Báo cáo thực hành hoá sinh hoá học, chuyển hoá protid và ứng dụng thí nghiệm 1 phản ứng ninhydrin

Nguyên tắc - Protein tác dụng với Cu2+ trong môi trường kiềm tạo phức chất màu tím hồng, phản ứng xảy ra do các liên kết peptid.. Hiện tượng: có sự xuất hiện của màu tím Giải thích: Sự

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH

BỘ MÔN HOÁ SINH

BÁO CÁO THỰC HÀNH HOÁ SINH

Giảng viên: Huỳnh Tấn Thành

Thành viên:

1 Trương Ngọc Gia Linh – 116421027 – DA21RHM

2 Lưu Thị Ngọc Nhi – 116421012 – DA21RHM

3 Trương Quang Trung – 116421037 – DA21RHM

HOÁ HỌC, CHUYỂN HOÁ PROTID VÀ

ỨNG DỤNG

THÍ NGHIỆM 1: Phản ứng Ninhydrin

1 Nguyên tắc

- Dung dịch protein , peptid hoặc acid amin khi đung nóng với Ninhydrin 0.2% sẽ cho

màu xanh tím

- Ninhydrin là một chất oxy hóa nên có thể tạo nên phản ứng carboxyl oxy hóa của acid

amin với H2O, để cuối cùng cho ra CO2, NH3 và một aldehyde ngắn đi một carbon so

với acid amin gốc và Ninhydrin bị khử Sau đó, Ninhydrin bị khử lại tác dụng lại với

NH3 vừa được phóng thích và kết hợp với một phân tử Ninhydrin thứ hai, tạo thành

sản phẩm ngưng kết có màu xanh tím

2 Hoá chất

- Dung dịch Glycine

- Dung dịch lòng trắng trứng

- Dung dịch Ninhydrin 0,2%

3 Tiến hành

- Lấy 2 ống nghiệm, đánh số 1 và 2, cho vào :

+ Ống 1 : 1ml dung dịch Glycine

+ Ống 2 : 1ml dung dịch lòng trắng trứng

- Thêm vào mỗi ống 1ml dung dịch thuốc thử Ninhydrin 0.2%

- Đun nóng cả 2 ống nghiệm trong ngọn lửa đèn cồn ( ~ 30 giây )

4 Hiện tượng và giải thích

Hiện tượng :

- Ống 1 : Xuất hiện màu xanh tím

- Ống 2 : Không xuất hiện màu

 Giải thích: Sự xuất hiện màu xanh tím là do phản ứng của Ninhydrin và acid amin

Ống 2 Ống 1

Acid amin tác dụng với Ninhydrin ở nhiệt độ cao sẽ bị dezamin hóa, oxy hóa và

decacboxy hóa tạo thành CO2 , NH3 , andehit tương ứng ( ngắn đi 1 cacbon so với

acid amin gốc ) và phản ứng Ninhydrin bị khử Phân tử ninhydrin bị khử tác dụng với

NH3 vừa tạo thành Một phân tử Ninhydrin chưa bị khử cho ra phức hợp màu đỏ tía

Phức hợp tạo thành màu đỏ tía hay màu xanh tím phụ thuộc vào lượng NH3 tạo thành

5 Kết luận

Ý nghĩa: Đây là phản ứng chung cho các protid và acid amin tự do Phản ứng này cho

phép nhận dạng tất cả các acid amin có nhóm NH2 và COOH tự do Ngoại trừ prolin

và OH prolin tác dụng với Ninhydrin tạo thành màu vàng

THÍ NGHIỆM 2: Phản ứng Biuret

1 Nguyên tắc

- Protein tác dụng với Cu2+ trong môi trường kiềm tạo phức chất màu tím hồng, phản

ứng xảy ra do các liên kết peptid

- Sở dĩ gọi là phản ứng Biuret là do chất Biuret ( có nhóm CO-NH , giống như một liên

kết peptid ) cũng cho phản ứng tương tự, tạo phức hợp có màu giống như protein Sự

tạo thành Biuret:

2 Hoá chất

- Dung dịch CuSO4

- Dung dịch NaOH 40%

- Dung dịch lòng trắng trứng

3 Tiến hành

Cho lần lượt vào ống nghiệm các chất sau:

+ 3 giọt dung dịch CuSO4

+ 0,5 ml dung dịch NaOH 40%

+ 1 ml dung dịch lòng trắng trứng

Lắc đều

4 Hiện tượng và giải thích

Hiện tượng: có sự xuất hiện của màu tím

 Giải thích: Sự xuất hiện màu tím là do dung dịch protein ( lòng trắng trứng ) có liên

kết peptide tác dụng được với Cu2+ trong môi trường kiềm tạo phức chất màu tím

5 Kết luận

Ý nghĩa: Màu của phản ứng phụ thuộc vào lượng đồng (Cu) và số lượng các liên kết

peptide Phản ứng dùng để định lượng protein và xác nhận các liên kết peptide

THÍ NGHIỆM 3: Phản ứng tủa protein bởi nhiệt với môi trường acid yếu

1 Nguyên tắc

- Protein hòa tan trong nước hình thành dung dịch keo, trong đó các tiểu phân protein

tích điện cùng dấu và mang lớp áo nước ( hydrat hóa ) Nhờ tích điện cùng dấu nên

các tiểu phân protein đẩy nhau và nhờ có lớp áo nước nên chúng ngăn cách nhau, vì

vậy dung dịch keo protein tương đối bền vững

- Nếu làm mất 2 yếu tố trên thì các tiểu phân protein do chuyển động sẽ gặp nhau, dính

vào nhau tạo thành những hạt to và kết tủa

 Làm mất protein bằng cách:

+ Thêm chất điện giải như NaCl, (NH4)2SO4,…

+ Hoặc đưa pH của môi trường chứa protein về pHi đẳng điện của protein Các tiểu

phân protein khi đã mất điện tích chỉ còn lớp áo nước thì dễ bị kết tủa nếu làm mất

lớp áo nước thì protein sẽ kết tủa

 Làm mất lớp áo nước của protein

+ Thêm chất khử vào môi trường chứa protein ( ví dụ : alcohol, aceton, (NH4)2SO4,…)

+ Hoặc làm biến tính protein bằng cách đun sôi, thêm acid hay kiềm mạnh hoặc muối

kim loại nặng

2 Hoá chất

- Dung dịch lòng trắng trứng

- Dung dịch Acid acetic 1%

- Dung dịch Acid acetic 10%

- Dung dịch NaCl bão hoà

- Dung dịch NaOH 10%

3 Tiến hành

Dung dịch Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5

Lòng trắng trứng đã thẩm tích 1 ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Acid acetic 1% 2 giọt

Acid acetic 10% 5 giọt 5 giọt

NaCl bão hòa 2 giọt

Đun sôi cách thủy cả 5 ống

4 Hiện tượng và giải thích

Hiện tượng :

- Ống 1: Xuất hiện kết tủa trắng

 Giải thích: Do có sự tác dụng với nhiệt độ, mạch protein bị giãn nở, các liên kết thứ

cấp bị phá vỡ, từ đó protein vón cục không theo quy luật nào tạo thành kết tủa

- Ống 2: Xuất hiện kết tủa trắng đục

 Giải thích: Khi cho acid acetic 1% sẽ tạo môi trường acid yếu Nhóm -COO- bị ức

chế sự phân ly nên tiểu phân tử protein mất điện tích, pH của môi trường gần đạt

trạng thái đẳng điện

- Ống 3: Không xuất hiện kết tủa

 Giải thích: Do tính háo nước của acid và môi trường acid mạnh có nhiều ion H+ nên

protein bị khử nước Các nhóm -COO- được trung hoà còn các nhóm NH3+ không

được trung hoà Phân tử protein vẫn còn tích điện dương Do đó không tạo kết tủa

- Ống 4: Xuất hiện kết tủa trắng đục

 Giải thích: Khi cho acid acetic 1% và NaCl bão hoà tác dụng sẽ tạo nên môi trường

trung hoà về điện, từ đó tạo kết tủa

- Ống 5: Không xuất hiện kết tủa

 Giải thích: Do NaOH gây môi trường kiềm, nhóm NH3+ được trung hoà Vì vậy khi

đun sôi điện tử âm của tiểu phân tử protein vẫn còn Protein tích điện âm không tạo

tủa

5 Kết luận

Ý nghĩa: Khảo sát sự biến tính protein bởi nhiệt và môi trường acid yếu, kiềm mạnh hoặc

muối của kim loại nặng

- Phần lớn protein bị đông tụ khi đun trong môi trường trung tính hay acid yếu

- Trong môi trường kiềm mạnh hay acid mạnh, protein còn tích điện nên không tạo tủa

- Protein dễ dàng tạo tủa khi pH môi trường đạt điểm đẳng điện

THÍ NGHIỆM 4: Phản ứng tủa bởi acid mạnh và không đun nóng

1 Nguyên tắc

Các acid vô cơ mạnh ( HNO3, H2SO4, HCl,… ) và các acid hữu cơ ( acid trichloracetic,

acid sulfosalicylic ) có tác dụng làm biến tính và kết tủa đại đa số protein

2 Hoá chất

- Acid H2SO4 đậm đặc

- Dung dịch TCA 3%

- Dung dịch lòng trắng trứng

3 Tiến hành

- Acid vô cơ: cho vào ống nghiệm 2 ml dung dịch lòng trắng trứng, để nghiêng ống

nghiệm 45o, nhỏ từ từ lên thành ống nghiệm cho chảy xuống 1ml H2SO4 đậm đặc Quan

sát hiện tượng ở mặt phân cách 2 dung dịch (ống 1)

- Acid hữu cơ: cho vào ống nghiệm

+ Dung dịch lòng trắng trứng 2ml

+ Dung dịch TCA 3% 1ml

Trộn đều, quan sát dung dịch (ống 2)

4 Hiện tượng, giải thích

- Ống 1: Xuất hiện kết tủa trắng tại mặt phân cách 2 dung dịch.

 Giải thích: Khi thêm acid nitric đặc vào lòng trắng trứng thấy có kết tủa màu vàng

xuất hiện là sản phẩm polynitro thu được tron quá trình notro hóa nhân thơm trong

protein

Ống 2 Ống 1

- Ống 2: Xuất hiện kết tủa trắng.

 Giải thích: Acid vô cơ vào dung dịch lòng trắng trứng sẽ tạo nên môi trường acid yếu,

có khả năng gây tủa

5 Kết luận:

Ý nghĩa: Khảo sát sự biến tính protein bởi acid mạnh ( vô cơ và hữu cơ )

THÍ NGHIỆM 5: Tìm protein trong nước tiểu

1 Nguyên tắc

 Phương pháp đông kết: tủa protein bằng dung dịch acid yếu + đun nóng.

 Phương pháp Heller: tủa protein bằng acid mạnh và không đun

2 Hoá chất

- Acid acetic 1%

- Acid H2SO4 đậm đặc

- Thuốc thử Molish (dung dịch Napthol)

3 Tiến hành

 Ống 1: Cho vào ống nghiệm 5ml thuốc thử Molish, đem đun sôi trong 2 phút Sau đó

cho thêm vào khoảng 3 – 5 giọt acid acetic 1%

 Ống 2: Cho vào ống nghiệm 2ml thuốc thử Molish Sau đó nghiên ống nghiệm và cho

vào từ từ 1ml H2SO4 đậm đặc Quan sát ở mặt phân cách 2 chất lỏng này

4 Hiện tượng và giải thích

Hiện tượng: Ở cả 2 ống đều không cho thấy sự xuất hiện của kết tủa.

 Giải thích: Trong thuốc thử Molish vốn không chứa protein nên không xảy ra hiện

tượng tủa protein

Ống 2 Ống 1