Báo cáo thực hành hoá sinh hoá học, chuyển hoá protid và ứng dụng thí nghiệm 1 phản ứng ninhydrin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH BỘ MƠN HỐ SINH - BÁO CÁO THỰC HÀNH HOÁ SINH Giảng viên: Huỳnh Tấn Thành Thành viên: Trương Ngọc Gia Linh – 116421027 – DA21RHM Lưu Thị Ngọc Nhi – 116421012 – DA21RHM Trương Quang Trung – 116421037 – DA21RHM HOÁ HỌC, CHUYỂN HỐ PROTID VÀ ỨNG DỤNG THÍ NGHIỆM 1: Phản ứng Ninhydrin Nguyên tắc - Dung dịch protein , peptid acid amin đung nóng với Ninhydrin 0.2% cho màu xanh tím - Ninhydrin chất oxy hóa nên tạo nên phản ứng carboxyl oxy hóa acid amin với H2O, để cuối cho CO2, NH3 aldehyde ngắn carbon so với acid amin gốc Ninhydrin bị khử Sau đó, Ninhydrin bị khử lại tác dụng lại với NH3 vừa phóng thích kết hợp với phân tử Ninhydrin thứ hai, tạo thành sản phẩm ngưng kết có màu xanh tím Hố chất - Dung dịch Glycine - Dung dịch lòng trắng trứng - Dung dịch Ninhydrin 0,2% Tiến hành - Lấy ống nghiệm, đánh số 2, cho vào : + Ống : 1ml dung dịch Glycine + Ống : 1ml dung dịch lòng trắng trứng - Thêm vào ống 1ml dung dịch thuốc thử Ninhydrin 0.2% - Đun nóng ống nghiệm lửa đèn cồn ( ~ 30 giây ) Hiện tượng giải thích Ống Ống Hiện tượng : - Ống : Xuất màu xanh tím - Ống : Khơng xuất màu  Giải thích: Sự xuất màu xanh tím phản ứng Ninhydrin acid amin Acid amin tác dụng với Ninhydrin nhiệt độ cao bị dezamin hóa, oxy hóa decacboxy hóa tạo thành CO2 , NH3 , andehit tương ứng ( ngắn cacbon so với acid amin gốc ) phản ứng Ninhydrin bị khử Phân tử ninhydrin bị khử tác dụng với NH3 vừa tạo thành Một phân tử Ninhydrin chưa bị khử cho phức hợp màu đỏ tía Phức hợp tạo thành màu đỏ tía hay màu xanh tím phụ thuộc vào lượng NH3 tạo thành Kết luận Ý nghĩa: Đây phản ứng chung cho protid acid amin tự Phản ứng cho phép nhận dạng tất acid amin có nhóm NH2 COOH tự Ngoại trừ prolin OH prolin tác dụng với Ninhydrin tạo thành màu vàng THÍ NGHIỆM 2: Phản ứng Biuret Nguyên tắc - Protein tác dụng với Cu2+ mơi trường kiềm tạo phức chất màu tím hồng, phản ứng xảy liên kết peptid - Sở dĩ gọi phản ứng Biuret chất Biuret ( có nhóm CO-NH , giống liên kết peptid ) cho phản ứng tương tự, tạo phức hợp có màu giống protein Sự tạo thành Biuret: Hoá chất - Dung dịch CuSO4 - Dung dịch NaOH 40% - Dung dịch lòng trắng trứng Tiến hành Cho vào ống nghiệm chất sau: + giọt dung dịch CuSO4 + 0,5 ml dung dịch NaOH 40% + ml dung dịch lòng trắng trứng Lắc Hiện tượng giải thích Hiện tượng: có xuất màu tím  Giải thích: Sự xuất màu tím dung dịch protein ( lịng trắng trứng ) có liên kết peptide tác dụng với Cu2+ môi trường kiềm tạo phức chất màu tím Kết luận Ý nghĩa: Màu phản ứng phụ thuộc vào lượng đồng (Cu) số lượng liên kết peptide Phản ứng dùng để định lượng protein xác nhận liên kết peptide THÍ NGHIỆM 3: Phản ứng tủa protein nhiệt với mơi trường acid yếu Ngun tắc - Protein hịa tan nước hình thành dung dịch keo, tiểu phân protein tích điện dấu mang lớp áo nước ( hydrat hóa ) Nhờ tích điện dấu nên tiểu phân protein đẩy nhờ có lớp áo nước nên chúng ngăn cách nhau, dung dịch keo protein tương đối bền vững - Nếu làm yếu tố tiểu phân protein chuyển động gặp nhau, dính vào tạo thành hạt to kết tủa  Làm protein cách: + Thêm chất điện giải NaCl, (NH4)2SO4,… + Hoặc đưa pH môi trường chứa protein pHi đẳng điện protein Các tiểu phân protein điện tích cịn lớp áo nước dễ bị kết tủa làm lớp áo nước protein kết tủa  Làm lớp áo nước protein + Thêm chất khử vào mơi trường chứa protein ( ví dụ : alcohol, aceton, (NH4)2SO4,…) + Hoặc làm biến tính protein cách đun sôi, thêm acid hay kiềm mạnh muối kim loại nặng Hố chất - Dung dịch lịng trắng trứng - Dung dịch Acid acetic 1% - Dung dịch Acid acetic 10% - Dung dịch NaCl bão hoà - Dung dịch NaOH 10% Tiến hành Dung dịch Ống Ống Ống Ống Ống Lịng trắng trứng thẩm tích ml Acid acetic 1% 1ml 1ml giọt giọt 1ml giọt Acid acetic 10% NaCl bão hòa giọt NaOH 10% giọt Đun sôi cách thủy ống Hiện tượng giải thích Hiện tượng : - 1ml Ống 1: Xuất kết tủa trắng  Giải thích: Do có tác dụng với nhiệt độ, mạch protein bị giãn nở, liên kết thứ cấp bị phá vỡ, từ protein vón cục khơng theo quy luật tạo thành kết tủa - Ống 2: Xuất kết tủa trắng đục  Giải thích: Khi cho acid acetic 1% tạo mơi trường acid yếu Nhóm -COO- bị ức chế phân ly nên tiểu phân tử protein điện tích, pH mơi trường gần đạt trạng thái đẳng điện - Ống 3: Không xuất kết tủa  Giải thích: Do tính háo nước acid mơi trường acid mạnh có nhiều ion H+ nên protein bị khử nước Các nhóm -COO- trung hồ cịn nhóm NH3+ khơng trung hồ Phân tử protein cịn tích điện dương Do khơng tạo kết tủa - Ống 4: Xuất kết tủa trắng đục  Giải thích: Khi cho acid acetic 1% NaCl bão hồ tác dụng tạo nên mơi trường trung hồ điện, từ tạo kết tủa - Ống 5: Không xuất kết tủa  Giải thích: Do NaOH gây mơi trường kiềm, nhóm NH3+ trung hồ Vì đun sơi điện tử âm tiểu phân tử protein cịn Protein tích điện âm không tạo tủa Kết luận Ý nghĩa: Khảo sát biến tính protein nhiệt mơi trường acid yếu, kiềm mạnh muối kim loại nặng - Phần lớn protein bị đông tụ đun mơi trường trung tính hay acid yếu - Trong mơi trường kiềm mạnh hay acid mạnh, protein cịn tích điện nên không tạo tủa - Protein dễ dàng tạo tủa pH mơi trường đạt điểm đẳng điện THÍ NGHIỆM 4: Phản ứng tủa acid mạnh không đun nóng Ngun tắc Các acid vơ mạnh ( HNO3, H2SO4, HCl,… ) acid hữu ( acid trichloracetic, acid sulfosalicylic ) có tác dụng làm biến tính kết tủa đại đa số protein Hố chất - Acid H2SO4 đậm đặc - Dung dịch TCA 3% - Dung dịch lòng trắng trứng Tiến hành - Acid vô cơ: cho vào ống nghiệm ml dung dịch lòng trắng trứng, để nghiêng ống nghiệm 45o, nhỏ từ từ lên thành ống nghiệm cho chảy xuống 1ml H2SO4 đậm đặc Quan sát tượng mặt phân cách dung dịch (ống 1) - Acid hữu cơ: cho vào ống nghiệm + Dung dịch lòng trắng trứng 2ml + Dung dịch TCA 3% 1ml Trộn đều, quan sát dung dịch (ống 2) Hiện tượng, giải thích Ống Ống - Ống 1: Xuất kết tủa trắng mặt phân cách dung dịch  Giải thích: Khi thêm acid nitric đặc vào lịng trắng trứng thấy có kết tủa màu vàng xuất sản phẩm polynitro thu tron trình notro hóa nhân thơm protein - Ống 2: Xuất kết tủa trắng  Giải thích: Acid vơ vào dung dịch lịng trắng trứng tạo nên mơi trường acid yếu, có khả gây tủa Kết luận: Ý nghĩa: Khảo sát biến tính protein acid mạnh ( vơ hữu ) THÍ NGHIỆM 5: Tìm protein nước tiểu Nguyên tắc  Phương pháp đông kết: tủa protein dung dịch acid yếu + đun nóng  Phương pháp Heller: tủa protein acid mạnh khơng đun Hố chất - Acid acetic 1% - Acid H2SO4 đậm đặc - Thuốc thử Molish (dung dịch Napthol) Tiến hành  Ống 1: Cho vào ống nghiệm 5ml thuốc thử Molish, đem đun sơi phút Sau cho thêm vào khoảng – giọt acid acetic 1%  Ống 2: Cho vào ống nghiệm 2ml thuốc thử Molish Sau nghiên ống nghiệm cho vào từ từ 1ml H2SO4 đậm đặc Quan sát mặt phân cách chất lỏng Hiện tượng giải thích Ống Ống Hiện tượng: Ở ống không cho thấy xuất kết tủa  Giải thích: Trong thuốc thử Molish vốn khơng chứa protein nên không xảy tượng tủa protein  ...HỐ HỌC, CHUYỂN HỐ PROTID VÀ ỨNG DỤNG THÍ NGHIỆM 1: Phản ứng Ninhydrin Nguyên tắc - Dung dịch protein , peptid acid amin đung nóng với Ninhydrin 0.2% cho màu xanh tím - Ninhydrin chất... prolin OH prolin tác dụng với Ninhydrin tạo thành màu vàng THÍ NGHIỆM 2: Phản ứng Biuret Nguyên tắc - Protein tác dụng với Cu2+ mơi trường kiềm tạo phức chất màu tím hồng, phản ứng xảy liên kết... decacboxy hóa tạo thành CO2 , NH3 , andehit tương ứng ( ngắn cacbon so với acid amin gốc ) phản ứng Ninhydrin bị khử Phân tử ninhydrin bị khử tác dụng với NH3 vừa tạo thành Một phân tử Ninhydrin chưa