòng thử nghiệm cao hai khoảng thời gian phải giảm CÁC NGUYÊN TẮC CỤ THỂ ĐỂ CHUẨN BỊ CÁC MẪU THỊT (THỊT TƢƠI, THỊT NGUYÊN LIỆU, CHẾ BIẾN, GIA CẦM) VÀ MẪU SẢN PHẨM THỊT (KHÔNG BAO GỒM ĐỒ HỘP) 8.1 Chuẩn bị loại mẫu thử khác U 8.1.1 Mẫu phịng thử nghiệm có khối lượng nhỏ 50 g - Sử dụng toàn mẫu phòng thử nghiệm để chuẩn bị huyền phù ban đầu CHÚ THÍCH: Chỉ phát định lƣợng hệ vi sinh vật bề mặt sâu bên sản phẩm H 8.1.2 Miếng thân thịt để thử nghiệm - Lấy mẫu sâu bên và/hoặc mẫu bề mặt - Để phân tích mẫu bề mặt, sử dụng kỹ thuật không phá hủy (sử dụng khăn nhỏ gạc) 8.1.3 Lát mẩu thịt riêng lẻ thịt nấu - Lấy dải thịt 8.1.4 Mảnh thỏi sản phẩm đơng lạnh: Đồng mẫu 8.1.5 Sản phẩm thịt có “lớp màng bọc” - Nếu nhƣ lớp màng không ăn đƣợc (chất tổng hợp), ví dụ xúc xích: tẩy trùng lớp màng, dùng dao vô trùng rạch điểm sản phẩm, kéo tách bỏ lớp màng kẹp vô trùng - Cắt thành lát 8.1.6 Các ăn sơ chế - Đối với ăn sơ chế bao gói sẵn, mở bao gói - Lấy mẫu đại diện đồng mẫu 8.2 Quy trình với sản phẩm chế biến bảo quản lạnh 8.2.1 Yêu cầu chung - Đối với sản phẩm bao gói, tiến hành mở tháo bỏ bao bì điều kiện vơ trùng 8.2.2 Lấy mẫu từ phía sâu bên vật liệu thử - Loại bỏ phần da khỏi phần thịt - Sử dụng dụng cụ để đốt bề mặt thịt, loại bỏ lớp bề mặt phía dày khoảng mm để lộ khoảng cm x cm Đốt bề mặt lộ thấy cháy thành than H P - Sử dụng dao dao mổ vô trùng loại bỏ lớp rộng khoảng cm x cm dày cm phía dƣới lớp cháy - Dùng kẹp vô trùng dao mổ lấy từ vùng lộ lƣợng mẫu cần thiết đặt vào túi dập mẫu - Cân mẫu thêm khối lƣợng dịch pha loãng tỷ lệ 1:9 8.2.3 Lấy mẫu từ bề mặt thịt U - Sử dụng khuôn tiệt trùng khử trùng để lấy mẫu bề mặt áp vào vùng định lấy mẫu - Dùng dao mổ vô trùng cắt dọc theo mép bên lƣới H - Dùng kẹp để nhấc mẫu lên, cắt dọc theo mép bên lƣới - Dùng kẹp để nhấc mẫu lên, cắt chéo tồn diện tích với độ sâu từ mm đến mm - Đặt miếng thử vào vật chứa túi dập mẫu - Cân mẫu thêm khối lƣợng dịch pha loãng tỷ lệ 1:9 - Nếu cần thiết, để bề mặt lấy mẫu tƣơng tác dễ dàng với tổng thể tích huyền phù ban đầu, điều chỉnh lƣợng dịch pha lỗng (ví dụ: diện tích 25 cm2 250 mL huyền phù ban đầu) 8.2.4 Lấy mẫu từ miếng thái nhỏ riêng lẻ - Dùng dao kẹp vô trùng cắt dải rộng cm dọc theo tâm chiều dài - Cắt dải thịt thành miếng nhỏ cho vào túi dập mẫu - Cân mẫu thêm khối lƣợng dịch pha loãng tỷ lệ 1:9 8.2.5 Lấy mẫu thân thịt gia cầm 8.2.5.1 Lấy mẫu ngực - Lấy mẫu sâu ngực sau đốt tiệt trùng bề mặt Đối với loài chim săn bắn đƣợc nhổ đám lơng thích hợp (khi cịn lơng) - Nếu bao gói sẵn kỹ thuật vô trùng dùng kéo dao vô trùng để tháo bao gói đặt thân thịt lên khay vô trùng với lƣng xuống dƣới - Dùng dụng cụ đốt bề mặt, đốt khử trùng vùng da ngực - Dùng kéo dao loại bỏ lớp da đốt khử trùng - Dùng dụng cụ đốt bề mặt, đốt khử trùng phần ngực lộ - Dùng dao kẹp lấy mẫu sâu ngực (không chạm vào phần dƣới cơ) - Đặt mẫu vào túi dập mẫu H P - Cân mẫu thêm khối lƣợng dịch pha loãng tỷ lệ 1:9 8.2.5.2 Lấy mẫu nguyên thân thịt phương pháp rửa - Nếu mẫu bao gói sẵn kỹ thuật vô trùng dùng kéo dao vô trùng lấy thân thịt đặt vào túi chất dẻo rộng để lắc đƣợc - Thêm 500 mL dịch pha loãng lắc khoảng 30 giây cho tất phần thân thịt đƣợc tráng rửa U - Đổ dịch rửa vào vật chứa vô trùng 8.2.5.3 Lấy mẫu từ miếng thịt gia cầm - Lấy mẫu từ phía sâu bên vật liệu thử lấy mẫu từ bề mặt thịt H 8.3 Quy trình thịt đơng lạnh 8.3.1 Mẫu lấy từ miếng to khối mà không cần làm tan băng trước 8.3.1.1 Mẫu tổng số (mẫu bề mặt phần sâu bên trong) - Dùng khoan điện đƣợc gắn với mũi khoan thích hợp dụng cụ thích hợp khác, khơng có sẵn dùng khoan tay tốc độ 900v/ ph tạo lỗ điểm quy định - Dùng dao lấy tất lõi khoan đặt vào túi dập mẫu - Thao tác không đƣợc làm tăng nhiệt độ mẫu 8.3.1.2 Mẫu lấy sâu bên - Dùng đục gỗ búa loại bỏ lớp bề mặt dày khoảng mm khỏi diện tích khoảng cm x cm - Dùng dụng cụ đốt bề mặt bề mặt đƣợc làm đƣợc hóa than - Tạo lỗ thủng diện tích đốt mà khơng chạm vào mặt đáy khối thịt 8.3.1.3 Mẫu bề mặt - Khử trùng khuôn lấy mẫu bề mặt đục gỗ cách nhúng cồn đốt - Trong khn lấy mẫu cịn nóng, áp vào bề mặt thịt đông lạnh - Dùng đục gỗ búa, đục lớp thịt khuôn sâu đến khoảng mm - Lấy miếng vào túi đập mẫu - Cân mẫu thêm khối lƣợng dịch pha loãng lớn gấp lần H P 8.3.1.4 Các mẫu nhỏ cần làm tan băng: miếng thịt nhỏ (đã thái nhỏ) đóng gói, thân thịt gia cầm thỏ - Làm tan băng nhiệt độ phòng phần bên mẫu vừa tan chƣa tan thành nƣớc Thời gian không vƣợt h đến h - Nếu việc làm tan băng kéo dài h làm tan băng chậm tủ kín nhiệt độ 2°C ± 2°C tối đa 18 h U - Không nên làm tan băng nồi cách thủy đƣợc khống chế nhiệt độ có nguy bị nhiễm bẩn mẫu bao gói khơng kín nƣớc CHÚ THÍCH: - Đối với thân thịt gia cầm thịt thỏ thơng thƣờng làm tan băng chậm phịng lạnh nhiệt độ dƣơng (từ 0°C đến 2°C) 15 h đến 16h Thực tế ghi nhận đƣợc thân thịt gia cầm đƣợc làm mát cách nhúng vào nƣớc thƣờng làm nƣớc tiết nhiều giai đoạn làm tan băng H CÁC NGUYÊN TẮC CỤ THỂ ĐỂ CHUẨN BỊ CÁC MẪU THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN (thủy sản, động vật có vỏ sản phẩm chúng dạng nguyên liệu chế biến, nấu chín đơng lạnh) 9.1 Cá, động vật giáp xác, động vật thân mềm loại khác dạng nguyên liệu 9.1.1 Cá tươi nguyên - Mang, ruột hậu môn bọc vải sợi vô trùng, đƣợc ngâm cồn 70 độ - Lấy miếng mẫu hình khối từ lƣng, thái nghiền nhỏ dịch pha loãng 9.1.2 Cá thái lát, cá philê cá miếng: Xử lý theo quy trình chung 9.1.3 Động vật chân đầu nguyên thái lát - Dùng kẹp dao loại bỏ da chân Lấy mẫu hình khối lƣng đoạn xúc tu - Thêm dịch pha loãng để tạo dung dịch 10 Nghiền mẫu phòng thử nghiệm dịch pha lỗng sử dụng đồng hóa quay cắt thành miếng nhỏ 9.1.4 Động vật giáp xác ngun ví dụ cua - Dùng búa, kìm kẹp bẻ vỡ vỏ để lấy đƣợc tối đa phần thịt dùng cho phân tích - Thêm dịch pha lỗng nghiền đồng hóa quay cắt thành miếng nhỏ H P 9.1.5 Thịt động vật giáp xác bỏ vỏ - Lấy lƣợng thịt theo yêu cầu, tạo huyền phù ban đầu + dịch pha loãng (và đồng 9.1.6 Động vật giáp xác tôm nước ngọt, tôm đồng, tôm hùm tôm Nauy (nguyên bỏ đầu) - Trừ nhỏ, lại đƣợc bóc vỏ thịt đƣợc cắt thành miếng Trộn đồng hóa quay U - Thêm lƣợng dịch pha loãng cần thiết để tạo dịch pha loãng + 9.1.7 Động vật hai mảnh vỏ, động vật chân bụng loài khác 9.1.7.1 Yêu cầu chung H - Bảo quản mẫu oC ± oC vận chuyển Động vật có vỏ phải trì tƣơi sống Loại bỏ há miệng bị hƣ hỏng - Mẫu thử nghiệm đại diện phải có phải có khối lƣợng từ 75 g đến 100 g (25 g nhỏ, ví dụ nhƣ: lồi Donax spp.) Phân tích động vật hai mảnh vỏ phải tính theo yêu cầu phép thử 9.1.7.2 Động vật hai mảnh vỏ - Dùng bàn chải rửa dƣới vịi nƣớc chảy có chất lƣợng nƣớc uống, đặc biệt xung quanh khớp nối miệng - Làm nƣớc làm đặt lên đĩa Phủ giấy thấm nƣớc - Nếu có chân tơ khơng làm đứt mà dùng kéo, dao dao mổ để cắt hết trƣớc mở hết miệng - Khi đƣợc mở, thu lấy phần thịt nƣớc van vào túi dập mẫu Những bị phần nƣớc van đƣợc sử dụng chúng sống mở - Cho phần thịt phần nƣớc van vào phần dịch pha loãng Trộn đồng hóa quay khoảng 30 giây đến phút - Bổ sung dịch pha loãng để thu đƣợc huyền phù + - Nếu khơng có mảnh vỏ vụn sử dụng trộn kiểu nhu động Nếu có mảnh vỏ vụn sử dụng trộn kiểu nhu động vớ túi kép túi ba lớp 9.1.7.3 Động vật chân bụng (ví dụ: ốc xoắn) - Dùng bàn chải rửa vỏ làm cồn 70 % đặt lên khay vô trùng (đặt hai lớp lƣới vô trùng cần) Dùng búa đập vỡ vỏ để lấy đƣợc phần thân thịt H P - Thái thịt thành miếng nhỏ Loại bỏ mảnh vỏ vỡ kẹp - Chuẩn bị huyền phù ban đầu + dịch pha lỗng, hồn thiện sử dụng lƣợng dịch pha lỗng thích hợp để thu đƣợc huyền phù + CHÚ THÍCH: Việc phân tích ốc mút khó, khơng thể lấy hết đƣợc phần thịt mà khơng bị nhiễm bẩn qua vỏ 9.2 Các sản phẩm cá, động vật giáp xác, thân mềm sản phẩm khác chế biến U 9.2.1 Thức ăn từ cá động vật giáp xác động vật thân mềm nấu chín: Đồng mẫu lấy đại diện H 9.2.2 Động vật giáp xác, động vật thân mềm nguyên bỏ vỏ, thịt động vật giáp xác nhuyễn thể: Theo hƣớng dẫn lấy thịt động vật giáp xác bỏ vỏ, Động vật giáp xác nhƣ tôm nƣớc ngọt, tôm đồng, tôm hùm tôm Nauy (nguyên bỏ đầu), Động vật hai mảnh vỏ, động vật chân bụng loài khác 9.2.3 Động vật hai mảnh vỏ bỏ vỏ nấu sơ chế: Theo Quy trình chung 9.2.4 Các sản phẩm cá, động vật giáp xác, thân mềm sản phẩm khác dạng đông lạnh - Tơm bóc vỏ đơng lạnh dạng khối: Làm tan băng nhẹ nhàng để tách riêng tơm dùng kẹp để lấy thân thịt - Tôm nguyên đông lạnh dạng khối: Để tan đá h 18 oC đến 27 oC (nhiệt độ phòng thử nghiệm) cho tách đƣợc khối tơm Dùng kẹp để lấy tôm dùng kẹp để bóc vỏ chúng khay vơ trùng Trộn phần thịt đồng hóa quay - Thịt cua đơng lạnh dạng khối: Dùng khoan để lấy mẫu thử từ khối thịt cua đông lạnh tan băng 18 oC đến 27 oC (nhiệt độ phòng thử nghiệm) khoảng h dùng kìm kẹp để lấy khoanh thịt - Động vật chân đầu nguyên đông lạnh dạng khối: Làm tan băng nhẹ nhàng (khoảng h khối lớn) 18 oC đến 27 oC (nhiệt độ phòng thử nghiệm) Dùng kéo dao sắc rộng cắt miếng mẫu thử - Cá philê đông lạnh dạng khối: Dùng khoan để lấy mẫu từ khối thịt đông lạnh tan băng 18 oC đến 27 oC (nhiệt độ phòng thử nghiệm) khoảng h dùng kìm kẹp để lấy khoanh thịt Để khoảng 1h không h 18 oC đến 27 oC (nhiệt độ phòng thử nghiệm) cho tan băng đến đủ mềm để cắt dùng dao rộng kẹp để lấy miếng từ khối thịt - Các miếng cá to (ví dụ nhƣ cá ngừ philê) đông lạnh dạng khối: Để khoảng 1h không h 18 oC đến 27 oC (nhiệt độ phòng thử nghiệm) cho tan băng đến đủ mềm để cắt Dùng dao sắc rộng cắt lát khối H P - Các phần nhỏ phần riêng lẻ đông lạnh: Để khoảng h không h 18 oC đến 27 oC (nhiệt độ phòng thử nghiệm) cho tan băng đến đủ mềm cắt Xử lý mẫu nhƣ với sản phẩm tƣơi - Các miếng cá to nguyên đông lạnh (cá hồi, cá ngừ v.v….): + Cá ngừ đông lạnh nguyên con: Dùng dao cá ngừ đƣợc làm tan băng, lấy miếng thịt dƣới da Dùng khoan cá ngừ không làm tan băng U + Cá đông lạnh miếng cá đông lạnh: Nếu khối lƣợng sản phẩm có thời gian cần làm tan băng kéo dài h 18 oC đến 27 oC (nhiệt độ phịng thử nghiệm), làm tan băng tủ lạnh oC đến oC tối đa 48 h, mẫu đƣợc lấy cách dùng khoan , tránh xƣơng, H 10 CÁC NGUYÊN TẮC CỤ THỂ ĐỂ CHUẨN BỊ CÁC MẪU SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA 10.1 Sữa sản phẩm sữa dạng lỏng - Trộn mẫu thử thật kỹ cho vi sinh vật phân bố tốt cách đảo chiều lọ chứa mẫu liên tục 25 lần Tránh tạo bọt để bọt tan hết Khoảng thời gian từ trộn đến lấy phần mẫu thử không đƣợc phút - Dùng pipet vô trùng lấy mL mẫu thử cho vào chín lần thể tích dung dịch pha lỗng dùng cho mục đích chung Lắc dung dịch pha lỗng ban đầu máy lắc vortex lắc từ đến 10 giây để thu đƣợc dung dịch pha loãng 10-1 - Chuẩn bị dung dịch pha loãng 10.2 Sữa bột - Trộn kỹ lƣợng chứa lọ kín cách lắc đảo chiều liên tục - Nếu mẫu thử đựng lọ kín cịn ngun, q đầy, khó lắc trộn nên chuyển sang lọ chứa lớn trộn Mở nắp lọ chứa, dùng dao trộn lấy phần mẫu thử yêu cầu tiến hành theo dẫn dƣới Đậy nắp lọ - Cân 10 g mẫu thử cho vào bình thủy tinh vơ trùng (ví dụ nhƣ cốc có mỏ) đổ bột vào lọ pha lỗng có chứa dung dịch pha lỗng - Để hịa tan mẫu thử, xoay từ từ lọ để làm ƣớt bột sau lắc lọ 25 lần, với khoảng di động 300 mm khoảng giây Có thể dùng máy khuấy từ để thay cho việc lắc - Để yên mẫu phút, lắc - Dịch pha lỗng đƣợc làm ấm trƣớc đến 45 oC thu đƣợc huyền phù đồng sau trộn Phần đƣợc nêu rõ báo cáo thử nghiệm - Chuẩn bị dung dịch pha loãng H P 10.3 Bánh custard, tráng miệng cream (pH > 5) - Cân 10 g mẫu thử cho vào bình cầu Thêm 90 mL dung dịch pha lỗng dùng cho mục đích chung nhiệt độ phịng lắc cho tan máy khuấy từ - Chuẩn bị dung dịch pha loãng 10.4 Sữa lên men cream chua (pH < 5) - Cân 10 g mẫu thử cho vào bình cầu Thêm 90 mL dung dịch pha loãng nƣớc đệm pepton nhiệt độ phòng với pH 7,5  0,2 lắc cho tan máy khuấy từ U - Chuẩn bị dung dịch pha loãng H 10.5 Sữa bột dành cho trẻ sơ sinh - Trộn kỹ lƣợng chứa hộp kín cách lắc đảo chiều liên tục Nếu mẫu thử đựng hộp cịn ngun chƣa mở, q đầy khó lắc nên chuyển sang lọ chứa lớn trộn Mở nắp hộp Dùng đũa thủy tinh vô trùng trộn - Cân 10 g mẫu thử cho vào lọ thủy tinh vơ trùng thích hợp (ví dụ: cốc có mỏ) Sau cho mẫu bột vào chai pha lỗng có chứa dung dịch pha lỗng có chứa dung dịch pha lỗng dùng cho mục đích chung - Dung dịch pha lỗng đƣợc làm nóng trƣớc đến 45 oC không thu đƣợc huyền phù đồng sau trộn Điều phải đƣợc đề cập đến phần báo cáo kết - Để hòa tan mẫu thử, xoay từ từ chai để làm ƣớt bột sau lắc chai, ví dụ 25 lần, với khoảng di động 300 mm khoảng giây dùng máy khuấy từ Để yên phút, lắc Sau chuẩn bị dung dịch pha lỗng 10.6 Phomát phomát chế biến - Cân 10 g mẫu thử vào túi dập mẫu máy dập mẫu - Cho 90 mL dung dịch pha loãng dùng cho mục đích chung Trộn phomat phân tán - Để cho bọt tan hết - Dung dịch pha lỗng đƣợc làm ấm trƣớc đến 45oC, không thu đƣợc huyền phù đồng sau trộn Phần đƣợc nêu rõ báo cáo thử nghiệm 10.7 Kem thực phẩm, bánh kem - Cân 10 g mẫu thử cho vào túi dập mẫu máy dập mẫu - Thêm 90 mL dung dịch pha lỗng nhiệt độ phịng trộn Mẫu tan chảy trình trộn H P H U TÀI LIỆU THAM KHẢO TCVN 6507-1: 2005, Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân TCVN 6507-2: 2005, Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 2: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị mẫu thịt mẫu sản phẩm thịt TCVN 6507-3: 2005, Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 3: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị mẫu thủy sản sản phẩm thủy sản H P TCVN 6507-4: 2005, Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 4: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị sản phẩm khác với sữa sản phẩm sữa, thịt sản phẩm thịt, thủy sản sản phẩm thủy sản TCVN 6507-5: 2013, Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 5: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị mẫu sữa sản phẩm sữa U ISO 6887-1 : 1999, Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological exaphútation - Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions H BÀI 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT MỤC TIÊU HỌC TẬP Thực thành thạo phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật theo phƣơng pháp số xác xuất lớn (Most probable number) Thực thành thạo phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật đĩa thạch Thực thành thạo phƣơng pháp màng lọc Thực thành thạo phƣơng pháp phát vi sinh vật PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT TRÊN ĐĨA THẠCH – PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ BÀO TỬ NẤM MEN, NẤM MỐC H P 1.1 Phạm vi áp dụng Đếm tổng số nấm men – nấm mốc thực phẩm sản phẩm thực phẩm 1.2 Nguyên lý phương pháp Đếm số khóm nấm mọc môi trƣờng thạch chọn lọc sau ủ hiếu khí 28 C ± 1oC từ 5-7 ngày để tính số lƣợng nấm men – nấm mốc g mL mẫu thực phẩm kiểm nghiệm o U 1.3 Nội dung 1.3.1 Chuẩn bị thí nghiệm H 1.3.1.1 Thiết bị dụng cụ Sử dụng thiết bị thơng thƣờng phịng thí nghiệm vi sinh, thiết bị cần thiết để xử lý mẫu: - Tủ sấy 180 – 200 oC - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 28 ±1oC - Đĩa petri đƣờng kính 90 – 100 mm - Pipet có vạch vô trùng loại xả hết 1, 5, 10 mL - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1oC - Máy đếm khuẩn lạc (nếu có) - Bình thuỷ tinh vơ trùng, dung tích 250 – 500 mL - Ống nghiệm vô trùng, 16 – 18 mm - Máy đo pH, xác đến 0,1 đơn vị pH 25 oC 1.3.1.2 Mẫu thí nghiệm chủng vi sinh vật - Mẫu thực phẩm đƣợc thu thập ngồi mơi trƣờng (bột mỳ, ngũ cốc, loại hạt…) - Chủng chứng dƣơng: Candida albicans ATCC 10231 1.3.1.3 Môi trường nuôi cấy * Thạch Sabouraud - Thành phần: Peptone 10,0 g Glucose 20,0 g H P Agarose 20,0 g Thể tích cuối 1000 mL H2 O - Chuẩn bị: + Đun sơi để hịa tan chất Phân phối vào bình thủy tinh vơ trùng dung tích 250 mL, bình 150 mL Thanh trùng nồi hấp áp lực 110oC 30 phút U - Kiểm tra chất lƣợng môi trƣờng: + Kiểm tra vô trùng: để tủ ấm 37oC/24h + Thử chứng dƣơng: Candida albicans ATCC 10231 H + Thời hạn bảo quản: tháng 2-8oC * Dung dịch acid lactic 20% acid citric 20% * Nước thạch (pepton 10%, agarose 0.1%, H2O) 1.3.2 Quy trình thí nghiệm 1.3.2.1 Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử đậm độ pha lỗng ban đầu - Tính tổng số bào tử nấm men: Cân 10 g mẫu thử cho vào bình có sẵn 90 mL nƣớc pepton nƣớc đệm pepton (đậm độ 10-1) - Tính tổng số nấm mốc tính tổng số bào tử nấm men - nấm mốc: Cân 10 g mẫu thử cho vào bình có sẵn 90 mL nƣớc pepton có thạch (đậm độ 10-1) - Từ đậm độ pha loãng này, pha loãng đậm độ tuỳ mẫu thử 1.3.2.2 Bước 2: Nuôi cấy xác định tổng số bào tử nấm mốc * Đổ đĩa nuôi cấy - Một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy đậm độ, đậm độ hai đĩa - Cho vào đĩa mL mẫu thử pha lỗng - Thạch Sabouraud đun nóng chảy để nguội đến 45oC ± 1oC, điều chỉnh pH = 4,5 – 5,5 acid lactic 20% dung dịch acid citric 20% Rút vào đĩa 15-20 mL môi trƣờng trộn với mẫu thử cách xoay nhẹ sang hai chiều trái, phải, chiều lần - Để đĩa thạch đông tự nhiên Lưu ý: Từ pha lỗng mẫu đến đổ thạch khơng đƣợc q 30 phút * Ủ ấm - Sau thạch đông, không lật ngƣợc đĩa ủ ấm nhiệt độ 28 ± 1oC / 5-7 ngày H P - Sau ngày, đếm sơ tổng số nấm men, nấm mốc có đĩa (Chú ý nhẹ tay, khơng di chuyển mạnh hay lật ngƣợc đĩa) 1.3.2.3 Biểu thị kết Lưu ý: - Chọn tất đĩa có khơng q 150 khóm nấm để tính kết - Độ pha lỗng cao, số khóm nấm Nếu kết không hợp lý, cần phải làm lại từ đầu bƣớc nuôi cấy U Chọn đĩa hai đậm độ pha lỗng liên tiếp để tính kết có: - Tổng số nấm men từ 15-150 khóm nấm - Tổng số nấm mốc từ 5-50 khóm nấm H a Nếu chênh lệch giá trị lớn giá trị nhỏ đậm độ ≤ 2: Tính số (N) bào tử cho g mL sản phẩm theo cơng thức: Trong đó: C: Số khóm nấm men nấm mốc đếm đƣợc đĩa chọn n1,n2: số đĩa hai đậm độ liên tiếp chọn thứ thứ hai d: hệ số pha loãng đậm độ pha loãng thứ Làm trịn số kết có đƣợc, giữ lại chữ số có nghĩa Biểu thị kết dƣới dạng thập phân 1,0 9,9 nhân với 10n ( n số mũ thích hợp 10) b Nếu chênh lệch giá trị lớn giá trị nhỏ đậm độ >2 Lấy giá trị đậm độ pha lỗng thấp để tính kết c Nếu đĩa sản phẩm lỏng nguyên chất đậm độ pha lỗng ban đầu có 15 khóm nấm men khóm nấm mốc Tính kết theo trung bình cộng khóm nấm đếm đƣợc hai đĩa tính cho 1g 1mL sản phẩm d Nếu tất đĩa khơng có khóm nấm mọc Kết đƣợc đánh giá nhƣ sau: - Ít bào tử nấm men, nấm mốc mL sản phẩm - Ít 1x d bào tử nấm men, nấm mốc g sản phẩm H P Trong đó: d hệ số pha loãng đậm độ pha loãng ban đầu (10-1) 1.3.3 Sai lệch phương pháp Trong 95% trƣờng hợp, sai lệch giới hạn phƣơng pháp từ 12-37% 1.4 Biểu mẫu áp dụng cho phép thử Biểu mẫu đƣợc sử dụng cho phƣơng pháp tham khảo Phụ lục 1.5 Báo cáo thí nghiệm U Nêu rõ phƣơng pháp dùng kết tính đƣợc: số bào tử nấm men, nấm mốc g mL sản phẩm PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT – PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA – PHƢƠNG PHÁP ĐẾM MÀNG LỌC H 2.1 Phạm vi áp dụng Phƣơng pháp thử áp dụng cho mẫu nƣớc uống đóng chai kỹ thuật màng lọc, loại nƣớc khác với hệ thực vật thấp, ví dụ, nƣớc bể bơi, nƣớc dùng cho mục đích sinh hoạt 2.2 Định nghĩa Trực khuẩn mủ xanh (P aeruginosa): Vi sinh vật phát triển mơi trƣờng chọn lọc có chứa cetrimide tạo pyocianin, vi sinh vật phát triển mơi trƣờng chọn lọc có chứa cetrimide, sinh oxidase, phát xạ huỳnh quang dƣới xạ UV (360 ± 20) nm, có khả tạo ammoniac từ acetamid 2.3 Thiết bị dụng cụ - Tủ ấm 36oC±2oC - Bể điều nhiệt 45±1oC - Máy đo pH - Thiết bị lọc nƣớc chân không - Màng lọc đƣờng kính 47 mm, đƣờng kính lỗ lọc 0,45 µm - Màng lọc, đƣờng kính lỗ lọc 0,2 µm - Máy soi UV - Đĩa petri vô trùng - Ống nghiệm vơ trùng - Pipet 100-1000 µl – 10 µl đầu thích hợp - Bình 1000 mL vơ trùng - Que cấy vịng 2.4 Môi trường thuốc thử - Pseudomonas Selective agar (base) for microbiology (CN) H P - Pseudomonas CN supplement - Nutrient Agar (NA) - King’s B medium (King’s B) - Acetamide broth - Bactident oxidase U - Nessler’s reagent - Buffer Peptone Water 2.5 Lấy mẫu thử nghiệm H - Bƣớc – Ghi nhãn: Nhãn ghi rõ địa điểm, thời gian, người lấy mẫu, điều kiện bảo quản trƣớc vận chuyển tới phịng XN Mẫu khơng đƣợc phân tích khơng rõ nguồn gốc Khử trùng tay ngƣời lấy mẫu cồn 70 độ - Bƣớc 2: Dùng thấm cồn để lau hết chất bẩn đầu vòi Khử trùng vòi nƣớc inox phút với lửa đèn cồn, dùng thấm cồn lau mặt đầu vòi phút với vòi nhựa - Bƣớc 3: Mở vòi nƣớc, để nƣớc chảy hết cỡ vịng phút, sau điều chỉnh dịng chảy vừa đủ để lấy nƣớc khơng bị bắn, tránh lây nhiễm - Bƣớc 4: Mở nắp bình cho không gây nhiễm mặt nắp (ngửa nắp đặt xuống, cầm tay, không va chạm vào vật khác) - Bƣớc 5: Khử khuẩn miệng chai cách hơ qua lửa đèn cồn hứng nƣớc, để lại khoảng trống khoảng cm từ mặt dƣới nắp bình Khử khuẩn mặt nắp bình miệng bình cách hơ qua lửa đèn cồn, đóng nắp bình, tránh nhiễm khuẩn từ bên ngồi vào bình - Bƣớc 6: Sau lấy, mẫu cần bảo quản nhiệt độ 2oC – 5oC, giữ lạnh khơng q 24h chuyển đến phịng xét nghiệm - Dung tích mẫu: lít 2.6 Quy trình 2.6.1 Lọc mẫu qua màng lọc hệ thống lọc nƣớc chân không, đặt màng lọc lên đĩa petri có chứa thạch CN Lưu ý: Lọc 250 mL với nƣớc uống đóng chai; 100 mL với loại nƣớc khác 2.6.2 Lật ngƣợc đĩa ủ (36 ± 2) oC (44 ± 4) h 2.6.3 Đếm tất khuẩn lạc tạo màu xanh lam/xanh lục (pyocyanin) khẳng định P aeruginosa 2.6.4 Kiểm tra màng dƣới xạ UV với khuẩn lạc không điển hình - Đếm tất khuẩn lạc khơng tạo pyocyanin, phát huỳnh quang H P - Đếm tất khuẩn lạc khơng phát huỳnh quang, có màu nâu đỏ 2.6.5 Cấy chuyển tất (hoặc tối đa có thể) khuẩn lạc khơng điển hình sau kiểm tra sang đĩa NA, ủ (36 ± 2) oC (22 ± 2) h 2.6.6 Thử khẳng định với khuẩn lạc không tạo pyocyanin, phát huỳnh quang: Cảnh báo: Bước có sử dụng Acetamide broth, sử dụng cần tránh tiếp xúc trực tiếp với da Nếu có cố đổ tràn da, phải rửa vòi nước xử lý sơ cấp cứu theo hướng dẫn an tồn hóa chất phịng thí nghiệm U - Cấy chuyển khuẩn lạc sang Acetamide broth, ủ (36 ± 2) oC (22 ± 2) h H - Nhỏ - giọt Nessler reagent kiểm tra amoniac sinh ống Phản ứng (+) môi trƣờng đổi từ màu vàng sang đỏ gạch 2.6.7 Thử khẳng định với khuẩn lạc có màu nâu đỏ, khơng phát huỳnh quang: - Đƣa khuẩn lạc lên khoanh giấy bactident oxidase Phản ứng (+) xuất màu xanh tím than - Cấy chuyển khuẩn lạc oxidase (+) sang ống King’s B medium, ủ (36 ± 2) C ngày (kiểm tra soi UV hàng ngày khả phát huỳnh quang); Acetamide broth ủ (36 ± 2) oC khoảng (22 ± 2) h (kiểm tra tính sinh ammoniac nhƣ trên) o 2.7 Tính tốn biểu thị kết N= Trong đó: P: Số khuẩn lạc xanh lam/ xanh lục F: Số khuẩn lạc phát huỳnh quang R: Số khuẩn lạc nâu đỏ NF: Số khuẩn lạc phát huỳnh quang đƣợc thử khả sinh ammoniac CF: Số khuẩn lạc phát huỳnh quang có sinh ammoniac NR: Số khuẩn lạc nâu đỏ đƣợc thử khả sinh ammoniac, oxidase phản ứng huỳnh quang môi trƣờng King’s B CR: Số khuẩn lạc nâu đỏ sinh ammoniac, oxidase phát huỳnh quang đĩa King’s B V: Thể tích mẫu đƣợc kiểm tra - Kết đƣợc biểu thị số thập phân 1,0 9,9 x 10n CFU 100 mL 250 mL H P - Hoặc biểu thị kết định tính cách ghi Pseudomonas aeruginosa có khơng có thể tích nƣớc đƣợc kiểm tra 2.8 Kiểm soát chất lượng - Để đảm bảo chất lƣợng kết thử nghiệm cần chuẩn bị mẫu chứng dƣơng, mẫu trắng song song với kiểm tra mẫu - Chuẩn bị mẫu chứng (+) U + Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa có nồng độ 102 CFU/mL theo hƣớng dẫn lấy mẫu, pha loãng mẫu + Hút mL huyền dịch bổ sung vào 249 mL Buffer Peptone Water, lắc H + Sử dụng mẫu hỗn dịch tiến hành lọc nhƣ mẫu thử nghiệm - Chuẩn bị mẫu chứng (-) Sử dụng mẫu nƣớc đƣợc khẳng định âm tính Pseudomonas aeruginosa, tiến hành bƣớc nhƣ mẫu thử nghiệm 2.9 Biểu mẫu áp dụng cho phép thử Biểu mẫu đƣợc sử dụng cho phƣơng pháp tham khảo Phụ lục 2.10 Báo cáo thí nghiệm Phải nêu rõ phƣơng pháp sử dụng, cách thiết kế thí nghiệm, sơ đồ qui trình thí nghiệm, nhiệt độ ủ ấm kết thử thu đƣợc Báo cáo phải đề cập đến tất chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn cố ảnh hƣởng đến kết thí nghiệm PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT TÍNH THEO SỐ CĨ XÁC SUẤT LỚN NHẤT – ĐỊNH LƢỢNG E COLI GIẢ ĐỊNH 3.1 Phạm vi áp dụng - Thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Các mẫu môi trƣờng khu vực sản xuất xử lý thực phẩm Lưu ý: - Một số E coli gây bệnh không phát triển 44oC - Phƣơng pháp có độ dao động lớn nên phải thận trọng sử dụng kết 3.2 Nguyên lý phương pháp Định lƣợng vi sinh vật lên men lactose sinh khí tạo thành Indol từ Tryptophan nuôi cấy canh thang tăng sinh chọn lọc 44oC phƣơng pháp tính số có xác suất lớn (most probable number - MPN) H P 3.3 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị thơng thƣờng phịng thí nghiệm vi sinh, thiết bị cần thiết để xử lý mẫu: - Tủ sấy 180 – 200oC - Tủ ấm 37±1oC, 44±1oC - Nồi hấp áp lực U - Pipet có vạch vơ trùng 1,2,5,10 mL loại xả hết - Bình thuỷ tinh vơ trùng, dung tích 250 – 500 mL - Ống nghiệm vô trùng, 16 – 18 mm H - Máy đo pH, xác đến 0,1 đơn vị pH 25oC - Ống Durham 3.4 Mẫu thử nghiệm chủng vi sinh vật - Mẫu thực phẩm/nƣớc đƣợc thu thập ngồi mơi trƣờng - Chủng chứng dƣơng: Escherichia coli ATCC 25922 - Chủng chứng âm: Staphylococcus aureus ATCC 25923 3.5 Môi trường nuôi cấy 3.5.1 Canh thang EC (EC broth) - Thành phần: Tryptose 20,0 g Lactose 5,0 g Dikali hydrogenphosphat (K2HPO4) 4,0 g Kali dihydrogenphosphat (KH2PO4) 1,5 g Natri clorua (NaCl) 5,0 g Bile salt (muối mật) 1,5 g H2 O 1000 mL pH 6.8±0.2 - Chuẩn bị: + Đun nóng để hịa tan chất, chỉnh pH cho sau trùng, pH=6.8 25oC (nếu cần) + Phân phối môi trƣờng vào ống nghiệm vơ trùng có sẵn ống Durham, ống 10mL H P + Thanh trùng nồi hấp áp lực 121oC/15 phút Lƣu ý: sau trùng ống Durham khơng đƣợc chứa bọt khí - Kiểm tra chất lƣợng môi trƣờng: + Kiểm tra vô trùng: để tủ ấm 37oC/24h + Thử chứng dƣơng: Escherichia coli ATCC 25922 + Thử chứng âm: Staphylococcus aureus ATCC 25923 U 3.5.2 Môi trường nước Trypton - Thành phần: H Tryptose Natri clorua H2 O 10,0 g 5,0 g 1000 mL pH 7.3±0.2 - Chuẩn bị: + Hịa tan thành phần mơi trƣờng hồn chỉnh khơ nƣớc cách đun nóng, chỉnh pH cho sau trùng pH 7.3 25oC (nếu cần) + Thanh trùng nồi hấp áp lực 121oC 15 phút - Kiểm tra chất lƣợng môi trƣờng: + Kiểm tra vô trùng: để tủ ấm 37oC/24h + Thử chứng dƣơng: Escherichia coli ATCC 25922 + Thời hạn bảo quản: giữ đƣợc tháng 2-8oC 3.5.3 Canh thang Tryptose Lauryl Sunfat (Lauryl tryptose broth – Lauryl sunfat broth) - Thành phần: Nồng độ đơn (2%) Nồng độ kép (4%) Tryptose 20,0 g 40,0 g Lactose 5,0 g 10,0 g Dikali hydrogenphosphat (K2HPO4) 2,75 g 5,5 g Kali dihydrogenphosphat (KH2PO4) 2,75 g 5,5 g Natri clorua (NaCl) 5,0 g 10,0 g Natri lauryl sunfat 0,1 g 0,2 g 1000 mL 1000 mL H2 O H P pH 6.8±0.2 - Chuẩn bị: + Hòa tan thành phần mơi trƣờng hồn chỉnh khơ nƣớc cách đun nóng, chỉnh pH cho sau trùng pH 6.8 25oC (nếu cần) + Phân phối môi trƣờng vào ống nghiệm vô trùng (16x160mm) có sẵn ống Durham (đối với mơi trƣờng nồng độ đơn) vào ống nghiệm vơ trùng (20x200mm) có ống Durham (đối với môi trƣờng nồng độ kép), ống 10mL U + Thanh trùng nồi hấp áp lực 121oC/15 phút Lưu ý: sau trùng ống Durham khơng đƣợc chứa bọt khí H - Kiểm tra chất lƣợng môi trƣờng: + Kiểm tra vô trùng: để tủ ấm 37oC/24h + Thử chứng dƣơng: Escherichia coli ATCC 25922 + Thử chứng âm: Staphylococcus aureus ATCC 25923 3.5.4 Dung dịch pha loãng mẫu 3.5.4.1 Nguyên liệu Để làm tăng độ tái lập kết quả, nên sử dụng thành phần khơ, mơi trƣờng hồn chỉnh khơ để chuẩn bị dịch pha loãng Cần tuân thủ nghiêm ngặt hƣớng dẫn nhà sản xuất Các hóa chất sử dụng phải đạt chất lƣợng phân tích thích hợp để phân tích vi sinh vật Nƣớc sử dụng phải nƣớc cất có chất lƣợng tƣơng đƣơng 3.5.4.2 Dung dịch pha loãng mẫu thường dùng * Dung dịch muối pepton - Thành phần: Pepton từ casein 10,0 g Natri clorua 8,5 g H2 O 1000 mL pH 7.0±0.2 - Chuẩn bị: + Hòa tan thành phần nƣớc, đun nóng cần + Điều chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7.0±0.2 25oC, cần + Phân phối dịch pha loãng với lƣợng cần thiết để chuẩn bị huyền phù, dung dịch pha loãng thập phân vào ống nghiệm, bình có dung tích thích hợp Sai số phép đo thể tích cuối dùng sau khử trùng khơng đƣợc vƣợt ±2% Đậy nắp ống nghiệm, bình H P + Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực 121oC * Dung dịch đệm pepton - Thành phần: Pepton từ mô động vật U Na2HPO4.12H2O KH2PO4 Natri clorua H2 O - Chuẩn bị: H 10,0 g 9,0 g 1,5 g 5,0 g 1000 mL pH 7.0±0.2 + Hòa tan thành phần nƣớc, đun nóng cần + Điều chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7.0±0.2 25oC, cần + Phân phối dịch pha loãng với lƣợng cần thiết để chuẩn bị huyền phù, dung dịch pha lỗng thập phân vào ống nghiệm, bình có dung tích thích hợp Sai số phép đo thể tích cuối dùng sau khử trùng khơng đƣợc vƣợt ±2% Đậy nắp ống nghiệm, bình + Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực 121oC 3.6 Quy trình thí nghiệm 3.6.1 Phần mẫu thử huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng ban đầu) - Cân lƣợng m g với sai số cho phép ±5 %, đong thể tích V mL với sai số cho phép ±5 % (tối thiểu 10 g 10 mL, trừ có quy định khác), phần mẫu thử đại diện cho vào chén đựng vô trùng túi chất dẻo vơ trùng - Cho lƣợng dịch pha lỗng x m g x V mL Lƣợng thêm đƣợc cân đong với sai số cho phép ±5 % Lưu ý: Trong số trường hợp cụ thể, đặc biệt sản phẩm có huyền phù ban đầu + q nhiều q đặc cần phải tăng thêm dịch pha lỗng Điều phải tính đến thao tác và/hoặc phải tính đến phần tính kết Dung dịch pha loãng ban đầu định phần giá trị giới hạn phép định lượng, phụ thuộc kỹ thuật sử dụng (ví dụ, kỹ thuật rót đĩa với mL chất cấy huyền phù 1/10, có giới hạn 10 vi sinh vật gram) Nếu cần, số sản phẩm cụ thể để số đếm thấp giới hạn sử dụng lượng dung dịch pha loãng nhỏ cần ý việc cấy huyền phù ban đầu gặp khó khăn khơng cân tỷ lệ chất cấy/môi trường cấy (ức chế phát triển vi sinh vật nồng độ thành phần thực phẩm tăng) H P - Để vi sinh vật không bị tổn thƣơng thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ dịch pha lỗng suốt q trình thao tác mơ tả dƣới ln phải giữ xấp xỉ nhiệt độ phòng, trừ trƣờng hợp sản phẩm cụ thể (xem tiêu chuẩn riêng) U - Đồng hóa hỗn hợp theo khuyến cáo TCVN 6404 (ISO 7218) - Để hạt to lắng xuống 15 phút, cần Có thể sử dụng hệ thống lọc để có kết tƣơng đƣơng H - Trong trƣờng hợp định lƣợng bào tử, việc xử lý nhiệt huyền phù ban đầu, ví dụ 10 phút 80oC cần đƣợc thực sau chuẩn bị làm nguội nhanh 3.6.2 Các dung dịch pha loãng thập phân - Dùng pipet vô trùng lấy mL huyền phù ban đầu với sai số đo ±5% cho vào ống nghiệm chứa mL dịch pha lỗng vơ trùng nhiệt độ thích hợp Lưu ý: Nếu cần thể tích lớn hơn, thêm thể tích xác định (lớn 1mL) huyền phù ban đầu với sai số đo ±5 % vào ống nghiệm chứa thể tích dịch pha lỗng vơ trùng lớn gấp chín lần Để có độ xác tối ưu, khơng nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu cm Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha lỗng vơ trùng - Trộn kỹ, tốt dùng máy khuấy cơ, từ 5-10 giây để thu đƣợc dung dịch pha loãng 10-2 - Nếu cần, lặp lại thao tác sử dụng dung dịch pha loãng 10 -2 dung dịch pha lỗng tiếp theo, dùng pipet vô trùng độ pha loãng để thu đƣợc dung dịch pha loãng 10-3, 10-4 v.v thu đƣợc số lƣợng vi sinh vật thích hợp Lưu ý: Thu đậm độ pha loãng lúc đầu mẫu dạng lỏng Từ pha lỗng đậm độ tùy mẫu thử phải ước lượng ống tương ứng với độ pha loãng cuối cho kết âm tính * Thời gian tiến hành Thời gian tính từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu chất cấy tiếp xúc với môi trƣờng không đƣợc vƣợt 45 phút thời gian kể từ chuẩn bị huyền phù ban đầu đến bắt đầu chuẩn bị dung dịch pha loãng thập phân không đƣợc vƣợt 30 phút, trừ có qui định khác tiêu chuẩn riêng H P Lưu ý: Nếu nhiệt độ phòng phòng thử nghiệm cao hai khoảng thời gian phải giảm U 3.6.3 Phương pháp tính tốn số có xác suất lớn (MPN) 3.6.3.1 Nguyên lý H Phƣơng pháp MPN (phƣơng pháp có số xác suất cao nhất; số tối khả) đƣợc gọi phƣơng pháp pha loãng tới hạn hay phƣơng pháp chuẩn độ Đây phƣơng pháp dùng để đánh giá số lƣợng vi sinh vật theo số lƣợng vi sinh vật có xác suất lớn diện đơn vị thể tích mẫu Phƣơng pháp MPN dựa nguyên tắc xác suất thống kê phân bố vi sinh vật độ pha loãng khác mẫu Mỗi độ pha lỗng đƣợc ni cấy lặp lại nhiều lần (3–10 lần) Các độ pha loãng đƣợc chọn lựa cho lần lặp lại có số lần dƣơng tính có số lần âm tính Số lần dƣơng tính đƣợc ghi nhận so sánh với bảng thống kê, từ tính giá trị ƣớc đốn số lƣợng vi sinh vật mẫu Có hai hệ thống MPN ống 15 ống Thông thƣờng, việc định lƣợng đƣợc thực lặp lại lần độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng x = ống nghiệm Phƣơng pháp MPN có đặc điểm: Vi sinh vật cần định lƣợng phải có biểu đặc trƣng môi trƣờng nuôi cấy nhƣ tạo (Coliforms…), đổi màu (S aureus…) để dễ nhận định kết quả; Phƣơng pháp cho phép nhận định đƣợc mật độ vi sinh vật thấp thể tích mẫu lớn 3.6.3.2 Quy trình chung thực định lƣợng theo phƣơng pháp MPN - Cho vào ống nghiệm có chứa mơi trƣờng thích hợp cho tăng trƣởng đối tƣợng vi sinh vật cần định lƣợng thể tích xác dung dịch mẫu nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 1/10, 1/100, 1/1000) Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp - Dựa vào kết biểu kiển chứng phúth tăng trƣởng vi sinh vật cần kiểm định ống nghiệm (thƣờng tƣợng nhƣ sinh hơi, đổi màu, đục…), ghi nhận số lƣợng ống nghiệm dƣơng tính độ pha loãng - Sử dụng số liệu dựa vào bảng Mac Crady suy mật độ vi sinh vật đƣợc trình bày dƣới dạng số MPN/100mL hay số MPN/1g mẫu Độ xác trị số MPN phụ thuộc vào số lƣợng ống nghiệm lặp lại độ pha loãng… H P Bảng 1: Chỉ số MPN giới hạn tin cậy Số lƣợng ống dƣơng tính Cấp Giới hạn tin cậy mức 95% Chỉ số MPN hạng Dƣới Trên 0 < 0,30 0,00 0,94 0 0,30 0,01 0,95 0,01 1,00 0,12 1,70 0,62 0,12 1,70 0,94 0,35 3,50 U 0 1 0 0,36 0,02 1,70 1 0,72 0,12 1,70 1,1 0,4 3,5 1 0,74 0,13 2,00 1 1,1 0,4 3,5 1,1 0,4 3,5 1,5 0,5 3,8 1,6 0,5 3,8 0 0,92 0,15 3,50 1,4 0,4 3,5 H 0,30 0,61 (3) Số lƣợng ống dƣơng tính Cấp Giới hạn tin cậy mức 95% Chỉ số MPN hạng Dƣới Trên 2 2,0 0,5 3,8 1,5 0,4 3,8 1 2,0 0,5 3,8 2 2,7 0,9 9,4 2 2,1 0,5 4,0 2 2,8 0,9 9,4 2 3,5 0,9 9,4 2,9 0,9 9,4 3,6 0,9 9,4 0 2,3 0,5 9,4 3,8 0,9 10,4 6,4 1,6 18,1 4,3 0,9 18,1 1 7,5 1,7 19,9 3 36 3 38 1,8 36,0 15 38 21 40 U 29 99 3 24 99 3 46 198 3 110 20 400 3 > 110 H 12 16 9,3 H P (3) 3) Các giới hạn tin cậy đƣa bảng đƣa số ý kiến ảnh hƣởng sai số thống kê lên kết Tuy nhiên có nguồn gốc sai số khác đơi cịn quan trọng Giải thích cấp kết quả: Cấp Định nghĩa Số lƣợng ống dƣơng tính Cấp Giới hạn tin cậy mức 95% Chỉ số MPN hạng Dƣới Trên (3) Khi số lƣợng vi sinh vật sản phẩm MPN tìm đƣợc, kết số mà có khả cao thu đƣợc Hầu nhƣ có 5% trƣờng hợp thu đƣợc kết xẩy xác suất nhỏ cấp Khi số lƣợng vi sinh vật sản phẩm MPN tìm đƣợc, kết số có khả để thu đƣợc, số xác suất thấp xẩy cấp 1, nhƣng tối đa đƣợc có 1% khả thu đƣợc kết xác suất thấp hơn, mà khả xác suất nhỏ cấp Khi số lƣợng vi sinh vật sản phẩm MON tìm đƣợc, kết số mà có khả thu đƣợc hơn, số xẩy cấp 2, nhƣng tối đa có 0,1% khả thu đƣợc kết xẩy xác suất nhỏ cấp Khi số lƣợng vi sinh vật sản phẩm MPN tìm đƣợc, kết số mà có khả thu đƣợc hơn, số xác suất thấp cấp Chỉ có khả 0,1% thu đƣợc kết cấp mà khơng có nhầm lẫn H P Trƣớc bắt đầu kiểm tra, cần định xem cấp đƣợc chấp nhận, là: số cấp 1, kể 1, Khi định đựa dựa sở kết quả, điều quan trọng đƣợc chấp nhận kết cấp tối đa kết cấp Kết cấp cần đƣợc xem xét cẩn thận U H 3.6.4 Qui trình định lượng E coli phương pháp MPN 3.6.4.1 Cấy vào môi trường tăng sinh chọn lọc - Trong môi trƣờng nuôi cấy nồng độ kép: Dùng pipet vô trùng cho vào ống môi trƣờng Tryptose Lauryl Sunfat, ống 10mL mẫu thử ban đầu (nguyên) sản phẩm dạng lỏng 10 mL đậm độ 10-1 sản phẩm dạng đặc - Trong môi trƣờng nuôi cấy nồng độ đơn: Dùng pipet vô trùng cho vào ba ống môi trƣờng Tryptose Lauryl Sunfat, ống 1mL mẫu thử ban đầu sản phẩm dạng lỏng 1mL đậm độ 10-1 sản phẩm dạng đặc Đối với đậm độ pha loãng tiếp theo, dùng pipet vô trùng cho vào ống Tryptose Lauryl Sunfat nồng độ đơn, ống 1mL Ủ ống môi trƣờng tăng sinh nồng độ đơn nồng độ kép 37oC / 24 ± 2h Nếu sau 24h chƣa thấy sinh khí sinh khí chƣa rõ ràng ủ tiếp đến 48 ± 2h 3.6.4.2 Cấy vào môi trường tăng sinh chọn lọc thứ hai (môi trường E.C) Từ ống tăng sinh nồng độ đơn kép có sinh khí cấy chuyển sang ống mơi trƣờng tăng sinh thứ hai (môi trƣờng E.C) đƣợc cách thuỷ đạt tới 45 oC, ống ăng (một vịng que cấy), sau ủ nồi cách thuỷ 44oC / 24 ± 2h Nếu sau 24 h chƣa sinh khí ủ tiếp đến 48 ± 2h 3.6.4.3 Nuôi cấy nước Trypton Từ ống môi trƣờng E.C có sinh khí, cấy vào ống nƣớc Trypton đƣợc cách thuỷ đạt tới 45oC, ống ăng (một vịng que cấy), sau ủ nồi cách thuỷ 45oC / 48h 3.6.4.4 Thử khả sinh Indol Nhỏ vào ống Trypton ủ 45oC / 48h, ống 0,5 mL dung dịch Kovac’s, sau phút, thấy có vịng màu đỏ phía dung dịch phản ứng dƣơng tính Đếm số lƣợng ống dƣơng tính 3.6.4.5 Ghi nhận kết H P Mẫu thực phẩm đƣợc nhận định nhiễm E coli dịch pha loãng mẫu xét nghiệm đƣợc nuôi cấy ống nghiệm với mơi trƣờng ni cấy chọn lọc EC có lên men sinh khí sinh indol ni cấy mơi trƣờng có trypton 3.6.4.6 Tính tốn số có xác suất lớn - Tra bảng Mac Crady để tìm số MPN/100 mL số MPN/1 g mẫu - Kết đƣợc biểu thị số thập phân 1,0 9,9 x 10n CFU 100 mL g U - Hoặc biểu thị kết định tính cách ghi E coli có khơng có mẫu đƣợc kiểm tra H 3.7 Biểu mẫu áp dụng cho phép thử Biểu mẫu đƣợc sử dụng cho phƣơng pháp tham khảo Phụ lục 3.8 Báo cáo thí nghiệm Phải nêu rõ phƣơng pháp sử dụng, cách thiết kế thí nghiệm, sơ đồ qui trình thí nghiệm, nhiệt độ ủ ấm kết thử thu đƣợc Báo cáo phải đề cập đến tất chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn cố ảnh hƣởng đến kết thí nghiệm PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT – PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA SPP TRÊN ĐĨA THẠCH 4.1 Phạm vi áp dụng - Các sản phẩm dùng cho ngƣời thức ăn chăn nuôi - Các mẫu môi trƣờng khu vực sản xuất xử lý thực phẩm 4.2 Nguyên lý phương pháp Phát Salmonella mẫu thử cách xác định khuẩn lạc điển hình điển hình mơi trƣờng chọn lọc có phản ứng sinh hoá huyết đặc trƣng phép thử khẳng định 4.3 Nội dung 4.3.1 Chuẩn bị thí nghiệm 4.3.1.1 Thiết bị dụng cụ Sử dụng thiết bị thơng thƣờng phịng thí nghiệm vi sinh, thiết bị cần thiết để xử lý mẫu: - Máy đồng mẫu - Tủ sấy 180 – 200oC - Nối hấp áp lực - Tủ ấm 28 ±1oC H P - Đĩa petri đƣờng kính 90 – 100mm - Pipet có vạch vơ trùng loại xả hết 1, 5, 10 mL - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1oC - Máy đếm khuẩn lạc (nếu có) - Bình thuỷ tinh vơ trùng, dung tích 250 – 500 mL U - Ống nghiệm vô trùng, 16 – 18 mm - Máy đo pH, xác đến 0,1 đơn vị pH 25oC - Que ria cấy thủy tinh chuyên dụng H 4.3.1.2 Mẫu thử nghiệm chủng vi sinh vật - Thịt thu thập ngồi mơi trƣờng (thịt lợn tƣơi, xúc xích, lạp sƣởng…) - Chủng chứng dƣơng: Salmonella typhimurium ATCC 14028 - Chủng chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922 4.3.1.2 Môi trường nuôi cấy dịch pha lỗng ban đầu 4.3.1.2.1 Mơi trƣờng Selenite cystine * Mơi trƣờng bản: - Thành phần: Tryptone 5,0 g Lactose 4,0 g Disodium hydrogenphosphate (Na2HPO4) 10,0 g Sodium biselenite 4,0 g H2 O 1000 mL - Chuẩn bị: + Hòa tan thành phần nƣớc cách đun sôi phút Để nguội bổ sung Sodium biselenite, chỉnh pH 7.0±0.2 25oC (nếu cần) * Dung dịch L-cystin - Thành phần: L-cystin 0,1 g Dung dịch Natri hydroxyt, c (NaOH) – mol/L 15 mL H2O (vừa đủ để thể tích cuối cùng) 100 mL H P Khơng trùng * Mơi trƣờng hồn chỉnh - Thành phần: Môi trƣờng Dung dịch L-cystin 1000 mL 10 mL Chỉnh pH 7.0±0.2 (nếu cần) Đóng ống vơ trùng, ống 10 mL U Với môi trƣờng tổng hợp, lƣợng môi trƣờng cân tùy theo hƣớng dẫn ghi nhãn hộp nhà sản xuất - Chuẩn bị: H + Phân phối môi trƣờng vào ống nghiệm vô trùng, ống 10mL Đun sôi cách thủy 15 phút Không trùng nồi hấp áp lực + Bảo quản môi trƣờng 2-8oC Thời hạn bảo quản: ngày - Kiểm tra chất lƣợng môi trƣờng: + Kiểm tra vô trùng: để tủ ấm 37oC/24h + Thử chứng dƣơng: Salmonella typhimurium ATCC 14028 + Thử chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922 Lưu ý: Môi trƣờng sử dụng ngày Thời gian nuôi cấy vi sinh vật môi trƣờng không nên để 24h tác động ức chế selenite giảm sau 6-12h nuôi cấy 4.3.1.2.2 Môi trƣờng Magie clorua – lục malachit (Rappaport - Vassiliadis) * Dung dịch A - Thành phần: Trypton 5,0 g Natri clorua (NaCl) 8,0 g Kali dihydrogenphosphat (KH2PO4) 1,6 g H2 O 1000 mL - Chuẩn bị: + Hòa tan thành phần nƣớc cách đun nóng đến khoảng 70oC * Dung dịch B - Thành phần: Magie clorua ngậm nƣớc (MgCl2.6H2O) 400,0 g H P H2 O - Chuẩn bị: + Hòa tan magie clorua nƣớc 1000 mL + Dung dịch bảo quản chai thủy tinh màu nâu nhiệt độ phòng * Dung dịch C - Thành phần: U Oxalat lục malachit H2 O - Chuẩn bị: H 0,4 g 100 mL + Hòa tan Oxalat lục malachit nƣớc + Dung dịch bảo quản chai thủy tinh màu nâu nhiệt độ phịng * Mơi trƣờng hồn chỉnh - Thành phần: Dung dịch A 1000 mL Dung dịch B 100 mL Dung dịch C 10 mL Chỉnh pH cho sau trùng pH=5.2 (nếu cần) - Chuẩn bị: + Phân phối mơi trƣờng vào ống nghiệm có dung tích thích hợp, ống 10 mL + Thanh trùng nồi hấp áp lực 113oC 15 phút + Bảo quản môi trƣờng tủ lạnh 2-8oC * Môi trƣờng tổng hợp: + Cân lƣợng môi trƣờng theo hƣớng dẫn ghi nhãn hộp nhà sản xuất + Đun ấm để hòa tan chất Phân vào ống nghiệm vô trùng, ống 10 mL + Hấp trùng 115oC 15 phút + Bảo quản môi trƣờng tủ lạnh 2-8oC - Kiểm tra chất lƣợng môi trƣờng: + Kiểm tra vô trùng: để tủ ấm 37oC/24h + Thử chứng dƣơng: Salmonella typhimurium ATCC 14028 H P + Thử chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922 Lưu ý: Canh thang Rappaport vassiliadis không nên sử dụng mẫu thử nghi có S typhi 4.3.1.2.3 Môi trƣờng Tetrathionat - Thành phần: “Lab-Lemco” powder U Peptone Yeast extract 0,9 g 4,5 g 1,8 g Sodium chloride 4,5 g Calcium carbonat 25,0 g Sodium thiosunphate 40,7 g H H2 O 1000 mL pH = 8.0 ± 0,2 4.3.1.2.4 Dung dịch Iodine Iodine 6,0 g Potassium iodine 5,0 g H2 O - Chuẩn bị: 20 mL + Cân thành phần riêng rẽ lƣợng môi trƣờng tổng hợp ghi nhãn hộp theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Đun sơi để hịa tan chất Để mơi trƣờng nguội khoảng 45oC bổ sung 20 mL dung dịch iodine + Phân phối môi trƣờng vào ống nghiệm vô trùng, ống 10 mL + Không trùng nồi hấp áp lực + Bảo quản: Mơi trƣờng bảo quản 4oC vịng tháng, nhƣng mơi trƣờng bổ sung dung dịch iodine phải sử dụng - Kiểm tra chất lƣợng môi trƣờng: + Kiểm tra vô trùng: để tủ ấm 37oC/24h + Thử chứng dƣơng: Salmonella typhimurium ATCC 14028 + Thử chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922 4.3.1.2.5 Thạch đỏ phenol/lục sáng (Brilliant green agar) H P * Môi trƣờng bản: - Thành phần: “Lab-Lemco” powder Peptone Yeast extract U 5,0 g 10,0 g 3,0 g Disodium hydrogenphosphate (Na2HPO4) 1,0 g Sodium dihydrogenphosphate (NaH2PO4) 0,6 g Agarose H2 O H 12-18 g 1000 mL - Chuẩn bị: Hịa tan thành phần riêng rẽ mơi trƣờng tổng hợp cách đun sôi nhẹ Không trùng nồi hấp áp lực Để nguội tới khoảng 50oC lắc đổ đĩa * Dung dịch đỏ phenol/đƣờng: - Thành phần: Lactose 10,0 g Saccarose 10,0 g Đỏ phenol 0,09 g H2 O 100 mL - Chuẩn bị: Hòa tan thành phần nƣớc cất cách đun cách thủy 70 C 20 phút Để nguội tới khoảng 55±1oC dùng o * Dung dịch lục sáng (Brilliant greeen): - Thành phần: Lục sáng 0,00047 g H2 O 100 mL - Chuẩn bị: Hòa tan thành phần nƣớc cất Dung dịch bảo quản chỗ tối ngày để tự trùng * Mơi trƣờng hồn chỉnh: - Thành phần: Môi trƣờng 900 mL Dung dịch đỏ phenol/đƣờng 100 mL Dung dịch lục sáng H P mL - Chuẩn bị: Trộn đổ đĩa, đĩa khoảng 15 mL môi trƣờng - Kiểm tra chất lƣợng môi trƣờng: + Kiểm tra vô trùng: để tủ ấm 37oC/24h + Thử chứng dƣơng: Salmonella typhimurium ATCC 14028 + Thử chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922 U Lưu ý: Cần hong khô bề mặt môi trƣờng trƣớc nuôi cấy Các đĩa thạch chƣa khô không đƣợc giữ q 4h nhiệt độ phịng khơng q 24h tủ lạnh 4.3.1.2.6 Thạch Hektoen enteric (Hektoen enteric agar) H - Thành phần: Proteose peptone Yeast extract 12,0 g 3,0 g Lactose 12,0 g Sucrose 12,0 g Salicin 2,0 g Bile salts 9,0 g Sodium chloride 5,0 g Ammonium ferric citrate 1,5 g Acid fuchsin 0,1 g Bromothymol blue Agar 0,065 g 14,0 g H2 O 1000 mL - Chuẩn bị: + Lắc nhẹ để môi trƣờng ngấm nƣớc Đun nóng từ từ sơi để vài phút để hịa tan thạch + Khơng trùng nồi hấp áp lực + Chỉ đổ thạch đĩa môi trƣờng nguội xuống khoảng 50oC * Môi trƣờng tổng hợp: Cân môi trƣờng theo hƣớng dẫn nhà sản xuất ghi nhãn hộp Cách chuẩn bị tƣơng tự nhƣ - Kiểm tra chất lƣợng môi trƣờng: + Kiểm tra vô trùng: để tủ ấm 37oC/24h + Thử chứng dƣơng: Salmonella typhimurium ATCC 14028 H P + Thử chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922 Lưu ý: Môi trƣờng nên sử dụng Nếu bảo quản 2-8oC, tối đa nên giữ từ 3-5 ngày 4.3.2 Quy trình thí nghiệm 4.3.2.1 Tiền tăng sinh môi trường lỏng không chọn lọc - Cân 25 g mẫu thử đồng cấy vào 225 mL nƣớc đệm peptone U - Ủ nuôi cấy ống nghiệm 37±1oC / 18 ± 2oC h 4.3.2.2 Tăng sinh môi trường lỏng chọn lọc - Cấy chuyển 0,1 mL dịch nuôi cấy môi trƣờng lỏng không chọn lọc vào ống nghiệm có sẵn 10mL mơi trƣờng Rappaport Vassiliadis (RV), ủ 41,5±1oC 24±3 h Chú ý: tủ ấm không vượt nhiệt độ 42.5oC H - Cấy chuyển 10 mL dịch nuôi cấy mơi trƣờng lỏng khơng chọn lọc vào bình có sẵn 100 mL môi trƣờng selenit / xystin canh thang Tetrathionit, ủ 37±1oC C / 24±3 h 4.3.2.3 Cấy chuyển lên môi trường thạch chọn lọc - Lấy vịng que cấy dịch ni cấy từ mơi trƣờng RV cấy chuyển lên hai đĩa môi trƣờng thạch đỏ phenol / lục sáng Hektoen enteric Ủ 37oC / 21-27h - Lấy vịng que cấy dịch ni cấy từ môi trƣờng Selenit / cystin canh thang Tetrathionit, cấy chuyển lên hai đĩa môi trƣờng thạch đỏ phenol / lục sáng Hektoen Enteric Ủ 37oC / 21-27h 4.3.2.4 Nhận dạng khuẩn lạc Salmonella spp môi trường thạch chọn lọc - Trên thạch đỏ phenol lục sáng: khuẩn lạc đục, làm thay đổi màu môi trƣờng từ hồng sang đỏ - Trên thạch Hektoen Enteric: khuẩn lạc Salmonella spp điển hình thƣờng màu xanh, có tâm đen không Lưu ý: Nếu Salmonella spp mọc yếu khơng có khuẩn lạc điển hình phải ủ tiếp 35 – 37oC 24 kiểm tra lại 4.3.2.5 Phép thử khẳng định Salmonella spp * Chọn khuẩn lạc - Từ đĩa môi trƣờng chọn lọc, lấy khuẩn lạc đƣợc coi điển hình nghi ngờ để thử khẳng định - Nếu đĩa có khuẩn lạc điển hình nghi ngờ lấy tất khuẩn lạc để thử khẳng định - Ria cấy khuẩn lạc chọn lên thạch dinh dƣỡng, cho khuẩn lạc tách biệt rõ ràng H P - Ủ đĩa cấy 35oC 37oC / 18 -24h để thử khẳng định sinh hoá huyết * Thử khẳng định sinh hóa - Cấy chuyển khuẩn lạc chọn vào môi trƣờng TSI, thạch Ure, môi trƣờng Lysin decacboxyl, môi trƣờng VP, Trypton – Tryptophan NaCl 0,85 %, ủ 37oC /24h để thử tính chất sau: + Lên men đƣờng glucose, saccarose, lactose U + Khả sinh H2S + Khả phân giải Ure + Phát β - galactosidase H + Phản ứng VP + Khả sinh Indol Bảng 2: Diễn giải phản ứng sinh hoá PHÉP THỬ(1) PHẢN ỨNG TỶ LỆ % CÁC CHỦNG SALMONELLA CĨ PHẢN ỨNG(2) TSI glucose (hình thành axit) + 100 TSI glucose ( sinh khí) + 91,9(3) TSI lactose - 99,2(4) TSI succarose - 99,5 TSI hydro sunfua + 91,6 Phân giải U re - 99 Lysin decacboxyl + 94,6(5) Phản ứng  - galactosidase - 98,5(4) Phản ứng Voges Proskauer - 100 Phản ứng Indol - 98,9 (1) W.H Ewing M.M Ball; Các phản ứng sinh hoá chủng Salmonella (2) Tỷ lệ % thay đổi tuỳ theo quốc gia loại thực phẩm (3) Salmonella typhi yếm khí H P (4) Subgenus III Salmonella (Arizona) có phản ứng lactose (+) (-), phản ứng β - galactosidase luôn (+) Để nghiên cứu chủng, cần tiến hành thử nghiệm sinh hố bổ sung (5) S paratyphi âm tính 4.3.2.6 Thử khẳng định với kháng huyết đặc hiệu Phát kháng nguyên O, H Vi phản ứng ngƣng kết với kháng huyết đặc hiệu tƣơng ứng từ khuẩn lạc sau loại trừ chủng tự ngƣng kết U * Loại trừ chủng tự ngƣng kết H - Nhỏ giọt NaCl 8,5% lên lam kính - Trộn với khuẩn lạc cần kiểm tra - Lắc nhẹ 30 – 60 giây - Đọc kết tối, tốt với kính lúp Nếu thấy có tƣợng kết dính thành hạt bỏ khơng thử tiếp * Kiểm tra kháng nguyên O - Làm tƣơng tự nhƣ trên, thay nƣớc muối kháng nguyên O - Nếu ngƣng kết lần lƣợt làm tiếp phản ứng ngƣng kết với kháng nguyên O đa giá đơn giá * Kiểm tra kháng nguyên Vi Nếu khuẩn lạc điển hình, có phản ứng sinh hố phù hợp mà không ngƣng kết với kháng huyết O làm phản ứng với kháng huyết Vi Nếu có ngƣng kết, làm tiếp phản ứng với kháng huyết H đa đơn giá * Kiểm tra kháng nguyên H - Cấy chuyển khuẩn lạc nhất, không tự ngƣng kết vào môi trƣờng dinh dƣỡng bán đặc, nuôi 35-37oC / 18-24 h - Làm phản ứng ngƣng kết phiến kính, ngƣng kết, làm tiếp phản ứng với kháng huyết H đơn giá Bảng 3: Diễn giải kết phản ứng sinh hố huyết PHẢN ỨNG SINH HỐ Điển hình TỰ NGƢNG KẾT Khơng Điển hình Khơng Điển hình Có Khơng có phản ứng điển hình Khơng Khơng có phản ứng điển hình Khơng 4.3.2.7 Biểu thị kết PHẢN ỨNG HUYẾT THANH Kháng nguyên O, Vi, H dƣơng tính DIỄN GIẢI Đƣợc coi l Salmonella spp Tất phản ứng âm tính H P Khơng thử Có thể Salmonella spp Kháng ngun O, Vi, H dƣơng tính H U Tất phản ứng Khơng đƣợc coi âm tính Salmonella spp Căn vào phần diễn giải kết quả, xác định có hay khơng có Salmonella spp phần mẫu thử x g sản phẩm 4.4 Biểu mẫu áp dụng cho phép thử Biểu mẫu đƣợc sử dụng cho phƣơng pháp tham khảo Phụ lục 4.5 Báo cáo thí nghiệm Nêu rõ phƣơng pháp sử dụng kết thu đƣợc nhƣ tất điều kiện ảnh hƣởng tới kết thử nghiệm, đặc biệt nhiệt độ nuôi cấy TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Phùng Tiến, Vi sinh vật thực phẩm, 2003, Nxb Y học Kiều Hữu Ảnh, Vi sinh vật học thực phẩm, 2010, Nxb Giáo dục Việt Nam TCVN 8881:2011(ISO 16266:2010), Chất lƣợng nƣớc phát đếm Pseudomonas aeruginosa – Phƣơng pháp màng lọc TCVN 4829:2005 (ISO 06579:2002), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phƣơng pháp phát Salmonella spp đĩa thạch TCVN 7924-2: 2008 (ISO 16649-2 : 2001), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Phƣơng pháp định lƣợng Escherichia coli dƣơng tính β –glucuronidase Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 44 C sử dụng 5-bromo-4-clo-3-indolyl β -Dglucuronid TCVN H P Thomas J Montville and Karl R Matthews, Food Microbiology: Introduction, 2nd edition, American Society for Microbiology, 2008 ISO 8199:2005, Water quality – General guidance on the enumeration of microorganisms by culture H U Phụ lục 1: Biên thử nghiệm đếm tổng số bào tử nấm men, nấm mốc BIÊN BẢN THỬ NGHIỆM Đếm tổng số bào tử nấm men, nấm mốc Ngày phân tích: Ngày kết thúc: MÃ SỐ MẪU Mã hiệu chủng Tủ ấm Chứng (+) Mẫu trắng Mẻ môi trƣờng Thời gian làm Độ pha loãng Đĩa Đĩa N (CFU/mL,g) H P U H Ngƣời thực Hà Nội, ngày …… tháng … năm …… Người kiểm tra (Ký ghi rõ họ tên) Phụ lục 2: Biên thử nghiệm định lƣợng Pseudomonas aeruginosa BIÊN BẢN THỬ NGHIỆM Định lượng Pseudomonas aeruginosa Ngày phân tích: Ngày kết thúc: Đọc kết ngày Số lượng khuẩn lạc đếm đĩa Pseudomonas (CFU) MÃ SỐ MẪU Sinh pyocyanin Thời gian thực Ngƣời thực Kết luận (CFU/mL) U Chứng (+) Mẻ môi trƣờng Màu nâu đỏ, không phát huỳnh quang UV H P Tủ ấm Mẫu trắng (AT) Phát huỳnh quang UV, không sinh pyocyanin H Đọc kết ngày (nếu có) MÃ SỐ MẪU Số lượng khuẩn lạc (CFU) Ammoniac (+) Oxidase (+) Kết luận (CFU/mL) Tủ ấm Chứng (+) Mẻ môi trƣờng Thời gian thực Ngƣời thực Đọc kết sau ngày (nếu có) MÃ SỐ MẪU Số lượng khuẩn lạc (CFU) Phát huỳnh quang Amoniac H P Tủ ấm Chứng (+) Mẻ môi trƣờng U Thời gian thực Ngƣời thực H Kết luận (CFU/mL) Phụ lục 3: Biên thử nghiệm định lƣợng E coli BIÊN BẢN THỬ NGHIỆM Định lượng Escherichia coli dương tính β –glucuronidase thực phẩm Ngƣời thử nghiệm: Ngày phân tích: MÃ SỐ MẪU Độ pha loãng Đĩa Đĩa N (CFU/mL,g) H P Mã hiệu chủng Tủ ấm Chứng (+) Mẫu trắng Mẻ môi trƣờng Thời gian làm U H Ngƣời thực Hà Nội, ngày …… tháng … năm …… Người kiểm tra (Ký ghi rõ họ tên) Phụ lục 4: Biên thử nghiệm phát Salmonella spp BIÊN BẢN THỬ NGHIỆM Phát Salmonella spp đĩa thạch Ngƣời thử nghiệm: Ngày phân tích: MÃ SỐ MẪU Đĩa Đĩa Phát hiện/ Không phát H P Mã hiệu chủng Tủ ấm Chứng (+) Mẫu trắng Mẻ môi trƣờng U H Thời gian làm Ngƣời thực Hà Nội, ngày …… tháng … năm …… Người kiểm tra (Ký ghi rõ họ tên) H P H U