NỘI DUNG THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG GIỚI THIỆU CHUNG 1. Giáo trình phục vụ môn học: SV có thể sử dụng bất kì giáo trình nào về thực hành Vi sinh đại cương. 2. Nội dung học: Các thiết bị trong phòng thí nghiệm Vi sinh, chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, phương pháp khử trùng. Phân lập, cấy chuyền VSV. Làm tiêu bản, quan sát tế bào VSV. Đếm tế bào men bằng Buồng đếm hồng cầu. Khảo sát 1 số phản ứng sinh hóa của vi khuẩn. 3. Yêu cầu của GV với SV: Yêu cầu kiến thức: chuẩn bị bài trước khi đến phòng thí nghiệm. GV sẽ kiểm tra bài, nếu bất kì SV nào trong nhóm không chuẩn bị bài, cả nhóm sẽ bị nghỉ buổi học đó và không được dạy và học lại. Sau khi kết thúc môn học, SV có 510 ngày để viết báo cáo. Nộp bài cho 1 bạn (có chỉ định) trong nhóm. Bài báo cáo có ghi rõ họ, tên, nhóm, tổ. Bài báo cáo SV có thể đánh máy hoặc viết tay. Yêu cầu kĩ năng: quan sát GV thực hiện thao tác và làm đúng các yêu cầu khi thực hiện thao tác nuôi cấy VSV, làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi (KHV). Yêu cầu thái độ: nghiêm túc, nhanh nhẹn, thực hiện đúng quy định trong PTN và các yêu cầu của GV. Tham gia tích cực trả lời câu hỏi của GV cũng như đặt câu hỏi trong buổi học. BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG. PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 1.1 Các thiết bị trong phòng thí nghiệm: Thiết bị Mục đích Cân Cân hóa chất, cân môi trường Bếp khuấy từ Khuấy trộn, hòa tan, gia nhiệt các loại môi trường Máy đồng nhất mẫu Phân tán vi sinh vật vào mẫu đồng nhất Nồi hấp tiệt trùng Tiệt trùng môi trường, dụng cụ bằng hơi nước bão hòa ở nhiệt độ cao, áp suất cao Tủ sấy Sấy khô các dụng cụ bằng thủy tinh Kính hiển vi Quan sát tế bào VSV Tủ lạnh Bảo quản mẫu, vi sinh vật, môi trường Tủ ủ Ủ, nuôi cấy VSV ở nhiệt độ mong muốn 1.2 Môi trường nuôi cấy VSV: 1.2.1 Khái niệm: Môi trường nuôi cấy VSV là môi trường chứa các chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng và phát triển của VSV. 1.2.2 Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV: “đủ chất và đủ lượng” Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết. Có độ pH thích hợp. Có độ nhớt nhất định. Không chứa các yếu tố độc hại. Tuyệt đối vô trùng. 1.2.3 Phân loại: 1.2.3.1 Phân loại môi trường theo công dụng: Môi trường tăng sinh Môi trường chọn lọc Môi trường phân biệt Môi trương chọn lọc – phân biệt 1.2.3.2 Phân loại môi trường theo thành phần hóa học: Môi trường tự nhiên Gồm các hợp chất tự nhiên, chưa xác định rõ thành phần Môi trường tổng hợp Môi trường đã biết thành phần hóa học Môi trường bán tổng hợp Trong môi trường này đã có chứa một số hợp chất từ nguồn gốc tự nhiên và một số chất hóa học đã biết roc thành phần hóa học 1.2.3.3 Phân loại môi trường theo trạng thái vật lí: Trạng thái vật lý Hàm lượng Agarlit Công dụng của môi trường Môi trường lỏng 0glit Nhân giống Môi trường rắn 1520glit Phân lập, cấy truyền Môi trường bán lỏng (thạch mềm) 45glit Kiểm tra khả năng di động 1.2.4 Công thức môi trường: Các thông tin có trong công thức môi trường: Tên môi trường: Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD Agar) Mục đích: nuôi cấy Salmonella Thành phần và số lượng: + Yeast extract: 3gm + LLysine: 5gm + Lactose: 7.5gm + Sucrose: 7.5gm + Xylose: 3.5gm + Sodium chloride: 5gm + Sodium deoxycholate: 2.5gm + Sodium thiosulfate: 6.8gm + Phenol red: 0.08gm + Agar: 15gm pH: 7,4 ± 0,2 Chế độ khử trùng: 121ᵒC 15’ 0,1 Mpa 1.2.5 Các bước để nấu môi trường: B1: Cân đong hóa chất theo công thức B2: Đun nếu cần B3: Kiểm tra pH B4: Phân phối môi trường vào dụng cụ thủy tinh B4: Khử trùng 1.3 Phương pháp khử trùng: 1.3.1 Khử trùng môi trường: Phương pháp Nhiệt độthời gian Nguyên lý khả năng diệt VSV Tiệt trùng bằng nồi hấp 121ᵒC 15’ 0,1 Mpa Dùng hơi nước bão hòa ở nhiệt độ cao, áp suất 0,1 Mpa để tiêu diệt bào tử và tế bào sinh dưỡng của VSV Thanh trùng Pastuer 80100ᵒC 1530’ Đun cách thủy để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng của VSV Tiệt trùng Tyldan 80100ᵒC 15’ trong 3 ngày liên tiếp Tiêu diệt tế bào sinh dưỡng và bào tử 1.3.2 Khử trùng dụng cụ: Dụng cụ thủy tinh: + Nồi hấp tiệt trùng (phương pháp nhiệt ẩm) + Tủ sấy (phương pháp nhiệt khô): 180ᵒC 30’ hoặc 160ᵒC 2h Dụng cụ nhựa: nồi hấp tiệt trùng Khử trùng PTN: tia tử ngoại, đèn UV BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CẤY CHUYỀN VSV 2.1 Phân lập: 2.1.1 Khái niệm: Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV từ quần thể ban đầu và đưa về dạng khuẩn lạc. 2.1.2 Mục đích phân lập Để nghiên cứu các đặc điểm về hình thái, tính chất sinh lí, sinh hóa của vi sinh vật Tạo ra được dòng thuần 2.1.3 Phương pháp phân lập: VSV Que cấy Phương Pháp Men,VK Que cấy vòng 2.2 Phương pháp cấy chuyền 2.2.1 Khái niệm: Cấy chuyền là truyền vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác 2.2.2 Mục đích: Giúp bảo quản, nhân giống và sinh hóa Bảo tồn vi sinh vật thuần khiết 2.2.3 Phương pháp cấy chuyền: VSV Môi trường Que cấy Phương pháp Men, vi khuẩn Lỏng Que cấy vòng B1: Viết tên VSV B2:Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. B2: Lấy mẫu VSV. B3: Mở ống đã được chuẩn bị để cấy VSV đưa que cấy vào phần dịch lỏng rồi rút ra. Thạch nghiêng Thao tác giống môi trường lỏng chỉ khác ở chỗ que cấy chứa VSV được đưa vào cuối phần thạch nghiêng và cấy zíc zắc lên Thạch nghiêng sâu Que cấy thẳng Thao tác giống môi trường lỏng chỉ khác ở chỗ dùng que cấy thẳng đút sâu vào và kéo dần lên theo đường zíc zắc Thạch đứng Giống thạch nghiêng sâu 2.3 Kết quả thực hành: Hình ảnh kết quả phương pháp cấy chuyền Mặt trước Mặt sau Hình ảnh nấm men được phân lập trên đĩa petri trong môi trường Sab BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VSV 3.1 Quan sát đại thể: Quan sát khuẩn lạc bằng mắt để thấy được đặc điểm của khuẩn lạc như màu sắc, hình dạng, đường kính, độ vun, bóng, nhăn, có sợi… Việc quan sát đại thể các khuẩn lạc điển hình trên môi trường phân lập chọn lọc giúp dự đoán được đó là VSV nào. Sinh viên mô tả khuẩn lạc cuả VSV mình đã phân lập ở Bài 2: Khuẩn lạc của S.C(nấm men) trên môi trường PDA Hình dạng: tròn Đường kính: 1mm Bờ, mép khuẩn lạc: nhẵn, tròn Màu sắc: trắng đục 3.2 Quan sát vi thể Làm tiêu bản và quan sát tiêu bản đó dưới kính hiển vi để thấy được: Quan sát đặc điểm sinh học của nấm mốc: + Đặc điểm của sợi nấm: màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn + Đặc điểm của cơ quan sinh sản: hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của cơ quan sinh sản. + Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử. Quan sát đặc điểm sinh học của nấm men: + Hình thái, kích thước tế bào nấm men. + Sự nảy chồi của nấm men. + Hình dạng, số lượng bào tử trong 1 túi bào tử. Quan sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn: + Hình thái, cấu tạo của vi khuẩn. + Xác định vi khuẩn thuộc nhóm Gram+ hoặc Gram. 3.2.1 Làm tiêu bản nấm mốc (phương pháp giọt ép) 3.2.2 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm đơn: B1: Ghi tên VSV. Làm vết bôi. B2: Cố định vết bôi: hơ trên ngọn lửa đền cồn đến khi vết bôi khô. B3: Nhuộm màu (sử dụng 1 trong các loại thuốc nhuộm sau: Gentiant Violet, Fuschin, Xanh metylen, Xanh coton…). Nhỏ thuốc vào vết bôi đã cố định, để 1 phút, rửa nước. B4: Quan sát tiêu bản dưới KHV. Khi thực hiện thao tác, sử dụng thuốc nhuộm màu gì thì tế bào sẽ bắt màu đó. Phương pháp nhuộm đơn thường áp dụng cho nấm men. Khi sử dụng phương pháp này để nhuộm màu vi khuẩn thì lúc quan sát KHV sẽ chỉ thấy được: Hình dạng, kích thước, màu sắc và cách sắp xếp của tế bào VSV. 3.2.3 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm kép: B1: Ghi tên VSV. Làm vết bôi B2: Cố định vết bôi: Hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi vết bôi khô. Mục đích: + Giết chết VSV + Gắn chặt VSV trên lame + Giúp VSV dễ bắt màu thuốc nhuộm + Giúp VSV không bị trôi khi rửa nước B3: Nhuộm màu: Nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet. Để 1 phút. Rửa nước. Nhỏ Lugol. Để 1 phút. Rửa nước. Tẩy cồn. Rửa nước. Nhỏ thuốc nhuộm Safranin. Để 30 giây. Rửa nước. B4: Quan sát KHV vật kính 100. Vẽ hình quan sát được: Bài tập ở nhà: 1. So sánh phương pháp nhuộm đơn và nhuộm kép. SV trả lời theo gợi ý trong bảng 1. Bảng 1. So sánh pp nhuộm đơn, nhuộm kép Nhuộm đơn Nhuộm kép Giống Cố định vết bôi rồi nhuộm và để quan sát dưới kính hiển vi Khác nhau Quy trình sản xuất Nhuộm màu 1 lần ( sử dụng 1 trong các loại thuốc nhuộm: Fuschin, xanh metylen, xanh coton, Gentiant violet) Nhuộm màu 2 lần, đầu tiên nhỏ thuốc nhuộm Gentiant violet (Crystal violet), sau đó nhỏ Lugol, nhuộm thêm 1 lần nữa bằng thuốc nhuộm Fuschin ( hoặc Safranin). Mục đích Giúp phân biệt 2 nhóm VK (gram – và gram +) Giúp quan sát và phân biệt cấu trúc tế bào dễ dàng hơn so với việc nhuộm đơn. 2. Tại sao phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát kính hiển vi ở vật kính 100? Phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát KHV ở vật kính 100 vì: Dầu soi là một trong những phụ kiện KHV không thể thiếu khi sử dụng với chức năng dùng để quan sát các vật mẫu có kích thước siêu hiển vi mà độ phóng đại của kính không thể làm rõ vật mẫu. Đặc điểm của Dầu soi KHV là dầu trong suốt, có chỉ số khúc xạ cao. Ở vật kính 100, vật kính cần phải sử dụng kết hợp với dầu soi kính hiển vi, loại vật kính này được gọi là vật kính ngâm dầu. Dầu soi hỗ trợ làm tăng độ phân giải hình ảnh, cho chất lượng hình ảnh khi quan sát rõ nét hơn. Sử dụng dầu soi vào trực tiếp mẫu vật cần quan sát sau đó dùng vật kính ngâm dầu để quan sát có độ phóng đại và chất lượng hình ảnh tốt nhất. 3. Giải thích cơ chế bắt màu tím của VK gram (+) và bắt màu hồng của VK gram() Vi khuẩn Gram + có lớp Peptidoglycan dày, nhiều Acid teichoic, chúng không bị ảnh hưởng bới sự tẩy màu bằng cồn, vẫn giữ nguyên được màu tím ban đầu. Vi khuẩn Gram có lớp Peptidoglycan mỏng gắn với màng Phospholipid kép, xen kẽ với protein ở màng ngoài, lớp màng này dễ bị phá hủy khi tẩy màu, do đó phức hợp tinh thể GentiantIod không bền, bị tẩy màu và màu bị thay bởi thuốc nhuộm bổ sung.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HCM KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC & THỰC PHẨM BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG GVHD: Th.S Nguyễn Minh Hiền SVTH: Nguyễn Thị Nga MSSV: 19125195 Lớp: DH19DD Nhóm: 12 NỘI DUNG THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG GIỚI THIỆU CHUNG Giáo trình phục vụ mơn học: SV sử dụng giáo trình thực hành Vi sinh đại cương Nội dung học: - Các thiết bị phịng thí nghiệm Vi sinh, chuẩn bị mơi trường dinh dưỡng, phương pháp khử trùng - Phân lập, cấy chuyền VSV - Làm tiêu bản, quan sát tế bào VSV - Đếm tế bào men Buồng đếm hồng cầu - Khảo sát số phản ứng sinh hóa vi khuẩn Yêu cầu GV với SV: - Yêu cầu kiến thức: chuẩn bị trước đến phịng thí nghiệm GV kiểm tra bài, SV nhóm khơng chuẩn bị bài, nhóm bị nghỉ buổi học khơng dạy học lại - Sau kết thúc mơn học, SV có 5-10 ngày để viết báo cáo Nộp cho bạn (có định) nhóm Bài báo cáo có ghi rõ họ, tên, nhóm, tổ Bài báo cáo SV đánh máy viết tay - Yêu cầu kĩ năng: quan sát GV thực thao tác làm yêu cầu thực thao tác nuôi cấy VSV, làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi (KHV) - Yêu cầu thái độ: nghiêm túc, nhanh nhẹn, thực quy định PTN yêu cầu GV Tham gia tích cực trả lời câu hỏi GV đặt câu hỏi buổi học BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 1.1 Các thiết bị phịng thí nghiệm: Thiết bị Mục đích Cân Cân hóa chất, cân mơi trường Bếp khuấy từ Khuấy trộn, hịa tan, gia nhiệt loại mơi trường Máy đồng mẫu Phân tán vi sinh vật vào mẫu đồng Nồi hấp tiệt trùng Tiệt trùng môi trường, dụng cụ nước bão hòa nhiệt độ cao, áp suất cao Tủ sấy Sấy khô dụng cụ thủy tinh Kính hiển vi Quan sát tế bào VSV Tủ lạnh Bảo quản mẫu, vi sinh vật, môi trường Tủ ủ Ủ, nuôi cấy VSV nhiệt độ mong muốn 1.2 Môi trường nuôi cấy VSV: 1.2.1 Khái niệm: Môi trường nuôi cấy VSV môi trường chứa chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng phát triển VSV 1.2.2 Yêu cầu môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV: “đủ chất đủ lượng” Có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết Có độ pH thích hợp Có độ nhớt định Không chứa yếu tố độc hại Tuyệt đối vô trùng 1.2.3 Phân loại: 1.2.3.1 Phân loại môi trường theo công dụng: - Môi trường tăng sinh - Môi trường chọn lọc - Môi trường phân biệt - Môi trương chọn lọc – phân biệt 1.2.3.2 Phân loại mơi trường theo thành phần hóa học: Mơi trường tự nhiên Gồm hợp chất tự nhiên, chưa xác định rõ thành phần Môi trường tổng hợp Môi trường biết thành phần hóa học Mơi trường bán tổng Trong mơi trường có chứa số hợp chất từ hợp nguồn gốc tự nhiên số chất hóa học biết roc thành phần hóa học 1.2.3.3 Phân loại môi trường theo trạng thái vật lí: Trạng thái vật lý Hàm lượng Agar/lit Cơng dụng môi trường Môi trường lỏng 0g/lit Nhân giống Môi trường rắn 15-20g/lit Phân lập, cấy truyền Môi trường bán lỏng 4-5g/lit Kiểm tra khả di động (thạch mềm) 1.2.4 Cơng thức mơi trường: Các thơng tin có công thức môi trường: Tên môi trường: Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD Agar) Mục đích: ni cấy Salmonella Thành phần số lượng: + Yeast extract: 3gm + L-Lysine: 5gm + Lactose: 7.5gm + Sucrose: 7.5gm + Xylose: .3.5gm + Sodium chloride: .5gm + Sodium deoxycholate: 2.5gm + Sodium thiosulfate: 6.8gm + Phenol red: 0.08gm + Agar: 15gm pH: 7,4 ± 0,2 Chế độ khử trùng: 121ᵒC / 15’ / 0,1 Mpa 1.2.5 Các bước để nấu môi trường: B1: Cân đong hóa chất theo cơng thức B2: Đun cần B3: Kiểm tra pH B4: Phân phối môi trường vào dụng cụ thủy tinh B4: Khử trùng 1.3 Phương pháp khử trùng: 1.3.1 Khử trùng môi trường: Phương pháp Tiệt trùng Nhiệt độ/thời gian 121ᵒC / 15’ / 0,1 Mpa nồi hấp Nguyên lý khả diệt VSV Dùng nước bão hòa nhiệt độ cao, áp suất 0,1 Mpa để tiêu diệt bào tử tế bào sinh dưỡng VSV Thanh trùng 80-100ᵒC / 15-30’ Pastuer Đun cách thủy để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng VSV Tiệt trùng 80-100ᵒC / 15’ Tyldan ngày liên tiếp Tiêu diệt tế bào sinh dưỡng bào tử 1.3.2 Khử trùng dụng cụ: Dụng cụ thủy tinh: + Nồi hấp tiệt trùng (phương pháp nhiệt ẩm) + Tủ sấy (phương pháp nhiệt khô): 180ᵒC / 30’ 160ᵒC / 2h Dụng cụ nhựa: nồi hấp tiệt trùng Khử trùng PTN: tia tử ngoại, đèn UV BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CẤY CHUYỀN VSV 2.1 Phân lập: 2.1.1 Khái niệm: Phân lập VSV q trình tách riêng lồi VSV từ quần thể ban đầu đưa dạng khuẩn lạc 2.1.2 Mục đích phân lập - Để nghiên cứu đặc điểm hình thái, tính chất sinh lí, sinh hóa vi sinh vật - Tạo dịng 2.1.3 Phương pháp phân lập: VSV Men, VK Que cấy Phương Pháp Que cấy vòng 2.2 Phương pháp cấy chuyền 2.2.1 Khái niệm: Cấy chuyền truyền vi sinh vật từ môi trường sang môi trường khác 2.2.2 Mục đích: - Giúp bảo quản, nhân giống sinh hóa - Bảo tồn vi sinh vật khiết 2.2.3 Phương pháp cấy chuyền: VSV Môi trường Que cấy Phương pháp B1: Viết tên VSV B2:Khử trùng que cấy lửa đèn cồn Lỏng B2: Lấy mẫu VSV Que cấy B3: Mở ống chuẩn bị để cấy vòng VSV đưa que cấy vào phần dịch lỏng rút Men, Thao tác giống môi trường lỏng vi khuẩn khác chỗ que cấy chứa VSV đưa Thạch nghiêng vào cuối phần thạch nghiêng cấy zíc zắc lên Thao tác giống mơi trường lỏng Thạch nghiêng sâu Que cấy khác chỗ dùng que cấy thẳng đút sâu thẳng Thạch đứng 2.3 Kết thực hành: vào kéo dần lên theo đường zíc zắc Giống thạch nghiêng sâu Hinh anh kêt qua phương phap chuyền Mặt trước Mặt sau Hình ảnh nấm men được phân lập đĩa petri môi trường Sab BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VSV 3.1 Quan sát đại thể: Quan sát khuẩn lạc mắt để thấy đặc điểm khuẩn lạc màu sắc, hình dạng, đường kính, độ vun, bóng, nhăn, có sợi… Việc quan sát đại thể khuẩn lạc điển hình mơi trường phân lập chọn lọc giúp dự đốn VSV Sinh viên mơ tả khuẩn lạc cuả VSV phân lập Bài 2: Khuẩn lạc S.C(nấm men) mơi trường PDA Hình dạng: trịn Bờ, mép khuẩn lạc: nhẵn, trịn Đường kính: 1mm Màu sắc: trắng đục 3.2 Quan sát vi thể Làm tiêu quan sát tiêu kính hiển vi để thấy được: Quan sát đặc điểm sinh học nấm mốc: + Đặc điểm sợi nấm: màu sắc, có vách ngăn hay khơng có vách ngăn + Đặc điểm quan sinh sản: hình dạng, cách xếp phận quan sinh sản + Hình dạng, cấu tạo, cách xếp bào tử Quan sát đặc điểm sinh học nấm men: + Hình thái, kích thước tế bào nấm men + Sự nảy chồi nấm men + Hình dạng, số lượng bào tử túi bào tử Quan sát đặc điểm sinh học vi khuẩn: + Hình thái, cấu tạo vi khuẩn + Xác định vi khuẩn thuộc nhóm Gram+ Gram- 3.2.1 Làm tiêu nấm mốc (phương pháp giọt ép) 3.2.2 Làm tiêu phương pháp nhuộm đơn: B1: Ghi tên VSV Làm vết bôi B2: Cố định vết bôi: hơ lửa đền cồn đến vết bôi khô B3: Nhuộm màu (sử dụng loại thuốc nhuộm sau: Gentiant Violet, Fuschin, Xanh metylen, Xanh coton…) Nhỏ thuốc vào vết bôi cố định, để phút, rửa nước B4: Quan sát tiêu KHV Khi thực thao tác, sử dụng thuốc nhuộm màu tế bào bắt màu Phương pháp nhuộm đơn thường áp dụng cho nấm men Khi sử dụng phương pháp để nhuộm màu vi khuẩn lúc quan sát KHV thấy được: Hình dạng, kích thước, màu sắc cách xếp tế bào VSV 3.2.3 Làm tiêu phương pháp nhuộm kép: B1: Ghi tên VSV Làm vết bôi B2: Cố định vết bôi: Hơ lửa đèn cồn đến vết bôi khơ Mục đích: + Giết chết VSV + Gắn chặt VSV lame + Giúp VSV dễ bắt màu thuốc nhuộm + Giúp VSV không bị trôi rửa nước B3: Nhuộm màu: Nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet Để phút Rửa nước Nhỏ Lugol Để phút Rửa nước Tẩy cồn Rửa nước Nhỏ thuốc nhuộm Safranin Để 30 giây Rửa nước B4: Quan sát KHV vật kính 100 Vẽ hình quan sát được: Bài tập nhà: So sánh phương pháp nhuộm đơn nhuộm kép SV trả lời theo gợi ý bảng Bảng So sánh pp nhuộm đơn, nhuộm kép Nhuộm đơn Giống Khác Quy trình sản xuất Mục đích Nhuộm kép Cố định vết bơi nhuộm để quan sát kính hiển vi Nhuộm màu lần ( sử Nhuộm màu lần, đầu dụng loại tiên nhỏ thuốc nhuộm thuốc nhuộm: Fuschin, Gentiant violet (Crystal xanh metylen, xanh violet), sau nhỏ coton, Gentiant violet) Lugol, nhuộm thêm lần nữa thuốc nhuộm Fuschin ( Safranin) Giúp phân biệt nhóm Giúp quan sát phân VK (gram – gram +) biệt cấu trúc tế bào dễ dàng so với việc nhuộm đơn Tại phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu quan sát kính hiển vi vật kính 100? Phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu quan sát KHV vật kính 100 vì: Dầu soi những phụ kiện KHV thiếu sử dụng với chức dùng để quan sát vật mẫu có kích thước siêu hiển vi mà độ phóng đại kính khơng thể làm rõ vật mẫu Đặc điểm Dầu soi KHV dầu suốt, có số khúc xạ cao Ở vật kính 100, vật kính cần phải sử dụng kết hợp với dầu soi kính hiển vi, loại vật kính gọi vật kính ngâm dầu Dầu soi hỗ trợ làm tăng độ phân giải hình ảnh, cho chất lượng hình ảnh quan sát rõ nét Sử dụng dầu soi vào trực tiếp mẫu vật cần quan sát sau dùng vật kính ngâm dầu để quan sát có độ phóng đại chất lượng hình ảnh tốt 3 Giải thích chế bắt màu tím VK gram (+) bắt màu hồng VK gram(-) - Vi khuẩn Gram + có lớp Peptidoglycan dày, nhiều Acid teichoic, chúng không bị ảnh hưởng bới tẩy màu cồn, giữ nguyên màu tím ban đầu - Vi khuẩn Gram- có lớp Peptidoglycan mỏng gắn với màng Phospholipid kép, xen kẽ với protein màng ngoài, lớp màng dễ bị phá hủy tẩy màu, phức hợp tinh thể Gentiant-Iod không bền, bị tẩy màu màu bị thay thuốc nhuộm bổ sung BÀI 4: ĐẾM TRỰC TIẾP NẤM MEN BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU 4.1 Giới thiệu buồng đếm hồng cầu (BĐHC): BĐHC phiến kính thủy tinh hình chữ nhật, có khắc lưới đếm Lưới đếm hình vng, có cạnh 1mm, gồm 25 vng lớn, vng lớn có 16 vng nhỏ; vng lớn chia cắt đường kẻ song song, chiều cao đường khắc lưới đếm 0,1mm S lưới đếm = 1mm2 S ô vuông nhỏ = mm2 V ô vuông nhỏ = mm2 S ô vuông lớn = mm2 Hình 1: Buồng đếm hồng cầu Hình 2: Lưới đếm Hình 3: Lưới đếm quan sát vật kính 10 KHV Từ vật kính 10, SV chuyển qua vật kính 40 để thấy hình ảnh ô vuông lớn SV quan sát tìm vng lớn ngồi góc Hinh 4: vng lớn góc lưới đếm vật kính 40 4.2 Quy trình đếm nấm men Bước Pha lỗng dịch mẫu Hình 5: Quy trình pha loãng mẫu Bước Đưa dịch mẫu vào lưới đếm Bước Đếm tế bào nấm men Quan sát lưới đếm vật kính 10, chuyển qua vật kính 40 để đếm tế bào ô vuông lớn theo vị trí đường chéo góc Ghi lại kết Cách đếm: Đếm tất tế bào ô vuông lớn tế bào nằm cạnh liên tiếp (hình 6) Hình 6: Cách đếm tế bào ô vuông lớn 4.3Tính kết quả: A: Tổng số tế bào đếm vng V: thể tích ô vuông nhỏ lớn 1000: hệ số chuyển mm3 thành mL 10-n: nồng độ pha loãng đếm Theo kết quan sát: A= 272 Số TB/ml = x 1000 = x 1000 = x 4000 x 102 x 1000 = =1360000000 (TB/ml) Kết nhóm Số tế bào lớn Ơ 1: 36 Ơ2 : 42 Ô 3: 59 Ô 4: 71 Ô 5: 64 4.4 Ưu nhược điểm phương pháp đếm trực tiếp tế bào nấm men Buồng đếm hồng cầu: Ưu điểm: cho kết nhanh chóng, thường dùng để đếm những vi sinh vật có kích thước lớn nấm men, bào tử nấm mốc Nhược điểm: + Không phân biệt số tế bào sống tế bào chết + Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với vật thể khác mẫu + Sai số cao 4.5Ứng dụng đếm trực tiếp nấm men Buồng dếm hồng cầu: Dùng để đếm tế bào hồng cầu máu, nấm men vẽ đường cong sinh trưởng BÀI 5: KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HĨA CỦA VSV 5.1 Mục đích - Góp phần định danh VK (Gram -) - Khảo sát tính chất sinh lý vi khuẩn 5.2 Yêu cầu thực phản ứng sinh hóa Yêu cầu VSV: - VSV phải pha phát triển, non - VSV phải khiết Yêu cầu thời gian đọc kết quả: sau 24 – 48 nuôi cấy 5.3 Phản Một số phản ứng bản: Mục đích Mơi trường ứng Cách thực Nguyên lí Simon Xác định Citrate khả VSV sử Tên môi trường: Simon Cấy VSV Citrate Agar pH: 6,9 ± 0,2 dụng Simon Citrate Chất thị màu: Bromothymol Blue nguồn Thành phần: Carbon + Amonium VSV sử dụng Dương vào mơi Citrate sinh tính: màu trường SCA CO2 làm kiềm xanh da Ủ 24-48h, hóa mơi trường trời nhiệt độ VSV sử dụng Âm tính: 37ᵒC nguồn đạm màu xanh Đọc kết Amonium để tạo NH3 làm màu vàng Dihydrogen kiềm hóa mơi Phosphate: 1g trường + Dipotassium Hydrogen Phosphate: 1g + NaCl: 5g Đọc kết NH4+ → NH3+ nhạt + Sodium Citrate: 2g + MgSO4 : 0,2g + Bromothymol Blue: 0,08g + Agar: 13g Kligler Phát Iron khả Agar sử dụng (K.I.A) nguồn Carbonhy drate (glucose, …), sinh H2S, tạo H2, CO2 Tên môi trường: Kligler Iron Agar pH: 7,4 ± 0,2 Chất thị màu: Phenol Red Thành phần: Cấy VSV VSV sử dụng Màu đen: vào môi Glucose trước có khí trường KIA tạo Acid H2S Ủ 24-48h, (pH7), môi Đỏ / trường có màu vàng: lên đỏ phần men trên, H2S tác glucose dụng với Fe tạo kết tủa đen bề mặt Nếu sử dụng Lactose Lactose lên men tạo Acid (pH