BÀI 1: MỞ ĐẦU I. Mục tiêu II. Nội dung 1. Nguyên tắc làm việc an toàn trong phòng thí nghiệm. 2. Nguyên tắc làm việc với vi sinh vật. 3. Nguyên tắc làm việc với hóa chất. 4. Các cấp độ an toàn phòng tí nghiệm. 5. Chuẩn bị dụng cụ. 6. Các phương pháp khử trùng. Câu 1: Tìm hiểu phương pháp khử trùng Tyndal? Giải thích cơ ở khoa học của phương pháp? Trả lời Phương pháp khử trùng Tyndal: Phương pháp này sẽ tiêu diệt tất cả các bào tử của VSV. Môi trường được hấp 34 lần ở nhiệt độ không quá 100oC3040 phút, cách nhau 24 giờ. Giữa 2 lần hấp ủ môi trường ở 2832oC24 giờ để cho bào tử nảy mầm. Các bào tử nào còn lại sống sót nảy mầm sẽ bị diệt ở lần hấp tiếp theo. Ưu điểm của phương pháp nóng ẩm: tiêu diệt được các vi khuẩn và nha bào trong một thời gian ngắn; tiệt khuẩn được nhiều dụng cụ và vật dụng khác nhau; dễ kiểm soát được nhiệt độ. Nhược điểm: nếu sử dụng không đúng, không thành thạo dễ gây tai nạn nguy hiểm. Cách tiến hành: Chất cần khử trùng được đun sôi (thường dùng nồi hấp Arnol hoặc Kock) 20 phút , sau đó được giữ ở 37oC trong 24 giờ. Lặp lại quy trình này 3 lần ta sẽ có môi trường vô trùng. Phương pháp này không diệt được các prion, thường dùng để khử trùng các môi trường nuôi cấy ở những nơi không có điều kiện sử dụng nồi áp suất cao. Cơ sở khoa học: Nguyên lí của phương pháp khử trùng Tyndall là tế bào dinh dưỡng của tế bào vi khuẩn sinh bào tử sẽ bị chết sau khi đẫ bị xử lí bằng phương pháp đun sôi , các bào tử còn sót lại được ủ thêm một thời gian để chúng nảy mần thành các tế bào dinh dưuoxng, sau đó tiếp tục đun sôi để diệt các tế bào dinh dưỡng vừa được nảy mầm các bào tử chịu nhiệt này. BÀI 2: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I. Mục tiêu Củng cố và nâng cao kiến thức về loài nguyên tố dinh dưỡng dành cho vi sinh vật. Phân biệt được các loại nguyên tố dinh dưỡng. Pha chế môi trường dinh dưỡng. Củng cố kiến thức khử trùng. II. Nội dung 1. Giới thiệu về môi trường dung dịch a. Khái niệm Môi trường dung dịch gồm các chất dinh dưỡng và yếu tố vật lý cần thiết cho sự sinh trưởng của vi sinh vật (pH, nước, hàm lượng O2, hòa tan). b. Yêu cầu môi trường dinh dưỡng Đủ dinh dưỡng – vô trùng. Không chứa thành phần gây độc. c. Phân loại môi trường dinh dưỡng Dựa vào TP đ của môi trường Dựa vào trạng thái vật lí Dựa theo mụ đích sử dụng. Câu 2: Trong môi trường dinh dưỡng, tại sao lại có độ nhớt? Nhớt quá thì sao? Không có thì sao? Trả lời Trong môi trường dinh dưỡng cần có độ nhớt vì độ nhớt phụ thuộc hàm lượng nước, lực liên kết và cấu dạng phân tử protein. Độ nhớt thay đổi theo pha phát triển của tế bào thực vật chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, thành phần ion khoáng hấp thụ,.. Độ nhớt tỉ lệ nghịch với mức độ trao đổi chất và tỉ lệ thuận với khả năng chống chịu. Khi độ nhớt giảm thúc đẩy sự di chuyển của các phân tử hữu cơ trong tế bào, kéo theo đó thì quá trình trao đổi chất sẽ tăng lên. Độ nhớt giảm thì cường độ trao đổi chất tăng lên. Khi độ nhớt tăng, thì khả năng chống chịu tăng, nhưng cường độ trao đổi chất giảm. Câu 3: Môi trường nuôi cấy mô thực vật gồm thành phần dinh dưỡng gì? Có gì giống và khác so với môi trường nuôi cấy vi sinh vật? pH nuôi cấy mô thực vật là bao nhiêu? Cách pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật? Tại sao các chất sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô? Có những hormone nào? Tìm hiểu cách khử trùng mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật. Trả lời Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật: Các chất khác: + Dịch chiết tự nhiên (chiết khoai tây, nước dừa, nước cam, nước cà chua, chiết nấm men)… + Chất làm đặc MT: agar 0,510% + Bổ sung than hoạt tính 0,2 – 0,3% (để tạo MT tối, hướng đất kích thích tạo rễ, dùng cho phôi vô tính, cây gỗ) Sự khác nhau giữa nuôi cấy vi sinh vật và nuôi cấy mô thực vật: • Nuôi cấy vi sinh vật: Nuôi cấy vi sinh vật là phương pháp nhân lên các vi sinh vật bằng cách cho chúng sinh sản trong môi trường nuôi cấy định trước trong điều kiện phòng thí nghiệm được kiểm soát • Dực vào sự khác nhau về mặt hình thái (rắn, lỏng) và thành phần,tuỳ thuộc vào vi sinh vật được nuôi cấy và mục đích nuôi cấy:chia làm 2 loại môi trường chính + môi trường tự nhiên (dựa trên kinh nghiệm), môi trường tổng hợp (dựa trên các thành phần hoá học). • Nuôi cấy mô tế bào thực vật: là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng, không khí lọc qua HEPA, được thực hiện trong tủ cấy pH nuôi cấy mô thực vật là 5.66.0. Cách pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật: + Tiến hành pha Skoog I, II, III cảu môi trường MS + Pha Stock vitamin Morel, Glycin, inosytol + Pha các stock chất điều hòa sinh trưởng Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR plant growth regulator) để đạt được các đặc tính sinh trưởng mong muốn cho loài thực vật giống cây trồng mục tiêu. Có bốn nhóm chính của PGR: auxin, cytokinin, gibberellins và axit abscisic. + Auxin: Kích thích sự dãn tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo (callus), hình thành rễ bất định. Các auxin thường dùng: 2,4Diclo phenoxi axetic axit (2,4D), a naphtil axetic axit (aNAA), pindol axetic axit (IAA), p—indol butyric axit (IBA). Tuỳ theo mục đích mà nồng độ sử dụng từ 10“5 1CT6M. + Xytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi. Vì vậy, tỉ lệ sử dụng auxin xytokinin sẽ quyết định sự phân hoá chồi hay phân hoá rễ. Các chất thường sử dụng: benzyl adenin (BA), benzyl amino purin (BAP), kinetin (fufuryl amino purin), zeatin. + Axit gibberellic được sử dụng để kích thích sự kéo dài chồi và axit abscisic có thể thúc đẩy và tăng chất lượng tổng thể của phôi soma. Cách khử trùng mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật: Quy trình khử trùng mẫu cây + Rửa mẫu sạch (xà phòng) dưới vòi nước + Tráng cồn 70 độ + Ngâm mẫu ngập trong dung dịch khử trùng + Rửa bằng nước cất vô trùng nhiêu lần BÀI 3: PHÂN LẬP VI SINH VẬT VÀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT I. Mục tiêu Phân lập được các vsv Nuôi cấy mô tế bào thực vật Khử trùng II. Nội dung
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN HỌC: THỰC HÀNH VI SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Họ tên sinh viên : Phan Thị Bích Ngọc – 705301080 Lớp : K70CLC - Khoa SP Sinh Học Giảng viên hướng dẫn: TS Phan Duệ Thanh Hà Nội, Ngày tháng năm 2023 BÀI 1: MỞ ĐẦU I Mục tiêu II Nội dung Nguyên tắc làm việc an tồn phịng thí nghiệm Ngun tắc làm việc với vi sinh vật Nguyên tắc làm việc với hóa chất Các cấp độ an tồn phịng tí nghiệm Chuẩn bị dụng cụ Các phương pháp khử trùng Câu 1: Tìm hiểu phương pháp khử trùng Tyndal? Giải thích khoa học phương pháp? Trả lời - Phương pháp khử trùng Tyndal: Phương pháp tiêu diệt tất bào tử VSV Môi trường hấp 3-4 lần nhiệt độ không 100 oC/30-40 phút, cách 24 Giữa lần hấp ủ môi trường 28-32 oC/24 bào tử nảy mầm Các bào tử lại sống sót nảy mầm bị diệt lần hấp Ưu điểm phương pháp nóng ẩm: tiêu diệt vi khuẩn nha bào thời gian ngắn; tiệt khuẩn nhiều dụng cụ vật dụng khác nhau; dễ kiểm soát nhiệt độ Nhược điểm: sử dụng không đúng, không thành thạo dễ gây tai nạn nguy hiểm Cách tiến hành: Chất cần khử trùng đun sôi (thường dùng nồi hấp Arnol Kock) 20 phút , sau giữ 37oC 24 Lặp lại quy trình lần ta có mơi trường vơ trùng Phương pháp không diệt prion, thường dùng để khử trùng môi trường nuôi cấy nơi điều kiện sử dụng nồi áp suất cao - Cơ sở khoa học: Nguyên lí phương pháp khử trùng Tyndall tế bào dinh dưỡng tế bào vi khuẩn sinh bào tử bị chết sau đẫ bị xử lí phương pháp đun sơi , bào tử cịn sót lại ủ thêm thời gian để chúng nảy mần thành tế bào dinh dưuoxng, sau tiếp tục đun sơi để diệt tế bào dinh dưỡng vừa nảy mầm bào tử chịu nhiệt BÀI 2: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I Mục tiêu - Củng cố nâng cao kiến thức loài nguyên tố dinh dưỡng dành cho vi sinh vật - Phân biệt loại nguyên tố dinh dưỡng - Pha chế môi trường dinh dưỡng - Củng cố kiến thức khử trùng II Nội dung Giới thiệu môi trường dung dịch a Khái niệm - Môi trường dung dịch gồm chất dinh dưỡng yếu tố vật lý cần thiết cho sinh trưởng vi sinh vật (pH, nước, hàm lượng O2, hòa tan) b Yêu cầu môi trường dinh dưỡng - Đủ dinh dưỡng – vô trùng - Không chứa thành phần gây độc c Phân loại môi trường dinh dưỡng - Dựa vào TP đ mơi trường - Dựa vào trạng thái vật lí - Dựa theo mụ đích sử dụng Câu 2: Trong mơi trường dinh dưỡng, lại có độ nhớt? Nhớt q sao? Khơng có sao? Trả lời Trong mơi trường dinh dưỡng cần có độ nhớt độ nhớt phụ thuộc hàm lượng nước, lực liên kết cấu dạng phân tử protein Độ nhớt thay đổi theo pha phát triển tế bào thực vật chịu ảnh hưởng nhiệt độ, thành phần ion khoáng hấp thụ, Độ nhớt tỉ lệ nghịch với mức độ trao đổi chất tỉ lệ thuận với khả chống chịu Khi độ nhớt giảm thúc đẩy di chuyển phân tử hữu tế bào, kéo theo q trình trao đổi chất tăng lên Độ nhớt giảm cường độ trao đổi chất tăng lên Khi độ nhớt tăng, khả chống chịu tăng, cường độ trao đổi chất giảm Câu 3: Môi trường nuôi cấy mô thực vật gồm thành phần dinh dưỡng gì? Có giống khác so với môi trường nuôi cấy vi sinh vật? - pH nuôi cấy mô thực vật bao nhiêu? - Cách pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật? - Tại chất sinh trưởng bổ sung vào mơi trường ni cấy mơ? Có hormone nào? - Tìm hiểu cách khử trùng mẫu ni cấy mơ tế bào thực vật Trả lời - Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật: Các chất khác: + Dịch chiết tự nhiên (chiết khoai tây, nước dừa, nước cam, nước cà chua, chiết nấm men)… + Chất làm đặc MT: agar 0,5-10% + Bổ sung than hoạt tính 0,2 – 0,3% (để tạo MT tối, hướng đất kích thích tạo rễ, dùng cho phơi vơ tính, gỗ) - Sự khác nuôi cấy vi sinh vật nuôi cấy mô thực vật: Nuôi cấy vi sinh vật: Nuôi cấy vi sinh vật phương pháp nhân lên vi sinh vật cách cho chúng sinh sản môi trường nuôi cấy định trước điều kiện phịng thí nghiệm kiểm sốt Dực vào khác mặt hình thái (rắn, lỏng) thành phần,tuỳ thuộc vào vi sinh vật nuôi cấy mục đích ni cấy:chia làm loại mơi trường + mơi trường tự nhiên (dựa kinh nghiệm), môi trường tổng hợp (dựa thành phần hố học) Ni cấy mơ tế bào thực vật: tổng hợp kỹ thuật sử dụng để trì ni cấy tế bào, mơ quan thực vật điều kiện vô trùng mơi trường ni cấy giàu dinh dưỡng, khơng khí lọc qua HEPA, thực tủ cấy - pH nuôi cấy mô thực vật 5.6-6.0 - Cách pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật: + Tiến hành pha Skoog I, II, III cảu môi trường MS + Pha Stock vitamin Morel, Glycin, inosytol + Pha stock chất điều hịa sinh trưởng - Mơi trường nuôi cấy mô thực vật thường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR- plant growth regulator) để đạt đặc tính sinh trưởng mong muốn cho loài thực vật / giống trồng mục tiêu Có bốn nhóm PGR: auxin, cytokinin, gibberellins axit abscisic + Auxin: Kích thích dãn tế bào, kích thích hình thành mơ sẹo (callus), hình thành rễ bất định Các auxin thường dùng: 2,4-Diclo phenoxi axetic axit (2,4D), a naphtil axetic axit (a-NAA), p-indol axetic axit (IAA), p—indol butyric axit (IBA) Tuỳ theo mục đích mà nồng độ sử dụng từ 10“5 - 1CT6M + Xytokinin: Kích thích phân chia tế bào định phân hố chồi Vì vậy, tỉ lệ sử dụng auxin/ xytokinin định phân hoá chồi hay phân hoá rễ Các chất thường sử dụng: benzyl adenin (BA), benzyl amino purin (BAP), kinetin (fufuryl amino purin), zeatin + Axit gibberellic sử dụng để kích thích kéo dài chồi axit abscisic thúc đẩy tăng chất lượng tổng thể phôi soma - Cách khử trùng mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật: Quy trình khử trùng mẫu + Rửa mẫu (xà phòng) vòi nước + Tráng cồn 70 độ + Ngâm mẫu ngập dung dịch khử trùng + Rửa nước cất vô trùng nhiêu lần BÀI 3: PHÂN LẬP VI SINH VẬT VÀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT I Mục tiêu - Phân lập vsv - Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Khử trùng II Nội dung Phân lập VSV - Bước 1: Pha chế môi trường theo công thức phần chuẩn bị - Bước 2: Thu mẫu đất Khoa Sinh Học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội - Bước 3: Pha loãng mẫu - Bước 4: Nuôi cấy, tạo khuẩn lạc riêng lẻ từ quần thể VSV môi trường phân lập - Bước 5: Thu nhận chủng - Bước 6: Kiểm tra độ khiết - Bước 7: Giữ giống VSV sau phân lập - Bước 8: Hoạt hóa giống Ni cấy mơ tế bào thực vật a Quy trình ni cấy mơ tế bào thực vật từ phơi Khử trùng phơi lúa: bóc vỏ lúa: 10 hạt/sv B1 Rửa nước cất vô trùng B2 Tráng cồn 70%, 30 giây B3 Rửa nước cất vô trùng B4 Ngâm Javen, 30 phút B5 Rửa nước cất vô trùng (3 lần), B6 Ngâm nước cất vô trùng, 10 phút, cấy vào môi trường nuôi cấy b Quy tình ni cấy mơ tế bào từ quan rời B1: Mở dụng cụ khử trùng như: giấy báo, panh, kéo,… B2: Dùng kéo cắt mẫu lá, cắt thành miếng nhỏ với kích thước 0,5x1cm, cắt cạnh B3: Cấy mẫu vào bình khoảng -3 mẫu Đặt mẫu cho mép mẫu tiếp xúc với thạch B4: Chụp túi bóng trùng lên ni cấy phịng chiếu sáng 12 -16 giờ/ ngày 250C Câu 1: Trong kĩ thuật vào mẫu cần ý ? - Đeo găng tay vô trùng - Sát khuẩn tay dung dịch cồn 70% - Sát trùng bàn làm biệc trước sau làm việc dung dịch hỗn hợp cồn isopropanol - Thực không gian vô trùng lửa đèn cồn - Que cấy, que trang, pipet phải khử trùng nước sau lấy mẫu vsv Câu 2: Sau thời gian nuôi cấy phân biệt mẫu nuôi cấy kĩ thuật mẫu chưa kĩ thuật Mẫu đạt chuẩn: - Khơng nhiễm nấm, bệnh - Mẫu hình thành rễ, có sức sống tốt, phát triển tốt Câu 3: Kết cuối phương pháp nuôi cấy phôi quan rời có khác ? Giải thích kết ? Nuôi cấy phôi Nuôi cấy quan rời Mục đích Ni cấy cứu phơi lai xa Tạo phơi vơ tính Phá ngủ nghỉ hạt Ni cấy tế bào đơn tách Nhân dòng lai xa tế bào trần Tạo có biến dị soma Đặc điểm Cây có tính Cây có kiểu gene giống trạng, kiểu gene khác mẹ với mẹ ban đầu Giải thích Phơi từ hạt có thụ tinh tổ hợp tự giao tử bố mẹ biến dị tổ hợp Nhân vơ tính từ quan sinh dưỡng mẹ, mang đặc điểm di truyền mẹ BÀI 4: QUAN SÁT HÌNH THÁI VÀ ĐẾM SỐ LƯỢNG VSV I Mục tiêu - Phân biệt số hoạt động vi khuẩn lạc, vi khuẩn, xạ khuản, nấm men, nấm mốc - Đếm số lượng tế bào vsv phương pháp khác - Thành thạo kính hiển vi quang học quan sát hình thái vsv - Quan sát phân biệt vẽ hình hình thái vsv ( nấm mốc, xạ khuẩn) II Nội dung Phương pháp đếm số lượng vsv 1.1 Đếm số lượng / đĩa thạch - Trung bình hộp lồng có từ – nhóm vi sinh vật (thường nấm mốc, vi khuẩn) - Hộp lồng phân lập VSV đạt yêu cầu: Đếm khuẩn lạc Khuẩn lạc không bị xếp chồng lên nhiều 30 < CFU < 300 - Cơng thức tính số lượng tế bào vi sinh vật có 1mL dung dịch phân lập 10 x CFU N= (tế bào/ mL) (CT 1) V x Df Trong đó: N số lượng tế bào 1mL mang phân lập Df hệ số pha loãng CFU số khuẩn lạc đếm hộp lồng V thể tích cho vào hộp lồng (0,1mL) Ta có kết phân lập VSV mơi trường sau: - Môi trường Hansen: KL, Df = 10-5 Áp dụng CT 1: N = 80.000.000 (tế bào/ mL) - Môi trường Czapek-Dox: 19 KL, Df = 10-5 Áp dụng CT 1: N = 190.000.000 (tế bào/ mL) - Môi trường Gauze I: 23 KL, Df = 10-4 Áp dụng CT 1: N = 23.000.000 (tế bào/ mL) - Môi trường MPA: 15 KL, Df = 10-5 Áp dụng CT 1: N = 150.000.000 (tế bào/ mL) 1.2 Đếm trực tiếp buồng đếm - Cách đếm: Tiến hành đếm ô bốn góc giữa; thực đếm từ trái sang phải, từ xuống theo đường ziczac Cả ô lớn đếm khoảng 150-200 tế bào đạt yêu cầu Số tế bào: N = A x 25 : V : n 1.3 - Trong đó: N: số tế bào ml dịch huyền phù A: số tế bào trung bình lớn V: thể tích lớn n: độ pha lỗng mẫu 25: số ô lớn buồng đếm Kết quả: N = (10 x 25) : x 10−6 : = x 10−6 tế bào/ml 64 Đếm số lượng phương pháp đo độ đục Đo độ đục máy quang phổ với bước sóng 620 (600) nm Mật độ quang đạt yêu cầu: 0,1 < OD < 0,8 Pha lỗng mẫu (µL): Df Vgốc Vnước Vtổng OD620 1:10 100 900 1000 0,080 1:20 50 950 1000 0,070 1:25 40 960 1000 0,063 1:40 25 975 1000 0,033 1:50 20 980 1000 0,092 1:100 10 990 1000 0,275 10 Quan sát nhận biết khuẩn lạc VSV Loại VSV Đặc điểm Đường kính khuẩn lạc, D (mm) Hình dạng (nhìn thẳng từ xuống) Hình dạng (nhìn nghiêng) Nấm mốc Nấm men Xạ khuẩn Vi khuẩn 2; - 20; 30 mm - 10 mm 1-5 mm 1- 30 mm hình trịn, màu xanh lục đậm, bên ngồi bơng xù bơng xù, bụi bột hình trịn hình trịn, có phóng xạ đối xứng tâm đa dạng hình thái: trịn, méo; Màu sắc Trắng, xanh, đỏ, tím, vàng Mùi lạc khuẩn Mùi mốc Độ nhớt khô, bụi không xù, bụi bột lồi lên Đơn điệu Trắng trong, vàng nhạt Mùi thơm nhẹ độ nhớt vừa phải 11 không xù, bụi bột Xanh, đỏ, tím vàng Mùi đất, mùi kháng sinh bụi Đa dạng Vàng cam, xanh đỏ Mùi chua thối có độ nhớt nhiều Ni cấy VSV - Nấm mốc: Aspergillus (Asp) Penicillium (Peni) nuôi cấy mơi trường Czapek – Dox - Xạ khuẩn: Thồn NĐ nuôi cấy môi trường Gauze I - Vi khuẩn: Bacillus subtilis E.Coli môi trường MPA - Nấm men: MN nuôi cấy môi trường Hansen Quan sát nấm mốc xạ khuẩn - Quan sát nấm mốc lam kính ép Nấm Aspergillus (Asp) Nấm Penicillium (Peni) - Quan sát xạ khuẩn hộp lồng có xẻ rãnh thạch Thồn NĐ Xoăn Thẳng 12 BÀI 5: QUAN SÁT HÌNH THÁI CẤU TRÚC TẾ BÀO VSV I Mục tiêu - Làm tiêu cố định vsv - Tiêu nhuộm đơn vsv -> quan sát hình thái cấu trúc bê tế bào vsv - Thành thạo kĩ nhuộm kép - Sử dụng thành thạo kính hiển vi quang học II Nội dung Quan sát hình thái cấu trúc tế bào vsv 1.1 Làm tiêu cố định vsv Bước 1: Lấy giọt nước đầu que cấy lên lam kính • Bước 2: Khử trùng đầu que cấy để lấy mẫu VSV: hơ nóng ho vào miệng ống nghiệm cho nguội lấy VSV • Bước 3: Dàn VSV lên giọt nước huyền phù (dàn 1cm) khử trùng đầu que cấy để giết chết VSV • Bước 4: vết bơi khơ cố định • Bước 5: Nhuộm quan sát 1.2 Làm tiêu nhuộm đơn - Mẫu vsv quan sát: Vi khuẩn: B.Sub, E.coli, Lactobacillus Nấm men: Mn7 - Các bước tiến trình làm tiêu cố định, nhuộm đơn: Làm vết bôi: cho giọt nc lên lam kính, lấy sinh khối vsv chuẩn bị giọt huyền phù, dàn mỏng giọt huyền phù 2.Cố định: làm khô vết bôi lửa đèn cồn Nhuộm: lấy giọt thuốc nhuộm tím geltian(1p) sau rửa nước -> thấm khơ tiêu -> nhỏ dầu set soi - Kết quan sát (hình ảnh hình vẽ VSV quan sát được): E.coli 13 Vi khuẩn Bacillus (bào tử không bắt màu, suốt, nằm phần nguyên sinh chất bắt màu.) Lactobacillus Nấm men Mn7 (màng nhầy không màu, suốt) Quan sát phân biệt thành tế bào vi khuẩn - Mẫu VSV quan sát: B.Sub + E.coli E.coli + LactoBacillus - Các bước tiến trình làm tiêu cố định, nhuộm Gram: Làm tiêu nhuộm kép B1: lập vết bôi B2: cố định vết bôi B3: Nhuộm tím gentian sau -3 phút rửa nước B4: Nhuộm Lugol từ 0,5 -1p Sau rửa nước B5: Tẩy màu cồn 90 độ khoảng 15 -20 giây Sau rửa nước B6: Nhuộm Safranin khoảng 30 giây rửa lại nước B7: Thấm khô tiêu nhuộm kép B8: Soi kính dầu Kết quan sát (hình ảnh hình vẽ VSV quan sát được): 14 B.Sub + E.coli E.coli+ LactoBacillus B.Sub (VK Gram [+] + E.coli (VK Gram [-]) (Màu hồng: E.coli (VK Gram [-]), Màu tím: LactoBacillus (VK Gram [+]) BÀI 6: ĐỘNG THÁI SINH TRƯỞNG VÀ LÊN MEN CỦA VSV I MỤC TIÊU - Củng cố lí thuyết số vsv với q trình sinh trưởng vsv - Phân tích chế sinh hóa q trình lên men - Thiết lập thành cơng thí nghiệm men động thái sinh trưởng vsv, phân tích giải thích kết thí nghiệm II NỘI DUNG Quá trình lên men rượu a Bản chất PTHH: C6H12O6 ->->->2C2H5-OH + 2CO2 + ATP b VSV Nấm men (Mn 7) c Thí nghiệm Chuẩn bị: Bình Smith, dung dịch đường Sucrose 10%, 0.1 % amonium sunfat (NH4)2SO4 Chuẩn bị dịch lên men: 9g đường +81 mL H2O + 0.9mL (NH4)2SO4 Nuôi tĩnh to 30oC ngày Lấy mẫu: ống ống 1mL dung dich nuôi cấy vòng ( 0h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h) Các bước tiến hành: Bước 1: Cho chất vào bình tam giác sau cân (M0) Bước 2: Ủ tuần cân lại (M1) 15 Bước 3: Tính hiệu suất q trình lên men d Kết thí nghiệm Quá trình lên men giấm a Bản chất PTHH: C2H5OH +O2 -> CH3COOH + H2O + Q b VSV Acetobacter c Thí nghiệm Chuẩn bị: Bình tam giác, bia, chuối chín, acid acetic 1N, giấm ăn Các bước tiến hành: Bình thí nghiệm: 45mL bia + 2-3 lát chuối + 0,5 mL acid acetic 1N + 5mL dịch giấm ăn Bình đối chứng: 45mL bia + 5mL H2O + 0.5mL acid acetic 1N e Kết thí nghiệm Giấm có mùi chua, thơm màu vàng nhạt Quá trình lên men lactic a Bản chất: Đồng hình: C6H12O6 ->->-> CH3CHO-COOH + Q Dị hình: C6H12O6 ->->-> CH3CHO-COOH + C2H5OH + CO2+ …Q b VSV Lactobacteriacea c Thí nghiệm làm sữa chua Sữa đặc + 1,2L H2O sôi 45oC quấy để nguội + hộp sữa chua -> trộn -> ủ Nhuộm đơn Rượu 16 Giấm Nước dưa chua BÀI 8: ĐỊNH LOẠI VI SINH VẬT I Mục tiêu - Củng cố mặt lý thuyết đặc điểm hình thái, số đặc điểm hóa sinh nhóm VSV ứng dụng chúng phân loại VSV - Ơn lại lí thuyết kĩ thuật phân tử phân loại 17 - Thực thí nghiệm định lượng VSV hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc phản ứng hóa sinh - TH bước tách chiết mẫu DNA từ vi khuẩn E.coli bước phản ứng PCR từ DNA tổng số - Cách kiểm tra kết phản ứng PCR mẫu DNA tổng số kĩ thuật điện di II Nội dung Kiểm tra kết Enzym, kháng sinh, kháng kháng sinh 1.1 Kiểm tra Enzym loại: amylase + protease - Tế bào ( xanh tím ) khơng có xanh tím -> vùng phân giải - Đo đường kính phân giải Vi sinh vật nguyên cứu Tinh bột tan Gelatin V37 48 – 10 = 38 Khơng lên kết Xạ khuẩn Thồn 18 – 10 = Xạ khuẩn NĐ9 22 – 10 = 12 Câu hỏi: Trong chủng nghiên cứu, chủng có amylase mạnh ? - Hoạt tính emzym amylase vk V37 mạnh nhất, Xạ khuẩn NĐ9 mạnh thứ cuối xạ khuẩn Thồn 1.2 Kiểm tra kháng sinh nhóm sinh vật kiểm định: Bacillus + Ecoli Vi sinh vật nguyên Bacillus Ecoli cứu V37 15 – 11 = 12 – 10 = Xạ khuẩn Thồn Khơng có Xạ khuẩn NĐ9 20 – 12 = 1.6 – = 0.6 Câu hỏi: Trong vi sinh vật nghiên cứu, chủng có hoạt tính kháng sinh tốt Ecoli ? Bacillus ? Ecoli xạ khuẩn NĐ9 mạnh nhất, khả hỏa tính kháng sinh tốt Bacillus xạ khuẩn NĐ9 mạnh nhất, khả sinh kháng sinh tốt 18 1.3 Kiểm tra kháng kháng sinh Vi sinh vật ngun cứu Ecoli Bacillus Penicilin Khơng có vi khuẩn 3.2 – = 2.2 Câu hỏi: VSV có khả kháng kháng sinh? - Hoạt tính kháng kháng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis mạnh với kháng sinh Chloramphenicol - Vi khuẩn E coli khơng có khả kháng kháng sinh Định loại VSV 2.1 Định loại VSV hình thái Loại VSV Nấm mốc Nấm men Xạ khuẩn Vi khuẩn Đường kính khuẩn lạc, D (mm) 2; - 20; 30 mm - 10 mm 1-5 mm 1- 30 mm Hình dạng (nhìn thẳng từ xuống) hình trịn, màu xanh lục đậm, bên ngồi bơng xù hình trịn hình trịn, có phóng xạ đối xứng tâm đa dạng hình thái: trịn, méo; Hình dạng (nhìn nghiêng) bơng xù, bụi bột không xù, bụi bột lồi lên Màu sắc Trắng, xanh, đỏ, tím, vàng Đơn điệu Đặc điểm Trắng trong, vàng nhạt Mùi lạc khuẩn Mùi mốc Mùi thơm nhẹ Độ nhớt khô, bụi độ nhớt vừa 19 không bơng xù, bụi bột Xanh, đỏ, tím vàng Mùi đất, mùi kháng sinh bụi Đa dạng Vàng cam, xanh đỏ Mùi chua thối có độ nhớt nhiều phải 2.2 Định loại hóa sinh Catalase Ecoli có nhiều bọt khí xuất hiện, catalase dương Lactozo Bacillus catalase dương, bọt khí Vi sinh vật ecoli có hoạt tính mạnh, sau dần bacillus cuối lactozo Potacium hydroxide test - Gram (-) : E.coli nhớt - Gram (+): Lactozo không nhớt BÀI 9: ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG ĐIỆN DI VÀ THỰC HÀNH Ở THPT I Mục tiêu - Củng cố lý thuyết công nghệ gen ứng dụng định loại vsv - Thực thí nghiệm điện di để kiểm tra kết PCR mẫu DNA tổng số - Thiết kế thí nghiệm trường phổ thơng II Nội dung 20