BÁO cáo THỰC HÀNH VI SINH vật bài 2 PHÂN lập VI SINH vật bài 3 NUÔI cấy, QUAN sát sự PHÁT TRIỂN của VI SINH vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN LANG KHOA CÔNG NGHỆ ỨNG DỤNG BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH VẬT Lớp: K27CNTM01 Nhóm – Tổ Sinh viên thực hiện: Nguyễn Phương Thi - 2174202070046 Nguyễn Ngọc Phương Lê - 2174202070031 Lê Thị Minh Ngọc - 2174202070005 GVHD: VÕ THỊ XUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2023 MỤC LỤC BÀI 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT……………………………………………………………………………………… BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT 11 BÀI 3: NUÔI CẤY, QUAN SÁT SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT……………20 BÀI 4: ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT…………………………………….31 BÀI 5: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI…… 37 BÀI 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NI CẤY VI SINH VẬT I MỤC ĐÍCH Pha chế môi trường nhằm thực việc phân lập, nhân giống, giữ giống VSV, đồng thời để nuôi cấy nghiên cứu đặc điểm sinh học chúng Môi trường cần phải đủ lượng đủ chất đảm bảo phát triển vi sinh vật Biết cách bao gói, làm nút bơng, khử trùng dụng cụ, biết bước thực pha chế khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật II Chuẩn bị dụng cụ Bao gói dụng cụ 1.1 Mục đích Việc đóng gói dụng cụ có tác dụng hàng rào vi sinh vật hay chất khác (ví dụ, bụi, động vật kí sinh) sau trình khử khuẩn hồn tất, có độ bền với nhiệt, đủ độ mềm phép gói kín, bọc lại mở ra; không chứa thành phần gây độc hay thuốc nhuộm; đảm bảo giữ tình trạng vơ trùng dụng cụ khử khuẩn trì tình trạng ngun vẹn gói đồ. Thời hạn bảo quản dụng cụ phụ thuộc vào loại giấy gói sử dụng 1.2 Nguyên tắc - Dụng cụ bao gói để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, phải thật khơ, khơng bị nứt nẻ - Việc bao gói phải thật kín cẩn thận để dụng cụ sau khử trùng đảm bảo vơ trùng lớp giấy gói lấy sử dụng dễ dàng 1.3 Phương pháp bao gói dụng cụ Việc bao gói dụng cụ gồm hai khâu: - Làm nút bơng: ống nghiệm, bình tam giác, pipet… - Bao gói: cho hầu hết dụng cụ thủy tinh 1.4 Cách làm nút bơng Dùng miếng gịn không thấm nước cuộn lại, nhét vào miệng ống nghiệm cho vừa đủ chặt Yêu cầu:   - Nút gòn có kích thước độ chặt vừa phải  - Đầu nút phải trịn, gọn, phần ngồi lớn phần ống nghiệm - Lấy nút hay đóng vào dễ dàng.  Cách làm nút gòn áp dụng cho chai lọ, bình cầu, bình tam giác… cách làm tương tự ống nghiệm Nhưng lượng gịn sử dụng phải nhiều bọc lớp vải gạc 1.5 Cách bao gói dụng cụ Với dụng cụ sau làm nút bơng, cần bao gói phần có nút giấy dầu hay giấy báo để sau hấp khử trùng nút không bị ướt đảm bảo vô trùng tốt Cách làm sau:  - Cắt mảnh giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói.  - Quấn giấy quanh phần đầu nút bông.  - Gập ống giấy sát vào nút mặt trước hai bên.  - Gập nốt phần giấy lại cài sâu vào bên trong.  Yêu cầu:  + Phần giấy bao phải chặt kín.  + Bao giấy dầu với dụng cụ hấp ướt.  + Bao giấy báo với dụng cụ sấy khô khử trùng  Với dụng cụ pipet, đĩa petri, que gạt phải dùng giấy bao kín tồn Có thể thay giấy báo hộp nhơm kín đựng tất dụng cụ để khử trùng.  Hình 1: làm nút bơng bao gói dụng cụ Phương pháp khử trùng 2.1 Mục đích Làm chết hồn tồn mầm mống vi sinh vật, kể vi sinh vật có bào tử Đây khâu quan trọng Khi nghiên cứu vi sinh vật, cần thiết phải khử trùng môi trường, dụng cụ, thiết bị để tránh phát triển lẫn lộn hệ vi sinh vật ngoại lai vào giống vi sinh vật nghiên cứu 2.2 Các phương pháp khử trùng Có thể khử trùng số tác nhân lý hóa nhiệt độ, xạ, lọc hóa chất Tác nhân khử trùng chọn tùy mục đích vật liệu cần khử trùng.  - Các dụng cụ thủy tinh bền với nhiệt nên thường khử trùng phương pháp nhiệt khô tủ sấy Các gạt thủy tinh khử trùng cách đốt với cồn 70 0C que cấy kim loại khử trùng cách đốt trực tiếp lửa.  - Trường hợp cần khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật, phương pháp nhiệt ẩm nồi hấp áp lực (autoclave, 1atm, 121 0C) thường sử dụng để thành  phần hữu môi trường khơng bị cháy, biến tính mơi trường khơng bị nước  - Trường hợp môi trường chứa chất phân tử lượng nhỏ không bền với nhiệt vitamin, amino acid, huyết chứa protein nhân tố tăng trưởng, phương pháp nhiệt ẩm làm biến tính thành phần nên thường khử trùng riêng phương pháp lọc qua màng.  2.1 Khử trùng dụng cụ, môi trường nồi hấp áp lực  Phương pháp thực nồi hấp vô trùng áp suất cao Là thiết bị làm kim loại, chịu nhiệt độ áp suất cao, có khả tự động điều chỉnh áp suất thời gian khử trùng theo yêu cầu người sử dụng.  - Nguyên tắc hoạt động  Làm gia tăng nhiệt độ nước bão hòa áp suất lớn áp suất bình thường khí Khi áp suất nước tăng lên nhiệt độ tăng theo nhờ hệ thống van chặt chẽ.  Mối quan hệ áp suất ghi áp kế với nhiệt độ nồi biểu qua bảng sau đây:  Áp suất Nhiệt độ (0C) (atm) 100 0,5 112 1,0 121 1,5 128 2,0 134 Phương pháp khử trùng nhiệt ẩm cho phép diệt tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử vi sinh vật.  - Trình tự bước sử dụng nồi hấp áp lực sau  + Bổ sung nước đáy nồi đến vạch quy định.  + Xếp dụng cụ vật liệu cần khử trùng vào giá đặt bên nồi hấp, không nên xếp chặt để nước lưu thông dễ dàng  + Đậy kín nắp nồi hấp Trường hợp nắp có nhiều ốc vặn, cần vặn ốc theo cặp đối xứng nhau.  + Mở van thông nồi (trường hợp nồi hấp lớp)  + Bật công tắc, đun nồi hấp.  + Khi nhiệt độ lên đến 80 0C 0,5 atm, mở từ từ van xả để đuổi hết khơng khí khỏi nồi vòng – phút luồng nước liên tục, đóng van lại + Khi áp suất lên đến mức cần thiết bắt đầu tính thời gian khử trùng + Khi đủ thời gian khử trùng, tắt điện, chờ nhiệt độ áp suất hạ xuống giá trị mở nắp để tránh gây tai nạn tránh áp suất thay đổi đột ngột làm hư môi trường.  Một số nồi hấp đại tự kiểm sốt thời gian, áp suất tự đuổi khí khỏi nồi, cho phép bỏ qua số thao tác tương ứng phần Chú ý: để đảm bảo an toàn hiệu việc hấp khử trùng, việc thận trọng thực qui trình dẫn, người làm thí nghiệm cần phải: + Kiểm tra mực nước bổ sung lượng nước cần thiết trước sử dụng + Với nắp nồi có nhiều ốc vặn, cần phải xiết ốc theo cặp đối xứng để đảm bảo độ kín, tránh làm nắp nồi bị chênh hư vịng đệm cao su + Tuyệt đối khơng mở nắp nồi kim nhiệt độ áp suất chưa trở + Trực dõi trình hấp khử trùng kết thúc ngắt điện Các bình tam giác, chai lọ, ống nghiệm chứa môi trường trước khử trùng phương pháp nhiệt ẩm cần đậy chặt đảm bảo cho phép khơng khí nước thơng qua.   Thơng thường, hộp petri nút bơng cịn bao gói giấy giấy nhơm để tránh nguy bị nhiễm sau khử trùng Sau hấp, hộp petri cần sấy khô trước dùng.  2.2 Khử trùng dụng cụ thủy tinh phương pháp nhiệt khô Các hộp petri, ống hút thủy tinh bền với nhiệt khử trùng phương pháp sấy 1700C trong tủ sấy Trong trường hợp này, ống hút cần nhét nút không thấm nước đầu hút Hộp petri, ống hút, dụng cụ cần khử trùng khác gói kín giấy giấy nhơm trước sấy III PHA CHẾ MƠI TRƯỜNG Khái niệm chung Mơi trường dinh dưỡng hỗn hợp gồm chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu tế bào ổn định pH môi trường Các yêu cầu môi trường dinh dưỡng Bất kỳ môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật cần đạt yêu cầu sau đây:  - Có đủ chất dinh dưỡng cần thiết - Có độ pH thích hợp - Có độ nhớt định - Hồn tồn vơ khuẩn - Khơng chứa yếu tố độc hại Phương pháp làm mơi trường 3.1 Ngun tắc Tùy theo mục đích khảo cứu mà ta điều chế loại môi trường cho hợp lí Khi điều chế mơi trường, ta dựa nguyên tắc sau đây: - Dựa sở nhu cầu chất dinh dưỡng khả đồng hóa chất dinh dưỡng loại vi sinh vật - Đảm bảo cân áp suất thẩm thấu môi trường tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ nồng độ chất thành phần môi trường - Đảm bảo điều kiện hóa lý cần thiết cho hoạt động trao đổi chất vi sinh vật 3.2 Các bước làm môi trường dinh dưỡng a Pha chế Cân, đong xác thành phần mơi trường pha chế theo trình tự hướng dẫn.  + Với môi trường lỏng: chất cân đong xong cho hịa tan vào nước + Với mơi trường đặc: mơi trường lỏng có bổ sung thêm agar (1,5 – 2,5%) Cân hóa chất cho hịa tan vào nước, bổ sung lượng nước đủ theo công thức Cho agar vào, đun sôi khuấy agar vừa tan b Làm môi trường Môi trường nuôi cấy vi sinh vật – môi trường lỏng cần phải hoàn toàn để dễ quan sát phát triển chúng Có thể làm mơi trường phương pháp sau:  + Với môi trường lỏng: người ta lọc qua vải nhiều lớp, qua thấm nước qua giấy lọc.  + Với môi trường đặc thường lọc qua vải lớp giấy lọc điều kiện có phễu lọc nóng c Điều chỉnh pH môi trường Độ pH môi trường tùy theo đối tượng vi sinh vật nuôi cấy tùy theo yêu cầu khảo cứu Vì làm mơi trường cần điều chỉnh pH cho thích hợp.  Muốn điều chỉnh pH môi trường, người ta dùng HCl, NaOH 0,1N nồng độ 10% Cũng dùng chất khác H3PO4, H2PO4, H2SO4, KOH… Để kiểm tra pH môi trường tốt dùng máy đo pH Phương pháp nhanh nhạy độ xác cao Trong phịng thí nghiệm, người ta thường dùng thị màu xanh bromotinol (ở pH = 7,3 thị màu xanh có màu lam lục.  Ở pH ≤ có màu vàng, pH ≥ 7,6 có màu lam lục) hay giấy quỳ để đo pH.  Phương pháp tiện lợi, nhanh độ xác khơng cao d Phân phối môi trường vào dụng cụ Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác Nếu mơi trường đặc, cần phải đun cho agar vừa tan phân phối vào dụng cụ Khi phân phối môi trường vào dụng cụ cần phải ý: + Đối với ống nghiệm: dùng làm mơi trường thạch nghiêng lượng mơi trường cần phân phối chiếm ¼ thể tích ống nghiệm + Nếu dùng làm thạch đứng lượng mơi trường 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm + Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường phân phối chiếm 1/2 - 2/3 thể tích bình + Các thao tác phải nhanh, gọn, khéo léo để mơi trường khơng dính lên miệng dụng cụ nút việc phân phối cần thực xong trước môi trường bị đông đặc e Khử trùng mơi trường Tùy theo tính chất điều kiện cụ thể loại môi trường mà chế độ phương pháp khử trùng khác sau: + Phương pháp Pasteur + Phương pháp Tyndal + Phương pháp lọc dụng cụ lọc vô khuẩn + Phương pháp hấp nước bão hòa áp suất cao f Phương pháp làm môi trường đặc - Làm thạch nghiêng Sau khử trùng xong, ta lấy ống nghiệm lỏng đặt nghiêng thước gỗ que thủy tinh cho thạch ống nghiêng tới 2/3 chiều dài ống Tuyệt đối không để thạch chạm vào nút Để yên thạch đông đặc Yêu cầu mặt thạch phải phẳng, nhẵn, không bị đứt - Làm thạch đứng Cho ống nghiệm với lượng mơi trường đặc chiếm ½ đến 2/3 ống nghiệm Thạch cịn nóng ta để đứng ống thạch vào giá, để yên môi trường nguội đông đặc - Đỗ thạch vào đĩa petri Trong tồn qui trình đổ thạch vào đĩa petri thực tủ cấy vô trùng gồm thao tác sau: + Mở bao gói giấy đĩa petri + Tay phải cầm dụng cụ chứa môi trường + Tay trái lấy nút hơ miệng bình đèn cồn + Nghiêng bình rót nhẹ mơi trường vào đĩa petri sau tay trái mở nắp đĩa + Đậy nắp lại, xoay trịn đĩa petri để mơi trường phân phối mặt đĩa + Để yên cho môi trường nguội đông đặc + Lật ngược hộp cho đáy lên Chú ý: Thao tác đổ thạch phải khẩn trương khéo léo để hạn chế nhiễm vi sinh vật Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng mm Sau – ngày kiểm tra xem mơi trường có nhiễm khuẩn không sử dụng Nhớ viết vào nhãn tên môi trường, ngày pha chế g Bảo quản kiểm tra môi trường Môi trường chưa dùng cần bảo quản chỗ mát, hạn chế tác dụng ánh sáng, nhiệt độ từ 0o – 5oC không để môi trường bị khô Trước sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn môi trường người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 37oC, 48 – 72h Sau lấy quan sát loại bỏ môi trường có vi sinh vật phát triển sử dụng ống nghiệm, đĩa petri có mơi trường đạt tiêu chuẩn 3.3 Pha chế số môi trường thông dụng Môi trường PGA (potato glucose agar): dùng phân lập nuôi cấy nấm mốc Môi trường Hansen: dùng để phân lập nuôi cấy nấm men Môi trường Pepton lỏng đặc: nuôi cấy vi khuẩn Môi trường Baird Parker Agar (BPA) môi trường mannitol salt phenol red: dùng để phân lập nuôi cấy Staphylococcus Môi trường MRSA: dùng để phân lập nuôi cấy Lactobacillus Môi trường MSPR IV BÁO CÁO KẾT QUẢ Trình bày mục đích nguyên tắc việc bao gói dụng cụ? (đã trình bày trên) - Nghiêng que cấy 10 –15 độ, nhẹ nhàng dàn giọt canh trường khắp diện tích khoanh, khơng sát mạnh - Khử trùng que cấy để vào giá - Để vết bôi khô tự nhiên Chú ý: + Lượng vi sinh vật lấy vừa phải + Vết bôi trịn, gọn thật mỏng, vi sinh vật khơng tập trung vào chỗ chồng chất thành nhiều lớp, mà phải phân phối vết bơi + Kích thước vết bôi vừa phải khoảng 1- cm2, bé khó quan sát, lớn thời gian, tốn thuốc nhuộm b Cố định vết bôi Việc cố định vết bơi nhằm mục đích sau: + Giết chết vi sinh vật để an toàn tiếp xúc + Gắn chặt vi sinh vật vào phiến kính để lúc nhuộm rửa khơng bị trơi + Làm cho vi sinh vật dễ bắt màu Có nhiều phương pháp cố định, phương pháp đơn giản hơ nóng đèn cồn, cách làm sau: kẹp phiến kính ngón tay ngón trỏ, đưa qua lại – lần phần khơng nóng đèn cồn, tránh khơng để tiêu nóng q Khi nghiên cứu cấu tạo tế bào việc cố định cách hơ nóng khơng có lợi, mà phải cố định hóa chất, thường dùng chất rượu axêton Các cách cố định sau: + Nhúng vết bôi vào rượu Với rượu 950 ngâm vết bôi từ – 15 phút Với rượu metylic ngâm khoảng – phút + Ngâm vết bôi vào dung dịch axêton phút + Nhỏ vài giọt rượu 90 – 950 lên vết bôi Đốt cháy dập tắt Làm vài lần để khô c Nhuộm màu tiêu Nguyên tắc: Sử dụng thuốc nhuộm có khả thẩm thấu qua màng tế bào kết hợp với thành phần khác tế bào thành hợp chất màu đặc trưng bền vững - Tùy theo mục đích nghiên cứu khả bắt màu khác thành phần tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm cho phù hợp - Có hai cách nhuộm chính: + Nhuộm đơn giản: dùng lọai thuốc nhuộm tiêu 40 + Nhuộm phức tạp (nhuộm kép): dùng đồng thời hay nhiều loại thuốc nhuộm tiêu Ví dụ: nhuộm gram, nhộm bào tử, nhuộm tiêm mao… Như vậy, tùy mục đích nghiên cứu mà ta áp dụng phương pháp nhuộm thích hợp Cách nhuộm: Vết bơi cố định phải để khô đem nhuộm - Đặt tiêu có vết bơi lên cầu thủy tinh (được đặt nằm ngang miệng bôcan) - Đặt miếng giấy lọc phủ lên tồn vết bơi - Dùng ống nhỏ giọt nhỏ thuốc nhuộm phủ vết bôi Chú ý không cho thuốc nhuộm nhiều thời gian nhuộm vết bơi ln ln có phủ lớp thuốc nhuộm - Thời gian nhuộm tùy tính chất tiêu thuốc nhuộm - Thường nhuộm nhiệt độ phòng Để tăng cường tác dụng thuốc nhuộm rút ngắn thời gian ta hơ nóng đèn cồn - Khi nhuộm xong, rửa vết bôi cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dịng nước chảy nhẹ qua vết bôi đến nước chảy không cịn màu - Dùng giấy thấm khơ tiêu hơ nhẹ tiêu đèn cồn - Quan sát tiêu vật kính 40x chuyển sang vật kính 100x có dầu 2.2 Các phương pháp nhuộm tế bào vi sinh vật a Nhuộm đơn giản Là phương pháp hay dùng phịng thí nghiệm, cho phép ta nhận định nhanh chóng hình dạng vi sinh vật Tiến hành nhuộm tế bào vi khuẩn E coli, Bac.subtilis, Staphylococcus aureus, Lactobicillus plantarum, tế bào nấm men theo trình tự sau: - Làm vết bơi, để khô tự nhiên - Cố định cách hơ nhẹ đèn cồn - Đặt giấy lọc lên vết bôi cố định - Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm Fuchsin loãng – phút xanh metylen – phút - Dùng nước rửa - Thấm khô giấy thấm - Quan sát vật kính 100x (có dầu) b Nhuộm phức tạp (nhuộm kép) 41 Phương pháp dựa đặc tính cấu tạo hóa học tế bào, dùng để nghiên cứu cấu tạo đặc tính tế bào khác loài vi sinh vật  NHUỘM GRAM Nguyên tắc: Dựa khả bắt màu với thuốc nhuộm tím kết tinh iod mà chia thành nhóm lớn + Nhóm giữ phức chất tạo thành tím kết tinh iod xử lý cồn Nhóm vi khuẩn có tính chất gọi vi khuẩn gram dương + Nhóm khơng giữ phức chất tạo thành tím kết tinh iod xử lý cồn Nhóm vi khuẩn có tính chất gọi vi khuẩn gram âm Tiến hành nhuộm tế bào E coli Bac subtilis, Staphylococcus aureus, Lactobicillus plantarum  Chuẩn bị tiêu - Làm vết bôi, để khô - Cố định nhẹ lửa đèn cồn (tránh làm nóng quá)  Nhuộm tiêu - Đặt giấy lọc lên vết bơi - Nhuộm tiêu tím kết tinh – phút - Đổ hết thuốc đi, nhỏ dung dịch lugol lên để phút - Rửa nước, thấm khô - Nhúng vào cồn 950 30 giây Cần làm cẩn thận kết phụ thuộc nhiều vào động tác - Rửa nước, thấm khơ - Nhuộm bổ sung Funshin lỗng phút - Rửa nước, thấm khô - Xem tiêu vật kính dầu Kết quả: Bac.subtilis, Staphylococcus aureus, Lactobicillus plantarum bắt màu tím, E coli bắt màu hồng  NHUỘM BÀO TỬ (NHA BÀO) Nguyên tắc: Dựa cấu trúc đặc biệt màng bào tử dày, chắc, khó bắt màu nên nhuộm cần phải dùng thuốc nhuộm đặc, xử lý tế bào chất bào tử dễ bắt màu nhiệt axit Có nhiều phương pháp nhuộm bào tử, tất phương pháp dựa nguyên tắc: 42 Đầu tiên nhuộm toàn (cả tế bào chất bào tử tế bào) loại thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh - Làm màu tế bào (nhưng bào tử màu) - Nhuộm lại tế bào loại thuốc nhuộm khác Nhờ mà tế bào chất bào tử tế bào chất tế bào bắt màu khác Làm tiêu nhuộm (Theo phương pháp Ogietska) - Làm vết bôi với Bac.subtilis nuôi cấy tuần tuổi ống thạch nghiêng, để khô tự nhiên - Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng đèn cồn cho bốc hơi, giữ phút rửa nước - Đặt giấy lọc lên vết bôi - Nhỏ Fuchsin Ziehl – phút Trong nhuộm hơ nóng bốc nhẹ Nếu thuốc nhuộm cạn phải thêm vào, không để bị khô - Rửa vết bôi, để khô - Tẩy màu cách nhúng phiến kính vào dung dịch H 2SO4 1% đến phút - Rửa nước - Nhuộm vết bôi xanh metylen Loeffler – phút - Rửa sạch, để khô - Quan sát tiêu vật kính dầu Kết quả: bào tử màu đỏ, tế bào chất màu xanh IV THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ Làm tiêu tạm thời quan sát hình dạng tế bào nấm mốc, nấm men Cách làm: trình bày nội dung ( nội dung III -> -> 1.1 -> a) Quan sát: Nấm mốc:có dạng hình sợi, dài, sợi nấm là mợt ớng hình trụ dài, có bào tử 43 Vật kính 10x Vật kính 40x Nấm men: có dạng hình bầu dục, khơng có bào tử Vật kính 10x Vật kính 40x Quan sát hình dạng tế bào nấm men, Bac.subtilis, E coli vật kính dầu nhuộm đơn Cách làm: trình bày nội dung ( nội dung III -> -> 2.2 -> a) Quan sát: Nấm men ( trạng thái chết): hình bầu dục, bắt thuốc nhuộm nhiều 44 Vật kính 100x, thuốc nhuộm Fuchsin Nấm men ( trạng thái sống): Vật kính 100x, thuốc nhuộm Fuchsin Bac.subtilis: có hình que,có bào tử, có khuyh hướng phình đầu Vật kính 100x, thuốc nhuộm Fuchsin 45 E coli: có hình que Vật kính 100x, thuốc nhuộm Fuchsin Thực hành làm tiêu phòng ẩm Quan sát sợi khuẩn ty cuống sinh bào tử nấm mốc tiêu chuẩn bị sẵn Cách làm: trình bày ( nội dung số III -> -> 1.1 -> b ) Quan sát: Nấm mốc thường phát triển tốt điều kiện ẩm ướt, nấm mốc sinh sản cách tự phân đôi, tạo bào tử Quan sát vật kính 40x Thực hành làm tiêu nhuộm gram: Cách làm: trình bày ( nội dung III -> -> 2.2 -> b) Quan sát: Bac.subtilis:vi khuẩn bắt màu tím -> gram dương 46 Quan sát vật kính 100x, bắt màu tím E coli: nhuộm fuchsin vi khuẩn bắt màu hồng -> vi khuẩn gram âm Quan sát vật kính 100x Bắt màu hồng -> vi khuẩn gram âm Nhuộm bào tử: Cách làm: trình bày ( nội dung III -> -> 2.2 -> b) Quan sát: Bac.subtilis: nhận thấy bảo tử có màu đỏ tế bào chất có màu xanh đặt điều kiện môi trường khắc nghiệt Phương pháp Ogietska, quan sát vật kính 100x 47 Câu hỏi: Cho biết ý nghĩa việc nghiên cứu đặc điểm sinh học vi sinh vật? Giúp người nghiên cứu hiểu rõ hình thái, cấu tạo, sinh lí, sinh trưởng phát triển vi sinh vật, qua người khai thác, ứng dụng chúng vào sống Mơ tả hình dạng tế bào vi khuẩn ( không thực hành), nấm men quan sát kính hiển vi? ( trình bày mục IV) Trình bày phương pháp làm tiêu phịng ẩm ( trình bày nội dung số III -> -> 1.1 -> b ) Mơ tả vẽ hình cấu trúc sợi nấm, cuống sinh bào tử nấm mốc quan sát được? ( trình bày mục IV) Trình bày nguyên tắc ý nghĩa việc nhuộm đơn, nhuộm kép (nhuộm gram, nhuộm bào tử) nghiên cứu vi sinh vật? Nhuộm đơn: Ý nghĩa: giúp nhận định nhanh chóng hình dạng vi sinh vật Ngun tắc: phải cố định mẫu ( cách làm vết bơi) quan sát Nhuộm gram: Ý nghĩa: phương pháp xác định loại vi khuẩn nhanh ni cấy có ý nghĩa giúp phân biệt sớm bệnh nhiễm khuẩn để xác định hướng điều trị tiên lượng bệnh Nguyên tắc:VK Gram dương Gram âm có cấu tạo vách tế bào khác nhau, thực nhuộm chúng bắt màu thuốc nhuộm khác Lớp vách tế bào mang tính định đến tính chất bắt màu trình nhuộm Màu sắc hai loại vi khuẩn sau: + Vi khuẩn Gram (+) ( màu tím):do lớp vách tế bào peptidoglycan dày, dạng lưới có khả bắt màu tím thuốc nhuộm tím -> việc tẩy cồn khó khăn vi khuẩn giữ màu tím thuốc nhuộm tím + Vi khuẩn Gram (-) (màu hồng):lớp vách peptidoglycan mỏng có thêm lớp màng lipopolysaccharide -> cồn hịa tan lớp màng lớp vách mỏng bị cồn tẩy dễ dàng nên khơng giữ màu tím thuốc nhuộm -> bắt màu thuốc nhuộm sau dung dịch Fushin kiềm Nhuộm bào tử: Ý nghĩa: Nguyên tắc: dựa cấu trúc đặc biệt màng bào tử dày, chắc, khó bắt 48 màu nên nhuộm cần phải dùng thuốc nhuộm đặc, xử lý tế bào chất bào tử dễ bắt màu nhiệt axit Nguyên tắc bản: nhuộm toàn -> làm màu tế bào -> nhuộm lại thuốc khác -> quan sát Tóm tắt phương pháp nhuộm đơn Vẽ hình tế bào quan sát được? Tóm tắt: Chuẩn bị sẵn mẫu cần quan sát -> làm vết bôi -> cố định vết bôi -> đặt giấy lọc lên vết bơi sau nhỏ thuốc nhuộm -> rửa nhẹ -> thấm khơ nước -> quan sát vật kính 100x Tóm tắt phương pháp nhuộm gram Vẽ hình giải thích kết nhuộm? Chuẩn bị sẵn mẫu cần quan sát -> làm vết bôi -> cố định vết bôi -> đặt giấy lọc lên vết bôi sau nhỏ thuốc nhuộm tím kết tinh (1-2p) -> đổ hết thuốc nhuộm 1-> nhỏ lugol lên ( 1p) -> rửa nước nhẹ, thấm khô nước ->nhúng vào cồn 95 (30s)-> rửa nước nhẹ, thấm khô nước -> nhỏ thuốc nhuộm Funshin-> rửa nước nhẹ, thấm khô-> quan sát vật kính 100x Tóm tắt phương pháp nhuộm bào tử Vẽ hình thích kết quan sát được? Chuẩn bị sẵn mẫu cần quan sát -> làm vết bơi -> nhỏ HCL 0.5% -> hơ nóng -> đặt giấy lọc nhỏ thuốc nhuộm Fuchsin Ziehl (3-5p)-> rửa vết bôi để tự khô-> tẩy màu ( nhúng phiến kính vào dd H2SO4 1% 1-2p) -> rửa nước -> nhuộm vết bôi xanh metylen Loeffler ( 1-2 phút) -> rửa sạch, để khô -> quan sát vật kính 100x 49 50 51 52 53 54