VIỆN CÔNG NGHỆ SINH học và THỰC PHẨM báo cáo THỰC HÀNH VI SINH THỰC PHẨM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM GVHD: BÙI HỒNG QUÂN LỚP: ĐHTP5 – NHÓM SVTH: Lê Thị Mỹ Vân MSSV: 09078531 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011 BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH THỰC PHẨM MỤC LỤC Bài 1: Thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm phương pháp tiệt trùng vi sinh vật Bài 2: Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật Bài 3: Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 10 Bài 4: phương pháp quan sát vi sinh vật kính hiển vi quang học 16 Bài 5: Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật 19 Bài 6: Phương pháp phân lập vi sinh vật 20 Bài 10: Khảo sát đặc tính sinh hóa vi sinh vật 23 Bài 13: Định lượng vi sinh vật phương pháp đếm trực tiếp 35 Bài 14: Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí phương pháp đếm khuẩn lạc 37 Bài 15: Định lượng Coliform phương pháp MPN 39 Bài 19: Phương pháp định lượng E.coli thực phẩm 41 Bài 20: Phương pháp phân tích Salmonella spp thực phẩm 43 Bài 21: Phương pháp phân tích định lượng Bacillus cereus thực phẩm 46 Bài 22: Phương pháp phân tích định lượng Staphilococcus aureus thực phẩm 48 Bài 24: Phương pháp phân tích Clostridium perfringens thực phẩm 50 BÀI 1: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT Báo cáo thực tập Trình bày yêu cầu việc bao gói dụng cụ ni vi sinh vật? Yêu cầu việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật: - Phần giấy bao bên ngồi phải chặt kín - Bao giấy dầu với dụng cụ hấp ướt - Bao giấy báo với dụng cụ sấy khô khử trùng ướt - Với dụng cụ pipet, que trang phải dùng giấy bao kín tồn Có thể dùng hộp nhơm để đựng dụng cụ để khử trùng Công dụng cách sử dụng dụng cụ, thiết bị phịng thí nghiệm vi sinh vật? Cơng dụng cách sử dụng dụng cụ, thiết bị phịng thí nghiệm vi sinh vật: a Nồi hấp ướt (autoclave): Thiết bị cấp nhiệt nước áp suất cao, sử dụng để hấp khử trùng mô trường, số nguyên liệu dụng cụ thí nghiệm b Kính hiển vi: Cơng dụng: dùng để nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật đặc điểm hình thái, sinh lý nhờ vào khả phóng đại kính c Các dụng cụ thí nghiệm Dụng cụ thủy tinh có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bình định mức… - Phiến kính (lame): dùng làm tiêu quan sát hình thái, sinh lý tế bào vi sinh vật - Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bôi tiêu cố định vi sinh vật qua trình nghiên cứu - Đĩa petri: dùng để nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm ni cấy phân lập tế bào vi sinh vật - Que trãi: phân lập vi sinh vật theo phương pháp trãi đĩa - Que cấy: + Que cấy đầu tròn: dùng để thao tác vi sinh đối tượng đơn bào vi khuẩn, nấm men + Que cấy nhón: dùng để cấy sâu mơi trường rắn + Que cấy móc: dùng để lấy khuẩn ty hay đoạn tơ nấm - Micro pipette: sử dụng cần hút lượng xác mơi trường 4.Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ môi trường nuôi cấy vi sinh vật? Phương pháp tiệt trùng dụng cụ môi trường nuôi cấy vi sinh vật: a Phương pháp lý học: Nhiệt khô: - Đối với dụng cụ cấy kim loại, thủy tinh, phương pháp thường dùng đốt trục tiếp lửa đèn cồn - Đối với dụng cụ thủy tinh gói sấy 160 C 1-2 180 C 30 phút Nhiệt ẩm: - Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt thấm nhanh vào mẫu vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật Chỉ diệt tế bào sinh dưỡng, bào tử - Phương pháp Pasteur: diệt vi khuẩn gây bệnh, không diệt bào tử vi khuẩn hoại sinh Phương pháp thường dùng nhiệt độ 70-75 C thời gian 10-15 phút - Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần nhiệt độ 70-80 C, lần 30-60 phút liên tiếp ba ngày liền - Phương pháp nước bão hòa áp suất cao: dùng autoclave Thường dùng nhiệt độ 121 C 15-30 phút Diệt trùng xạ: - Tia tử ngoại hay UV: sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật - Tia âm cực dùng tiệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm Vật khử trùng phải bao gói kính Diệt trung cách lọc: - Dụng cụ lọc thường màng xốp sứ, aminate, cellulose,… có kích thước lỗ lọc từ 0,2-0,45μm, thường dùng để lọc vật phẩm lỏng không khử trùng nhiệt - Đối với khử trùng khơng khí thiết bị khử trùng máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn b Phương pháp hóa học - Chỉ sát khuẩn ngồi da: xà phịng, cồn, iode, phẩm màu - Chất diệt khuẩn tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor… BÀI 2: CÁCH PHA CHẾ CÁC LOẠI MƠI TRƯỜNG I TRẢ LỜI CÂU HỎI Trình bày khái niệm môi trường phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật • Khái niệm mơi trường dinh dưỡng Môi trường dinh dưỡng hỗn hợp chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu tế bào ổn định pH môi trường chất dinh dưỡng hợp chất tham gia vào trình trao đổi chất nội bào • Phân loại mơi trường dinh dưỡng o Theo nguồn gốc Mơi trường tự nhiên: có thành phần sản phẩm tự nhiên như: trứng, sữa, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám Môi trường tổng hợp: chứa chất hóa học mà thành phần chúng xác định định lượng cách cụ thể xác Ví dụ như: Czapeck, Hansen, EMB Mơi trường bán tổng hợp: chứa chất hóa học lẫn sản phẩm tự nhiên, ví dụ như: PGA, giá đậu đường o Theo trạng thái vật lý Môi trường lỏng: thành phần môi trường không chứa agar thường sử dụng để nghiên cứu trình tổng hợp vi sinh vật Môi trường đặc: 1000ml mơi trường có 15 – 20 Agar Mơi trường bán lỏng: chứa khoảng 0,3 – 0,7% agar o Theo công dụng Môi trường phân lập Môi trường tăng sinh Môi trường nuôi giữ giống: nghèo dinh dưỡng Môi trường thử nghiệm sinh hóa Trình bày qui trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật Bao gồm bước sau: • Chuẩn bị dụng cụ • Cân hóa chất • Phối chế tạo mơi trường ni cấy • Điều chỉnh độ pH mơi trường • Phân phối mơi trường vào dụng cụ • Khử trùng mơi trường • Làm thạch nghiên, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri • Kiển tra độ vơ trùng bảo quản Yêu cầu môi trường đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng thạch đứng • Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành sau khử trùng môi trường môi trường chưa đông đặc - Đặt ống nghiệm có mơi trường lên giá đặt nghiêng không để môi trường chạm vào nút - Để yên môi trường đông đặc Yêu cầu mặt thạch phải thẳng, nhẵn liên tục • Làm thạch đứng: - Đặt ống nghiệm có mơi trường thạch đứng vào giá, để yên cho môi trường đơng đặc • Đổ mơi trường vào đĩa petri: - Tồn q trình đổ thạch vào đĩa petri thực tủ cấy vô trùng gồm thao tác sau: o Mở bao giấy gói đĩa petri o Một tay cầm dụng cụ chứa môi trường o Tay cịn lại mở nút bơng hơ miệng bình lửa đền cồn o Mở nắp đĩa petri Nghiêng bình rót mơi trường vào đĩa petri o Đậy nắp đĩa lại, xoay tròn đĩa để môi trường phân phối bên đĩa o Để yên cho môi trường đông đặc o Lật ngược đĩa lại bảo quản Giải thích không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khử trùng Vì làm nhiễm vi sinh vật khơng mong muốn, nhiễm số tạp chất sau q trình ni cấy khó xác định kết Có thể tránh nước tiếp xúc vào môi trường nuôi cấy sau cấy phải để n mơi trường để cứng môi trường Đĩa petri chứa môi trường trước cấy vi sinh vật nên úp hay ngửa? Tại sao? Nên để ngửa làm kín khu vực nuôi cấy, tránh lây nhiễm vi sinh vật khác tránh tiếp xúc với nước Ý nghĩa việc pha chế môi trường? Chúng ta phải pha chế mơi trường cho vi sinh vật môi trường dinh dưỡng hỗn hợp gồm chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxy hóa- khử, áp suất thẩm thấu tế bào ổn định độ pH môi trường để vi sinh vật sinh trưởng phát triển cách tối ưu Làm mơi trường để thực việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy nghiên cứu đặc điểm sinh học chúng Yêu cầu môi trường dinh dưỡng nuôi cấy? u cầu mơi trường dinh dưỡng: có đủ chất dinh dưỡng cần thiết, có độ pH phù hợp có độ nhớt định, không chứa yếu tố độc hại, hồn tồn vơ trùng, đảm bảo phát triển ổn định vi sinh vật Nêu ý nghĩa thành phần môi trường nuôi cấy? Peptone chiết xuất cao thịt bò dùng làm nguồn cacbon, lượng nitơ Cao thịt bò chứa axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin số chất khoáng Cao nấm men nguồn phong phú vitamin nhóm B nguồn nitơ cacbon Có loại peptone? Có loại peptone o Từ động vật: chiết xuất từ thịt, cao thịt bò, dịch thuỷ phân phần thịt bò, cazêin,… dùng làm nguồn cacbon, lượng nitơ Cao thịt bò chứa axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin số chất khoáng o Từ thực vật: chiết xuất từ đậu nành,… o Nấm men: cao nấm men, Cao nấm men nguồn phong phú vitamin nhóm B nguồn nitơ cacbon) 10 Cơ chế làm nước lòng trắng trứng Cách làm nước lòng trắng trứng: lòng trắng trứng: nước tỉ lệ 1:1→ đánh tan bọt → cho vào lít mơi trường → đun sơi khoảng phút → để nguội → lắng cặn →lọc Cơ chế: protein lòng trắng trứng albumin, ovalbumin tác động khuấy trộn gia nhiệt bị biến tính không thuận nghịch, liên kết protein kéo dãn làm lộ nhiều nhóm chức → hình thành lực hút tĩnh điện với ion, bụi bẩn có nước → sau lắng, lọc nước BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT PHÂN LẬP SINH VẬT I Nguyên tắc Mục đích việc ni cấy - Phát có mặt vi sinh vật nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu - Tiến hành việc phân giống vi sinh vật cách nhanh chóng - Bảo tồn giống vi sinh vật khiết - Nghiên cứu đặc tính sinh học phát triển loại vi sinh vật Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật Mọi thao tác nuôi cấy phải thực điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngồi Mơi trường dụng cụ ni cấy phải khử trùng triệt để Duy trì tốt điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển thuận lợi II Dụng cụ, mơi trường hóa chất III Tiến hành thí nghiệm Phương pháp cấy truyền thạch (mơi trường thạch) 1.1 Cấy truyền thạch đĩa Có thể cấy đĩa pêtri theo cách sau: * Dùng que cấy đầu tròn thực theo trình tự sau: - Để đĩa pêtri lên bàn - Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự yêu cầu phương pháp chung - Tay trái mở nắp đĩa pêtri vừa đủ que cấy vào - Nhẹ nhàng nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo kiểu sau: + Theo hình chữ chi tồn mặt thạch (hình 3.3a) + Theo đường song song (hình 3.3b) + Theo hình chữ chi góc (hình 3.3c) Hình 3.1 Các kiểu cấy thạch đĩa 10 Hình 3.2: Cách dàn vi sinh vật lên bề mặt môi trường A – que gạt B – dàn que gạt; C: Sự sinh trưởng VSV sau dàn que gạt; D : Sự sinh trưởng VSV sau dàn que cấy 1.2 Phương pháp cấy thạch nghiêng - Phương pháp dùng để cấy truyền vi sinh vật hiếu khí - Sử dụng que cấy đầu trịn tiến hành thao tác theo trình tự nói - Thực việc cấy giống vào ống thạch nghiêng thao tác tiếp theo: + Hoà giống đầu que cấy vào giọt nước đáy ống nghiệm + Nhẹ nhàng lướt que cấy mặt thạch theo kiểu (hình 3.1) - Hình chữ chi - Hình vịng xoắn - Hình vạch ngang song song d Hình 3.2: Một số kiểu cấy ống thạch nghiêng 1.3 Phương pháp cấy thạch đứng: cấy sinh vật kị khí • Sử dụng que cấy hình kim • Sau lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ • Đâm sát đáy ống nghiệm đâm thành đường: đường giữa, đường sát thành ống tuỳ yêu cầu • Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường IV Trả lời câu hỏi Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật 11 - Cấy truyên vi sinh vật môi trường lỏng: cấy truyền pipette Pasteur, cấy truyền que cấy vòng - Cấy truyền môi trường lỏng: cấy truyền ống truyền thạch nghiêng, ống nghiệm thạch đứng, cấy truyền thạch đĩa Các phương pháp giữ ống vi sinh vật a Phương pháp cấy truyền định kỳ môi trường Ưu điểm: phương pháp đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản không lâu Nhược điểm: tốn môi trường, công sức thời gian Dễ bị tạp nhiễm dễ dẫn đến chủng giống gốc Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu chủng trình bảo quản Phải nghiên cứu theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp cho chủng bảo quản Giống gốc bị sai sót dùng mơi trường cấy truyền khơng thích hợp Chủng vi sinh vật đễ bị thay đổi đặc tính sinh học đột biến xuất sau cấy truyền b Phương pháp giữ giống môi trường thạch có lớp dầu khống Ưu điểm: đơn giản hiệu cao nhờ khả làm chậm trình biến dưỡng hơ hấp nên vi sinh vật phát triển chậm lại Môi trường không bị nước khô c Phương pháp giữ giống đất, cát, hạt… Ưu điểm: dễ bảo quản chủng bào tử tiềm sinh, thời gian bảo quản kéo dài đến năm Nhược điểm: khử trùng môi trường trước d Phương pháp lạnh đông Ưu điểm: nhanh, thuận lợi cho việc bảo quản số lượng lớn mẫu vi sinh vật bảo quản từ 10-20 năm, tiết kiệm cơng sứcvà sai sót nhãn mác, tạp nhiễm Nhược điểm: giá thành thiết bị, độ ổn định chủng vi sinh vật bảo quản theo đợt bảo quản khác Trước đem sử dụng phải hoạt hố mơi trường thích hợp số lần để đảm bảo phục hồi đặc tính sinh học chủng vi sinh vật e Phương pháp bảo quản lạnh sâu 12 Ưu điểm: thích hợp cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nấm men, vi khuẩn, nấm mốc, vỉut, tảo dòng tế bào động vật thời gian bảo quản lâu Nhược điểm: đầu tư kinh phí cho thiết bị, điện cao, rủi ro cháy nổ, khơng thích hợp cho chủng vi sinh vật hay dùng đến thường xuyên 3 Trình bày ngun tắc mục đích q trình phân lập - Nguyên tắc: tách rời tế bào vi sinh vật, nuôi cấy tế bào môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ - Mục đích: phân tách chủng vi sinh vật mơi trường tự nhiên cô lập chúng nhằm chọn lựa giống vi sinh vật khiết cho mục đích khác Muốn phân lập nấm men, nấm mốc, vi khuẩn nguồn mẫu cần chọn gì? Trả lời: - Phân lập vi khuẩn: nguồn mẫu cỏ khô cắt nhỏ - Nấm mốc: nguồn mẫu cơm nguội, xơi làm mốc tương, bánh mì để khơ - Nấm men: nguồn mẫu bề mặt trái cây, dịch ép táo, lê rượu nếp, bia, nước mía So sánh giống khác cách phân lập vi sinh vật hiếu khí kị khí Trả lời: - Giống nhau: nhằm phân tách chủng vi sinh vật môi trường tự nhiên cô lập chúng nhằm chọn lựa giống vi sinh vật khiết.Khác nhau: Phân lập vi sinh vật hiếu khí Phân lập vi sinh vật kị khí - Hút dịch mẫu pha lỗng cho vao dĩa petri có mơi trường thích hợp - Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải khắp mặt thạch - Tiếp tục dùng que gạt mẫu cho khắp mặt thạch đĩa thứ đĩa thứ - Ủ ấm nhiệt độ thích hợp sau thời gian định ta nhận khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa thứ 2, - Dùng môi trường đặc ống nghiệm đem chưng cách thủy để loại bỏ khơng khí - Để nguội mơi trường cịn 45-50 o C - Hút dịch nghiên cứu cho vào ống mơi trường, đậy nút lại, lắc trịn quanh trục ống nghiệm - Rút nhanh, đậy nhanh tránh cho ống nghiệm có khơng khí - Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc đĩa petri ủ nhiệt độ thích hợp - Sau vi sinh vật phát triển, chọn khuẩn lạc riêng rẽ môi trường, dùng que cấy cắt khối môi trường cấy vào mơi trường lỏng thích hợp Tại cân hoá chất cần 2-3 người? Do dụng cụ phịng hố chất có hạn, cân hố chất cần 2-3 người đảm bảo thời gian,hiệu làm việc 13 BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT KÍNH HIỂN VI BẰNG KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC Trình bày cấu tạo nguyên tắc hoạt động kính hiển vi quang học a Cấu tạo Kính hiển vi quang học gồm có hai phần: - Hệ thống học: giá kính gồm có chân kính, thân kính, trụ đỡ xoay thị kính, ổ gắn xoay vật kính, bán kính, trượt di chuyển tiêu bản, ốc di chuyển trượt, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh thơ sơ cấp, ốc điều chỉnh thứ cấp (vi cấp) - Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màng chắn sáng, nguồn chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng kính chiếu sáng) Ngồi ra, kính dùng nguồn chiếu sáng đèn điện có thêm phận cung cấp điện phích cắm, dây điện, cầu chì, mạch điện (trong chân kính) nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng b Nguyên tắc hoạt động 14 Vật kính hệ thống quang học phức tạp gồm số thấu kính, trực tiếp phóng đại mẫu vật Các thấu kính xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngồi hướng vào tiêu có độ phóng đại lớn Độ phóng đại kính phụ thuộc vào tiêu cự, tức bán kính cong thấu kính Thấu kính cong, tiêu cự ngắn khả phóng đại lớn Có hai loại vật kính • Vật kính khơ độ phóng đại nhỏ x4,x10,x15,x40 • Vật kính dầu có độ phóng đại lớn x90,x100 Thị kính có độ phóng đại phức tạp, gồm hai thấu kính, hướng phía mắt người xem, hướng vật kính Thị kính phóng đại lần ảnh vật kính thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ Độ phóng đại kính = Độ phóng đại vật kính x độ phóng đại thị kính Ví dụ: Độ phóng đại vật kính x100, độ phóng đại thị kính x10 Như độ phóng đại kính : 100x10=1000 lần Năng suất phân ly kính quan trọng độ phóng đại, tiêu chuẩn để chọn kính hiển vi Có loại kính hiển vi? Đặc điểm loại? Có loại kính hiển vi - Kính hiển vi viền đen Ánh sáng thường chiếu từ lên, qua rìa tụ quang đen, chiếu hắt vào xung quanh tiêu bản, tia sáng bị tiêu làm khúc xạ đưa vào vật kính Tiêu soi sáng rực đen, giống phịng tối có tia sáng chiếu vào, giúp ta thấy rõ hạt bụi khơng khí bị tia sáng chiếu vào Chức năng: quan sát hình thái đặc tính số vi khuẩn mà kính hiển vi thường khó quan sát 15 - Kính hiển vi đổi pha Ánh sáng thường bị đổi pha biên độ dao động cấu trúc đặc biệt tụ quang kính, vật kính thị kính Chức năng: dùng quan sát rõ nét cấu trúc nhỏ tiên mao, lớp màng - Kính hiển vi huỳnh quang Chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu nhuộm màu chất huỳnh quang Trong tế bào, cấu trúc khác phát quang với màu sắc khác Chức năng: quan sát phân biệt cấu trúc khác tế bào vi sinh vật - Kính hiển vi điện tử Chùm tia điện tử bước sóng ngắn, suất phân li lớn nên độ phân giải cao, giúp phân biệt hai điểm gần Chức năng: quan sát vỉut, cấu trúc phân tử tế bào - Kính hiển vi quang học Dùng bước sóng 500 nm – 560 nm chùm ánh sáng thường để tạo suất phân li lớn giúp phân biệt hai điểm cách khoảng 0.2 µm trở lên Hệ thống phóng to kính hiển vi quang học gồm hai phận: vật kính thị kính Mỗi phận hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp Chức kính hiển vi quang học dùng để quan sát tế bào vi sinh vật, kí sinh trùng, tế bào động vật, thực vật Tại quan sát vật kính 100 phải cho giọt dầu soi kính? Do chiết suất ánh sáng khơng khí nhỏ thuỷ tinh, nên tia sáng qua tiêu thuỷ tinh bị khúc xạ phần Phần phía ngồi cuả tia sáng bị khúc xạ nên không vào vật kính Vật kính có độ phóng đại lớn đường kính thấu kính nhỏ, lượng tia sáng vào vật kính nên khơng nhìn rõ ảnh Để hạn chế nhược điểm ta dùng dầu soi kính có chiết suất ánh sáng gần thuỷ tinh Thuỷ tinh dầu soi xem môi trường đồng ánh sáng qua không bị khúc xạ nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ ảnh 16 BÀI PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VI SINH VẬT Báo cáo thực tập Sau nhuộm, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm có màu đỏ vàng hay đỏ tía Giải thích nguyên nhân? Sau nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, cịn vi khuẩn Gram âm có màu đỏ vang (nhuộm safranin O) hay đỏ tía (Fuchsin Ziehl) Sở dĩ có màu vi khuẩn Gram dương vi khuẩn Gram âm có khác biệt thành phần hóa sinh thành tế bào vi khuẩn Thành tế bào vi khuẩn Gram dương có nhiều peptidoglycan (phức chất protein-đường) peptidoglycan liên kết chặt chẽ với từ giúp cho tế bào kháng lại chất tẩy màu nên sau rửa cồn crystal violet khơng bị rửa trơi giữ màu tím, sau nhuộm bổ sung dung dịch safranin O Fuchsin Ziehl, khơng có thay đổi màu nhiều Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có thành phần lipid nồng độ cao chúng hịa tan chất khử màu (aceton, alcohol,…) bị rửa trôi với crystal violet (màu tím), sau nhỏ dung dịch tẩy màu, ta nhuộm them dung dịch safranin O Fuchsin Ziehl, lúc vi khuẩn Gram âm có màu đỏ vàng hay đỏ tía 17 Nếu khơng nhuộm bổ sung thuốc thử safranin fuchsin, vi khuẩn Gram âm có màu gì? Tại sao? Nếu khơng nhuộm bổ sung thuốc thử safranin fuchsin, vi khuẩn Gram âm khơng có màu Bởi giai đoạn tẩy màu cồn rửa trơi crystal violet (có màu tím) nên sau giai đoạn tẩy màu vi khuẩn Gram âm bị màu crystal violet nhuộm trước Hoặc trường hợp vi khuẩn Gram âm có màu tím giai đoạn tẩy rửa, ta không tẩy màu giọt dung dịch cuối chảy khỏi phiến kính không màu BÀI PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT Trình bày nguyên tắc phương pháp phân lập vi khuẩn khiết? Nguyên tắc: - Gieo cấy vi khuẩn pha lỗng mơi trường dinh dưỡng đặc trưng (2% thạch hay gọi agar) - Ni dưỡng điều kiện thích hợp cho mọc khuẩn lạc tách biệt - Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn khiết Phương pháp phân lập vi khuẩn khiết: 1.1 Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn vi sinh vật hiếu khí: Có nhiều kỹ thuật ria khác để thực hộp ria tạo khuẩn lạc đơn Một số kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria bốn góc ,kỹ thuật ria tia ,kỹ thuật ria liên tục Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn thực sau: 18 a Kỹ thuật hộp ria: - Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống - Ria đường đĩa pêtri chứa mơi trường thích hợp (ria chữ T ria bốn góc) Sau đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy làm nguội trước khithực đường ria - Bao gói đĩa pêtri, ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm b Kỹ thuật hộp trải: - Dùng pipetman đầu típ vơ trùng, thao tác vơ trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường đĩa pêtri - Nhúng đầu gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 70 , hơ qua lửa để khử trùng Để đầu gạt nguội không gian vô trùng lửa - Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng gạt lên bề mặt thạch đĩa petri - Dùng đầu gạt xoay, trải dịch giống lên bề mặt thạch Trong trải, thực xoay đĩa vài lần, lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho gạt trải dịch giống khắp bề mặt môi trường - Rút gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm c Kỹ thuật hộp đổ: - Dùng pipetman đầu típ vơ trùng, thao tác vơ trùng chuyển m dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường đĩa pêtri - Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đun chảy để nguộ đến 45 - 55 C vào đĩa petri cấy mẫu - Xoay nhẹ đia petri chiều ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống trộn môi trường cấy - Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên 19 1.2 Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn vi sinh vật hiếu khí: - Dùng mơi trường đặc ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không khí mơi trường - Để nguội mơi trường cịn 45 - 50 C - Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc trịn quanh trục ống nghiệm - Rót nhanh mơi trường ống nghiệm vào nắp đĩa pêtri đậy thật nhanh nắp lại, cho mặt nắp mơi trường khơng cịn khơng khí - Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc nắp đĩa petri ủ nhiệt độ thích hợp - Sau vi sinh vật phát triển, chọn khuẩn lạc riêng rẽ khối môi trường, dùng que cấy cắt khối môi trường cấy vào môi trường lỏng thích hợp Ngun tắc việc ni tích lũy? Ngun tắc việc ni tích lũy: trường hợp số vi khuẩn có mẫu phải ni tích lũy cách ủ mẫu, bổ sung chất dinh dưỡng điều kiện lý hóa cần thiết bổ sung chất ức chế sinh trưởng vi sinh vật kèm Thế chuẩn vi khuẩn khiết (chủng sạch)? Chuẩn vi khuẩn khiết (hay gọi chủng sạch) hiểu hệ con, cháu, dịng có nguồn gốc từ tế bào riêng lẻ Các chủng vi sinh vật thu nhận từ khuẩn lạc phân lập lần đầu chưa khiết khuẩn lạc hình thành nhiều tế bào, bào tử, phải làm nhiều lần thu chủng vi sinh vật khiết 20 BÀI 10: CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA Phản ứng tạo indol VSV có hệ emzym Mục đích: Phát VSV có khả sinh indol tryptophanase Sơ đồ: 21 Kết quả, dương tính (màu hồng) âm tính (màu vàng) Thuốc thử Kovac’s 37 o C 24h Chủng Vi Sinh Vật Mơi Trường: NB Tripton Âm tính 37oC / 24h Chủng Vi Sinh Vật Môi Trường Dương tính Âm tính Cơ chế phép thử: Vi sinh vật tiết enzyme tryptophannase chuyển hóa tryptophan mơi trường thành Indol Indol kết hợp với para-dimethylaminbenzaldehyd thuốc thử kovac’s tạo thành phức chất có màu hồng cánh sen Ý nghĩa: • Phép thử cho biết chủng loại vi sinh vật có khả tiết enzyme tryptophannase, giúp ta định danh số chủng loại vi sinh vật Là phản ứng giúp phân biệt ◦ E coli (+) với Klebsiella (-) ◦ Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+) ◦ Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-)… Đối chứng (+) Proteus rettgeri (-) Serratia marcescens 22 Môi trường MR-VP Chủng vi sinh vật Kết quả, màu đỏ (Dương tính), màu vàng: (âm tính) Chủng Vi Sinh Vật Mơi Trường 2-4 ngày Dương tính Âm tính Phản ứng MR (methyl red) Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất trì acid bền trình lên men glucose Cơ chế: Cơ sở sinh hóa: ◦ Chất thị pH: methyl red ◦ MR (+) – kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường acid ◦ MR (-) – kéo dài thời gian ni cấy – chất có tính acid bị chuyển hóa – mơi trường dần trung tính 23 24h, 37 o C Methyl Red Dưới 4,4 5,0 – 5,8 Trên 6,0 Môi trường MR-VP Chủng vi sinh vật 24h, 37oC KOH 10% (NaOH 40%) Kết quả,màu đỏ hồng (Dương tính), khơng đổi màu (âm tính) -naphthol Âm tính Dương tính Thời gian ủ – ngày 37 o C Cơ chế: số vi sinh vật có khả chuyển hóa Glucose qua q trình đường phân tạo thành acid pyruvic, từ Acid pyruvic chuyển hóa thành acetyl coenzyme A, qua chu trình Kreps tạo acid: acid citric, acid succinic, acid fomic, a cid malic, a cid oxalic… từ Acid pyruvic chuyển trực tiếp thành acid lactic, acid fomic,… Trong mơi trường MR-VP có PH= 6.9±0.2 có K2HPO4 (đệm phosphat) giúp ổn định PH, có mặt acid hữu mạnh công phá vỡ PH ổn định làm cho PH giảm mạnh, PH