Thực tập vi sinh vật học phần 2 đàm sao mai

Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 107 Bài 14 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC I NGUYÊN TẮC R O Tổng vi khuẩn hiếu khí tổng số loại vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí tồn mơi trường Trong q trình sinh trưởng phát triển, nhóm vi khuẩn cần oxy cho q trình hơ hấp hiếu khí để chuyển hóa hợp chất hữu thành lượng ATP cung cấp cho hoạt động chúng Các nhóm vi sinh vật hiếu khí tồn mơi trường nước chúng phân giải tích cực hợp chất hữu tạo thành sản phẩm cuối CO2 giải phóng ATP Tổng số vi khuẩn hiếu khí tiêu chí để đánh giá mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm thực phẩm Và tất loại thực phẩm, nước uống, phân tích chất lượng vi sinh vật, tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí bắt buộc phải phân tích Các tiêu chuẩn thực phẩm, nước uống ln có mức giới hạn cho tiêu chuẩn Ví dụ: theo tiêu chuẩn TCVN 7046 : 2002 giành cho sản phẩm thịt tươi, tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí là: 106 khuẩn lạc/1g thịt Nếu vượt giới hạn, thực phẩm xem khơng an tồn cho người sử dụng A IN IG Tổng số nhóm vi khuẩn hiếu khí mẫu thực phẩm xác định phương pháp nuôi cấy trải bề mặt thạch phương pháp tạo hộp đổ Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm đĩa petri cho phép xác định lượng vi sinh vật sống khả sinh trưởng mẫu ban đầu Phương pháp định lượng dựa nguyên tắc: vi sinh sống, môi trường dinh dưỡng, sau khoảng thời gian xác định phát triển hình thành nên khuẩn lạc L Tuy nhiên, để kết đếm xác nhất, số lượng khuẩn lạc đĩa petri phải giới hạn định Ví dụ, lượng mẫu cấy vào đĩa ml số lượng khuẩn lạc vi khuẩn đĩa phải giới hạn 25-250 khuẩn lạc, nấm mốc 30-50 khuẩn lạc Nếu số lượng vượt q giới hạn phải tiến hành pha lỗng chọn độ pha loãng lớn II DỤNG CỤ, MƠI TRƯỜNG VÀ HĨA CHẤT Dụng cụ STT Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Giá ống nghiệm Ống nghiệm ‫׎‬18 Bình tam giác 250 ml Cốc 100 ml Bình tia Đơn vị tính Số lượng Cái Cái Cái Cái Cái 1 Ghi Thực tập Vi sinh vật học 108 STT 10 11 12 13 14 15 16 Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Pipette ml Pipette 10 ml Que trải Đèn cồn Que cấy Dụng cụ dùng chung Nồi hấp cao áp Tủ cấy vô trùng Tủ sấy Máy dập mẫu Bút đếm khuẩn lạc Tủ ấm Đơn vị tính Số lượng Cái Cái Cái Cái Cái 1 1 Cái Cái Cái Cái Cái Cái 1 1 1 Ghi Mơi trường hố chất O - Mơi trường Plate count agar (PCA) R + Casein peptone: 5,0 g + Cao nấm men: 2,5 g + Agar: 15,0 g + Nước cất đủ 1000 ml IN IG + Dextrose: 1,0 g - Nước muối sinh lý 0,9% - Nước cất vô trùng L A Cân đầy đủ thành phần môi trường, phối trộn, điều chỉnh pH = 7,0 ± 0,2 Nấu sôi nhẹ cho tan agar Phân phối mơi trường vào bình tam giác Hấp tiệt trùng 121oC/20 phút, để ấm (45-50oC) phân phối vào đĩa petri - Cồn 96o Nguyên liệu khác - Nước mía - Thịt tươi - Túi nilon dập mẫu III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Lấy mẫu - Tùy theo loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu để nghiên cứu với số lượng khối lượng khác cho phù hợp Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 109 - Q trình lấy mẫu có u cầu sau: + Lấy mẫu có tính chất đại diện, lượng mẫu vừa đủ + Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng + Mẫu lấy xong, phải phân tích ngay, khơng để q 24 + Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu đồng thời phải ghi vào sổ đặc điểm mẫu nơi thu mẫu Pha loãng mẫu - Chuẩn bị số bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý 0,9% nước peptone 1,0% vô trùng, số ống nghiệm chứa ml nước muối nước peptone vô trùng số pipette ml vô trùng * Với mẫu dạng lỏng O - Hút ml mẫu nghiên cứu cho vào ống nghiệm có ml nước muối sinh lý vơ trùng Trộn dung dịch cách hút lên, thổi xuống - lần Ta độ pha loãng 1/10 hay 10-1 IG R - Tiếp tục hút ml ống nghiệm cho vào ống nghiệm có ml nước muối sinh lý vô trùng thứ Trộn dung dịch cách hút lên, thổi xuống - lần Ta độ pha loãng 1/100 hay 10-2 - Tiếp tục hút từ ống sang ống 3, từ ống sang ống ta có độ pha lỗng tương ứng 10-3, 10-4 L A IN Ống nuôi cấy ban đầu (ống gốc) Tỉ lệ pha loãng Độ pha loãng 10-1 101 10-2 102 10-3 103 10-4 104 10-5 105 Độ pha lỗng cuối Hình 14.1 Phương pháp pha lỗng bậc 10 dung dịch huyền phù (pha loãng thập phân) Thực tập Vi sinh vật học 110 * Với mẫu dạng đặc Chuẩn bị hai bình tam giác có dung tích 250 ml: - Bình chứa 90 ml nước muối sinh lý nước peptone 1,0% vơ trùng - Bình vơ trùng khơng chứa - Cho cồn vào cối chày sứ đốt lên để khử trùng Để nguội - Cân 10 g mẫu, cho vào cối chày sứ, nghiền nát mẫu đồng mẫu túi dập mẫu với máy dập mẫu - Dùng tồn nước bình để chuyển mẫu sang bình Lắc phút - Để lắng 30 giây tiếp tục pha loãng trường hợp mẫu trạng thái lỏng - Tùy theo ước đoán số lượng vi sinh vật mẫu mà pha lỗng nhiều hay - Sau có độ pha lỗng thích hợp tiến hành xác định số lượng vi sinh vật a) Nguyên tắc R O Xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc môi trường thạch (ISO 4833:1991) IG - Cấy thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng hộp petri b) Cách cấy mẫu A Cấy theo phương pháp tạo hộp đổ IN - Xác định số lượng tế bào cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời gian ni cấy khuẩn lạc kết phát triển tế bào L - Pha loãng dịch huyền phù nồng độ khác nhau: 10-3, 10-4 , 10-5 để cấy mẫu - Ghi vào nắp hộp petri có mơi trường thạch thơng tin: nồng độ pha lỗng, ngày cấy - Dùng pipette vơ trùng lấy ml dịch huyền phù cho vào đĩa petri (đã vô trùng) - Cho khoảng 15ml môi trường PCA nhiệt độ khoảng 45oC vào hộp petri Xoay chậm cho hỗn hợp trộn Để yên cho nguội Lật ngược cho vào tủ ấm Nuôi cấy 30oC 72 - Mỗi mẫu cấy ba nồng độ Mỗi nồng độ cấy ba hộp petri - Sau lấy kiểm tra kết Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 111 ml Dung dịch mẫu pha loãng 45oC PCA 10 -15 ml Đĩa petri vô trùng Lật ngược đĩa Lắc đĩa petri Để nguội Ủ 30oC/3 ngày R O Đếm số khuẩn lạc tính kết Hình 14.2 Quy trình tạo hộp đổ IG Phương pháp cấy bề mặt - Dịch huyền phù chuẩn bị tương tự phương pháp tạo hộp đổ IN - Môi trường PCA sau hấp tiệt trùng, làm nguội đến khoảng 50-60oC sau đổ vào đĩa petri vô trùng - Đĩa petri chứa môi trường làm khô bề mặt cách sấy tủ sấy nhiệt độ 35 C chuẩn bị trước ngày A o L - Dùng pipet vơ trùng hút xác 0,1 ml 0,3 ml nhỏ lên bề mặt môi trường đĩa petri - Trải dung dịch vi sinh vật lên bề mặt môi trường que trải tam giác thủy tinh - Các đĩa petri để nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô bề mặt Lật ngược cho vào tủ ấm Nuôi cấy 30oC 72 - Mỗi mẫu cấy ba nồng độ Mỗi nồng độ cấy ba hộp petri - Sau lấy kiểm tra kết Thực tập Vi sinh vật học 112 Hình 14.3 Phương pháp cấy trải bề mặt c) Cách đếm - Lấy bút chì kẻ hai đường vng góc đáy hộp petri đánh dấu thứ tự vùng I, II, III, IV - Đếm số lượng khuẩn lạc vùng Nhớ đánh dấu khuẩn lạc đếm O - Số lượng tế bào gram mẫu tính theo cơng thức sau đây: R N (CFU / ghayCFU / ml ) = ∑C (n1vd1 + + ni vd i ) IG với : IN N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn g hay ml mẫu (CFU: colony forming units); ni : số hộp petri cấy độ pha loãng thứ I; di: hệ số pha loãng tương ứng; v: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa L A C: tổng số khuẩn lạc đếm hộp petri chọn (có số khuẩn lạc nằm khoảng từ 25-250 khuẩn lạc/đĩa); Ví dụ: trường hợp phân tích g mẫu cụ thể nhận kết sau: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 Kết hộp petri 235 26 hộp petri 246 36 hộp petri 198 17 - Số khuẩn lạc có mẫu là: N= 235 + 246 + 198 + 26 + 36 660 = = 2.3x10 (CFU / ml ) −3 −4 0,033 3x1x10 + x1x10 Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 113 - Vậy số lượng khuẩn lạc có ml mẫu gam mẫu (CFU/g hay CFU/ml) 2.3x105 * Trong trường hợp số lượng khuẩn lạc có hai hộp petri nhỏ 15 ta tính sau: - Gọi m lượng khuẩn lạc trung bình có hai hộp petri - Lượng khuẩn lạc có mẫu lỏng là: NE = m/ml - Nếu mẫu đặc lượng khuẩn lạc có gam mẫu là: NE = mxd-k, với d hệ số pha loãng * Trong trường hợp số lượng khuẩn lạc hai hộp petri nhỏ tính sau: - Lượng khuẩn lạc có mẫu lỏng là: NE nhỏ 1/ml - Nếu mẫu đặc lượng khuẩn lạc có gam mẫu là: NE nhỏ 1xd-k, với d hệ số pha loãng Bút đếm khuẩn lạc A IN IG R O Chú ý: Độ pha lỗng thích hợp nồng độ cấy thạch đĩa cho số khuẩn lạc trung bình từ 50 - 150 với vi khuẩn, xạ khuẩn; 30 - 50 với nấm Bàn đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc tự động L Hình 14.4 Các loại dụng cụ đếm khuẩn lạc IV NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Khi tiến hành pha loãng mẫu, dung dịch phải hút thể tích yêu cầu - Đối với phương pháp tạo hộp đổ, môi trường nuôi cấy sau hấp tiệt trùng phải làm nguội đến 45-50oC bể ổn nhiệt trước đổ vào đĩa petri chứa dung dịch vi sinh vật - Các đĩa petri nuôi cấy vi sinh vật phải lật úp trước nuôi ủ để tránh khuẩn lạc bề mặt mọc loang - Trong q trình đếm khuẩn lạc, khơng mở hộp petri - Que trải thủy tinh dùng để trải dung dịch vi sinh vật khử trùng cách nhúng vào cồn 96o đốt, không hơ trực tiếp lửa đèn cồn Thực tập Vi sinh vật học 114 V BÁO CÁO THỰC TẬP - Trình bày phương pháp định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu phương pháp đếm khuẩn lạc - So sánh ưu nhược điểm phương pháp tạo hộp đổ phương pháp cấy trải bề mặt - Tính số CFU/ml mẫu nước ban đầu SƠ ĐỒ KIỂM NGHIỆM TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ Tiêu chuẩn áp dụng: ISO 4833: 2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizonrtal method for the enumeration of microorganisms Colony – count technique at 30oC Mẫu O Đồng mẫu Đồng 10 g mẫu 90 ml nước muối 0,85% IG R Pha loãng mẫu Cấy mẫu A IN Pha loãng mẫu thành nồng độ 10-1,10-2,10-3 Chọn ba nồng độ pha lỗng thích hợp L Phương pháp đổ đĩa Phương pháp cấy trải Cấy ml mẫu vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ cấy hai đĩa), đổ vào Cấy 0,1 ml mẫu vào môi trường thạch PCA, dùng que cấy dàn mẫu đĩa 12-15 ml PCA làm nguội 44 -47oC, mặt thạch, ủ 30oC/72giờ lắc đều, ủ 30oC/72giờ Tính kết Chọn đĩa có số khuẩn lạc khoảng 15 - 300/ đĩa để đếm Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 115 Bài 15 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) I NGUYÊN TẮC Từ coliform Blachstein sử dụng vào năm 1893 để nói vi khuẩn bacilli có đặc điểm hình thái giống E coli Coliform trực khuẩn, Gram (-), không sinh bào tử, hô hấp tùy tiện, có khả lên men lactose sinh acid sinh 37oC 24-48 Nhóm coliforms diện rộng rãi tự nhiên, ruột người, động vật Số lượng coliforms mẫu dùng để thị khả có mặt vi sinh vật gây bệnh khác, thị cho mức độ an toàn vệ sinh mơi trường hay sản phẩm Nhóm coliforms gồm bốn giống là: Escherichia với loài E coli; Citrobacter; Klebsiella Enterobacter Coliform chịu nhiệt coliform có khả lên men lactose sinh ủ 44 C/24 môi trường EC Coliform phân (Faecal Coliform hay E coli giả định) coliforms chịu nhiệt có khả sinh indole ủ 44.5oC 24 tryptone o O L A IN IG R E coli có mặt nhiều phân người động vật Trong phân tươi, đậm độ chúng đến 109/g Chúng tìm thấy nước cống rãnh, cơng đoạn xử lý tất nguồn nước đất vừa bị nhiễm phân từ người, động vật sản xuất nông nghiệp Gần người ta nghĩ đến E coli tồn chí phát triển nguồn nước vùng nhiệt đới đối tượng bị ô nhiễm phân Từ phân, coliform xâm nhiễm trực tiếp vào thực phẩm công đoạn chế biến, canh tác phân phối Hình 15.1 Cấu trúc nhóm coliforms Thực tập Vi sinh vật học 116 Nhóm coliform thực phẩm xác phương pháp MPN Phương pháp MPN (phương pháp có xác suất cao nhất, số tối khả) gọi phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ Đây phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn có mặt đơn vị thể tích mẫu hay nói cách khác phương pháp MPN dựa nguyên tắc xác suất thống kê phân bố vi sinh vật độ pha loãng khác mẫu Đây phương pháp định lượng dựa kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha loãng khác Thông thường, việc định lượng thực lặp lại ba lần ba độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng ống nghiệm Các độ pha loãng chọn lựa cho lần lặp lại có số lần dương tính có số lần âm tính Từ kết thí nghiệm định tính, dựa vào bảng Mac Crady để suy mật độ ước đoán số lượng vi sinh vật có mẫu, trình bày dạng số MPN/100 ml hay số MPN/g mẫu Độ xác phương pháp MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại cao độ xác trị số MPN lớn O Có hai hệ thống MPN: hệ thống ống hệ thống 15 ống R Phương pháp MPN có đặc điểm: IG - Vi sinh vật mục tiêu phải có biểu đặc trưng môi trường nuôi cấy + Sự tạo hơi: Coliform … IN + Sự đổi màu: S aureus - Cho phép định lượng mật độ vi sinh vật thấp thể tích mẫu lớn Dụng cụ STT 10 11 Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Giá ống nghiệm Ống nghiệm ‫׎‬18 Bình tam giác 250 ml Cốc 100 ml Bình tia Pipette ml Pipette 10 ml Que trải Đèn cồn Ống Durham Que cấy L A II DỤNG CỤ, MƠI TRƯỜNG VÀ HĨA CHẤT Đơn vị tính Số lượng Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái ống Cái 15 1 1 Thực tập Vi sinh vật học 178 Cấy ủ mẫu - Chọn hai nồng độ pha lỗng thích hợp Cho 10 ml dung dịch pha loãng (mỗi nồng độ ống) vào ống nghiệm có chứa mơi trường Wilson Blair cải tiến làm nguội 45oC Cho thêm ml dung dịch Na2SO3 giọt phèn sắt 5% Tiếp tục làm sau: - Lắc - Đun cách thủy 75oC, 15 phút - Làm đông nhanh - Ủ 37oC bình kị khí thời gian 18-24 Đọc kết Đếm tất khuẩn lạc đặc trưng Clostridium perfringens (trịn, đen, có đường kính 3mm) Tính tốn kết O Số khuẩn lạc g mẫu trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ có hai ống nghiệm ni cấy (cùng nồng độ) nhân với hệ số pha loãng tương ứng chia cho 10 R IV NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Phèn sắt Na thiosulfat cần pha riêng rẽ bổ sung sau hấp tiệt trùng IG IN - Chủng Clostridium perfringens loại vi sinh vật nguy hiểm, cẩn thận trình thực hành Mang trang găng tay để tránh bị xâm nhiễm Các dung dịch vi sinh vật, dụng cụ môi trường nuôi cấy cần hấp tiệt trùng cẩn thận sau thí nghiệm L V BÁO CÁO THỰC TẬP A - Để kết phân tích xác, nên sử dụng môi trường tổng hợp dạng đông khô cho tất bước thử nghiệm - Trình bày đặc tính sinh lý gây bệnh Clostridium perfringens - Trình bày quy trình phân tích Clostridium perfringens thực phẩm - Giải thích chế thử nghiệm sinh hóa sử dụng q trình phân tích xác định Clostridium perfringens QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM Tiêu chuẩn sử dụng: ISO 7937: 2004 Microbiology of food and animal feeding stuffsHorizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens - Colony count tecchnique Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 179 Mẫu Đồng mẫu Đồng 10g mẫu 90ml nước muối 0,85% Pha loãng mẫu Pha loãng mẫu thành nồng độ 10-2,10-3,10-4 Cấy mẫu Chọn nồng độ pha lỗng thích hợp cấy 10ml mẫu vào hai ống môi trường thạch Wilson Blair đun chảy làm nguội đến 50oC, bổ sung 0,5 ml Na2SO3 5% 0,25 ml FeSO4 5% Lắc trộn IG R O Đun cách thủy 75oC/15 phút Làm đông thạch nhanh IN Cho 1ml parafin lỏng vào ống thạch Ủ 37oC/18-24 L A Khẳng định Chọn khuẩn lạc điển hình (trịn, lồi, bờ đều, đen nhẵn, đường kính 2-4 mm) Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào mơi trường Motility Nitrate Ủ điều kiện kị khí, 37oC/18-24 Motility Nitrate Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào mơi trường Lactose gelatine Ủ điều kiện kị khí, 37oC/18-24 Lactose Gelatin Đặt ống nghiệm 5oC/1giờ Thực tập Vi sinh vật học 180 Bài 25 PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) I NGUYÊN TẮC O Các phương pháp truyền thống phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm bao gồm bước nuôi cấy môi trường chọn lọc hàng loạt thử nghiệm hóa sinh để khẳng định có mặt lồi gây bệnh định, thường kéo dài vài ngày đến vài tuần Trong năm vừa qua, phương pháp nhanh hơn, chuyên biệt nhằm phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm dựa nguyên tắc sinh học phân tử miễn dịch học phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA… thiết lập PCR (Polymerase Chain Reaction) kỹ thuật ứng dụng phổ biến khắc phục nhược điểm phương pháp truyền thống nhờ khả phát nhanh đặc hiệu mầm bệnh Các nghiên cứu giới tập trung vào khẳng định khả sử dụng PCR phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vệ sinh thực phẩm IN IG R PCR kỹ thuật nhằm tạo lượng lớn DNA mục tiêu ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt Kỹ thuật nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1985 Sự phân tích sản phẩm PCR điện di cho phép phát vi sinh vật mục tiêu dự so sánh với trình tự DNA đặc trưng vi sinh vật chuẩn Xét nghiệm kỹ thuật PCR thường có kết độ xác cao, tính đặc hiệu lớn Tuy nhiên, kết tùy thuộc trình độ kỹ thuật viên, phương tiện máy móc làm việc việc quản lý chất lượng Dụng cụ STT 10 Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Giá ống nghiệm Ống nghiệm ‫׎‬18 Bình tam giác 250 ml Cốc 100 ml Bình tia Pipette ml Pipette 10 ml Micropipette 100-1000 μl Đầu tuýp 1000 μl Ống Eppendorf 0,2; 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR L A II DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HĨA CHẤT Đơn vị tính Số lượng Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái 15 1 1 10 Cái Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm STT 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Số lượng Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái 1 1 1 1 Cái Cái Cái Cái Cái IG 23 Đơn vị tính R 22 Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Dụng cụ dùng chung Nồi hấp cao áp Tủ cấy vơ trùng Tủ sấy Máy dập mẫu Bình ủ kị khí Bếp đun cách thủy Bút đếm khuẩn lạc Máy PCR Máy ly tâm dùng cho ống Eppendorf 1,5 ml Máy vortex Thiết bị điện di ngang nguồn điện di có điện hoạt động từ 80 đến 150 volt Hộp đèn soi UV có kính lọc 302 mm Bộ chụp ảnh đèn UV O 21 181 Mơi trường, hóa chất a) Hóa chất IN A * Mồi: Gồm hai mồi invA1 invA2 thiết lập cách 520 bp gen invA có vai trị q trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật người Trình tự hai mồi sau: invA1: 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3' L invA2: 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3' Nồng độ mồi sử dụng phân tích pha lỗng thành pM đệm TE Ðệm TE có thành phần sau: 10 mM Tris-HCl (pH = 8), mM EDTA * Hỗn hợp dùng khuếch đại PCR 1,1x - Taq polymerase: 0,025 U/ml (1,25 U/50 ml) - Tris - HCl (pH = 8,8 nhiệt độ 25oC): 75 mM - Sunphat amon (NH4)2ư SO4: 20 nM - Tween 20: 0,01% (v/v) - dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 200 mM (mỗi loại) - Magiê clorua (MgCl2) 1,5 mM Thực tập Vi sinh vật học 182 - Tất thành phần pha chế nước cất lần bảo quản nhiệt độ C tháng Có thể bảo quản nhiệt độ - 20oC năm Không nên rã đông tái đông dung dịch pha chế nhiều lần o * Thang ADN Nên sử dụng thang đo phù hợp ước lượng đoạn khuếch đại 520 bp Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp biết trước làm thang đo phương pháp * Agarose Sử dụng kỹ thuật loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ 1000 bp * Ðệm điện di TAE 1x - Tris: 4,84 g - Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0: ml O - Axit axetic băng: 1,14 ml R - Nước cất cho đủ: 1000 ml * Ðệm tải mẫu 6x - Xanh bromphenon: 0,25 % - Na2EDTA: 20 mM L A - Tris: 200 mM IN - Glyxerol: 30 % IG Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), sử dụng pha loãng với nước thành dung dịch 1x Các thành phần pha nước cất, bảo quản nhiệt độ 4oC * Thuốc nhuộm AND: dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/ml b) Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Dung dịch đệm peptone - Peptone (C5H10O5): 10,0 g - Natri clorua (NaCl): 5,0 g - Dinatri hyđro phosphat (Na2HPO4): 3,6 g - Kali dihydro phosphat (KH2PO4): 1,5 g - Nước cất: 1000 ml Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 183 Hòa tan thành phần nước cất, đun tan, phân phối vào bình chứa phù hợp Hấp khử trùng nhiệt độ 121oC 15 phút pH sau khử trùng 7,0 ± 0,2 25oC Nguyên liệu khác Mẫu thức ăn đường phố, thịt gà tươi sống, hải sản, trứng sản phẩm trứng, rau xà lách, thức ăn gia súc nhiễm vi sinh vật tự nhiên III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Lấy mẫu Cân xác 25 g mẫu (hoặc khối lượng xác tùy theo yêu cầu) cho vào bình tam giác bao PE vơ trùng Tăng sinh R O Nhằm làm tăng số lượng Salmonella mẫu, tế bào bị suy yếu hay tổn thương phục hồi phát triển Giai đoạn tiến hành môi trường không chọn lọc nguyên tắc phần khối lượng mẫu bổ sung phần khối lượng môi trường tăng sinh Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch peptone đệm Ủ mẫu có mơi trường tăng sinh nhiệt độ 37,0oC ± 1,0oC khoảng 18 IG Xử lý mẫu giải phóng ADN IN Giai đoạn nhằm thu nhận sinh khối sau tăng sinh, rửa môi trường sau nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng ADN Cách xử lý sau: L A - Lắc canh khuẩn tăng sinh Hút 0,5 ml vào ống eppendorf tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút phút loại bỏ phần môi trường lỏng bên Rửa sinh khối bên với nước cất vô trùng tiếp tục ly tâm với chế độ để loại bỏ phần nước - Huyền phù sinh khối ống với 0,5 ml nước cất vô trùng Ðun sôi cách thủy 10 phút Ly tâm huyền dịch sau đun với tốc độ 10 000 vòng/phút phút để lắng mảnh vỡ tế bào xuống đáy Phần dịch bên coi khuôn ADN để tiến hành phản ứng khuếch đại Khuếch đại Giai đoạn nhằm làm tăng số lượng đoạn ADN đích máy luân nhiệt (thermocycler) hai mồi đặc trưng Quá trình khuếch đại tiến hành khoảng 30 chu kỳ - Chuẩn bị ống khuếch đại Thực tập Vi sinh vật học 184 Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào ống nghiệm PCR tích 0,2 0,5 ml, thêm vào ml mồi invA1 invA2 có nồng độ pM ml mẫu khn ADN Tổng thể tích ống khuếch đại 50 ml Ðối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu dịch ADN Salmonella chuẩn biết Ðối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu nước cất vơ trùng - Chương trình khuếch đại Các ống khuếch đại đặt vào máy luân nhiệt Chương trình khuếch đại sau: trì nhiệt độ 95oC phút để làm biến tính hồn tồn sợi ADN mẫu Tiếp theo 35 chu kỳ, chu kỳ có ba bước sau: 95oC/60 giây; 54oC/45 giây 72oC/60 giây Sau kết thúc 35 chu kỳ, mẫu giữ nhiệt độ 72oC 10 phút, sau giữ ổn định nhiệt độ 20oC điện di Ðiện di sản phẩm khuếch đại O - Chuẩn bị gel điện di agarose 1% - Chuẩn bị dịch điện di IG R Gel agarose % pha đệm TAE 1x đun chảy hoàn toàn đổ vào khay điện di có sẵn lược để tạo giếng Gel điện di phải có độ dày khoảng - mm Gel sau chuẩn bị ngâm chìm hồn toàn đệm TAE Mẫu sau khuếch đại nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x trộn thật IN - Ðiện di A Một giếng gel điện di sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương Nạp 10 ml dịch điện di chuẩn bị vào gel agarose Tiến hành điện di 60 phút hiệu điện 100 vôn - Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu L Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại Pha dung dịch nhuộm ADN sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào khay chứa có miệng rộng gel điện di - Nhuộm gel Ngâm gel điện di vào dung dịch nhuộm 10 phút Rửa gel nước khoảng - phút để loại bỏ phần etyl bromua dư - Quan sát, chụp hình Cho gel nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn quan sát vạch sáng đỏ ADN xuất gel Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết Viện Cơng nghệ sinh học & Thực phẩm 185 Ðọc giải thích kết Kết phân tích xem xét kết luận mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại ADN với kích thước 520 bp mẫu đối chứng âm khơng có sản phẩm Mẫu kết luạn dương tính Salmonella có sản phẩm khuếch đại 520 bp gel Mẫu kết luận âm tính khơng có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác 520 bp IV NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Mang trang găng tay cao su để tránh làm tạp nhiễm sản phẩm PCR - Khơng điều chỉnh ngồi khoảng thể tích cho phép hút sử dụng micropipette - Tuân thủ bước thao tác chuẩn bị phản ứng PCR vận hành máy luân nhiệt PCR R O - Phải dùng kính bảo vệ mắt quan sát sản phẩm điện di gel agarose đèn UV V BÁO CÁO THỰC TẬP IG - Trình bày nguyên tắc phương pháp PCR xác định vi sinh vật thực phẩm - Trình bày vai trị mồi xi, ngược phản ứng PCR IN - Giải thích phản ứng PCR nên tiến hành khoảng 35 chu kỳ? - Trình bày nguyên tắc phương pháp đọc điện di sản phẩm PCR L A - Trình bày kết xác định Salmonella spp mẫu thực phẩm ban đầu phương pháp PCR Thực tập Vi sinh vật học 186 Bài 26 XÁC ĐỊNH NHANH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM BẰNG HỆ THỐNG MULTITEST API 20E I NGUYÊN TẮC Những đặc điểm Gram, khả di động, q trình ni cấy, hệ thống enzyme, đặc tính sinh hóa… vi sinh vật thường sử dụng công cụ để xác định vi sinh vật Tuy nhiên, để có đặc điểm cần sử dụng lượng lớn mơi trường hóa chất, ống nghiệm, đĩa petri môi trường nuôi cấy nhiều thời gian nuôi ủ Để làm giảm bớt yếu tố này, có số hệ thống multitest (API 20E, Enterotube II…) sử dụng Những multitest cho phép trình xác định số lượng lớn đối tượng vi sinh vật quan trọng với thời gian ngắn L A IN IG R O Multites API 20E hệ thống chuẩn gồm 22 test sinh hóa dùng để xác định loại vi khuẩn Gram âm thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae số nhóm vi khuẩn khác Tổng cộng có 127 taxa xác định hệ thống Hệ thống API 20E áp dụng phổ biến cho đối tượng vi khuẩn như: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Shigella dysenteria, Salmonella typhi, Yersinia pestis Hình 26.1 Hệ thống API 20E cupule giếng Hình 26.2 Cấu trúc giếng vỉ API Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 187 Các test sinh hóa hệ thống API 20E môi trường nuôi cấy kiểm tra chứa dải giếng nhỏ bảng nhựa Phía giếng có phần khuyết gọi cupule Mơi trường dạng đông khô làm ẩm cách bổ sung dịch huyền phù vi sinh vật nước muối sinh lý vào giếng sử dụng Sau gieo cấy vi sinh vật, dải giếng môi trường ủ 35-37oC thời gian 18-24 cho vi sinh vật hoạt động biến đổi chất Kết thử nghiệm đọc dựa vào thay đổi màu môi trường giếng dựa vào thay đổi màu bổ sung thuốc thử Các thử nghiệm âm tính hay dương tính cho điểm theo hướng dẫn Mỗi nhóm thử nghiệm tính điểm Có số mã nhóm thử nghiệm Q trình xác định vi sinh vật thực thông qua việc tra cứu mã vào hệ thống mã API 20E Profile Recognition hay The API 20E Profile Index Booklet II DỤNG CỤ, MƠI TRƯỜNG VÀ HĨA CHấT Dụng cụ STT - Dải hệ thống API 20E bioMérieux - Khay ủ gói bảo quản - Nước muối sinh lý 0,85% - Dung dịch McFarland No (BaSO4) - Thuốc thử Kovac Số lượng Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái 15 1 1 1 L Môi trường hóa chất Đơn vị tính A IN IG R 12 13 14 15 16 O 10 11 Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Giá ống nghiệm Ống nghiệm ‫׎‬18 Bình tam giác 250 ml Cốc 100 ml Bình tia Pipette ml Pipette Pasteur Micropipette 100-1000 μl Đầu tuýp 1000 μl Que cấy vòng Đèn cồn Dụng cụ dùng chung Nồi hấp cao áp Tủ cấy vô trùng Tủ sấy Máy dập mẫu Tủ ấm Cái Cái Cái Cái Cái 1 1 Thực tập Vi sinh vật học 188 - Môi trường TSA - Dầu khống vơ trùng - Thuốc thử nitrite - Bột kẽm - H2O2 1,5% - Thuốc thử Barritt A (α-napthol) B (KOH 40%) - Thuốc thử oxidase test Những nguyên vật liệu khác - Giấy lọc Whatman số - Sách API 20E Quick Index Booklet III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM O Gieo cấy vi sinh vật IG R - Dùng que cấy vịng vơ trùng lấy sinh khối vi khuẩn từ khuẩn lạc đặc trưng vi sinh vật cần xác định đĩa petri Trải lượng sinh khối thành vùng nhỏ giấy lọc Thêm vài giọt thuốc thử lên vết bôi vi khuẩn Quan sát thay đổi màu giấy lọc chỗ nhỏ thuốc thử để xác định kết thử nghiệm oxydase IN - Tiếp tục chuyển vòng que cấy đầy vi khuẩn vào ống nghiệm có ml nước muối sinh lý vơ trùng Lắc ống nghiệm để tạo dịch huyền phù So sánh độ đục huyền phù với dung dịch McFarland No (BaSO4) Có thể thêm sinh khối vi khuẩn cần - Lấy vỉ nhựa API khỏi túi gói, đặt vào khay ủ L A - Dán nhãn với thông tin tên người thực hiện, ngày thực lên khay ủ Hút 5ml nước cất vô trùng nhỏ vào đáy khay ủ để giữ ẩm cho vỉ test trình ủ - Lắc ml dịch huyền phù vi khuẩn Dùng pipette hút dịch huyền phù vào nhỏ vào giếng khay sau: + Nghiêng khay ủ đựng vỉ API, đưa đầu pipette tì vào cạnh cupule Nhỏ đầy dịch vào giếng ONPG, TDA, IND, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA + Nhỏ lượng nhỏ dịch huyền phù vào giếng ADH, LDC, ODC, H2S, URE (những giếng có tên test vỉ gạch dưới) + Nhỏ dịch huyền phù đầy phần giếng cupule giếng CIT, VP GEL (những giếng có tên test vỉ đóng khung) - Sau nhỏ dịch huyền phù, giếng ADH, LDC, ODC, H2S, URE nhỏ đầy phần cupule dầu khống vơ trùng để tạo điều kiện kị khí Viện Cơng nghệ sinh học & Thực phẩm 189 - Đậy nắp khay ủ ủ tủ ấm nhiệt độ 35oC thời gian 18-24 Nếu không đọc kịp kết thời gian sau 24 ủ, khay ủ với vỉ API giữ tủ lạnh nhiệt độ từ 2-8oC đọc kết - Cấy ria dịch huyền phù vi khuẩn lên đĩa petri môi trường TSA để kiểm tra độ dịch huyền phù Đọc kết - Sau thời gian ủ 18-24 giờ, ghi nhận kết (dựa vào biến đổi màu) tất thử nghiệm không cần bổ sung thuốc thử (không đọc kết thử nghiệm TDA, VIP IND) Ghi kết dương tính dấu (+) kết âm dấu (-) sau 24 vào bảng sau: Bảng 16.1 Bảng ghi nhận kết thử nghiệm hệ thống API 20E R O IN IG - Nếu thử nghiệm GLU âm tính (màu xanh dương hay xanh lục), không cần thêm thuốc thử Thử nghiệm glucose âm tính biểu thị vi khuẩn phân tích khơng thuộc nhóm Enterobacteriaceae Nếu thử nghiệm GLU dương tính (có màu vàng bọt khí), thêm thuốc thử nitrite A B vào giếng A Trong tất thử nghiệm, đọc kết sau nhỏ thuốc thử vào chờ khoảng thời gian phù hợp Ghi nhận kết thử nghiệm theo bảng sau nhỏ thuốc thử vào giếng sau: L - Nhỏ giọt ferric chloride 10% vào giếng TDA Đọc kết - Nhỏ giọt loại thuốc thử Barritt’s A B vào giếng VP Nên nhỏ Barritt’B trước Đọc kết sau 10 phút - Nhỏ giọt thuốc thử Kovac vào giếng IND Đọc kết sau phút - Kiểm tra hình thành bọt khí giếng GLU (âm tính dương tính) Nếu có bọt khí chứng tỏ có khử nitrate tạo thành khí nitơ - Nhỏ giọt loại thuốc thử nitrite vào giếng GLU Đọc kết sau 2-3 phút Nếu kết âm tính, thêm bột kẽm vào giếng Đọc kết sau 10 phút Nếu xuất màu hồng cam, khử nitrat khơng xảy (thử nghiệm âm tính) Nếu giữ ngun màu vàng, có hình thành khí nitơ (thử nghiệm dương tính) - Nhỏ giọt H2O2 vào cupule test MAN, INO SOR Đọc kết hình thành bọt khí hay khơng hình thành Thực tập Vi sinh vật học 190 Sau ghi nhận kết thử nghiệm, cộng điểm thử nghiệm dương tính nhóm Sẽ có số tương ứng với nhóm thử nghiệm Tra số vào bảng API 20E Quick Index Booklet để xác định vi sinh vật phân tích Bảng 26.2 Kết hệ thống API 20E dựa vào biến đổi màu môi trường IN IG R O Ví dụ: kết API 20E E coli = 144 572 + - + - L + A - + + + Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 191 IV NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Các loại thuốc thử dùng thử nghiệm chất độc, cần mang găng tay trang trình sử dụng - Chú ý thời gian ủ API 20E để đọc kết quả, không đọc kịp, cần giữ test API 20E nhiệt độ 2-8oC đến đọc kết - Sau đọc xong kết quả, phải hấp khử trùng test API 20E trước loại bỏ V BÁO CÁO THỰC TẬP - Trình bày nguyên tắc phương pháp xác định vi sinh vật hệ thống test API 20E - Xác định kết phân tích mẫu vi sinh vật - Mục đích việc thêm dầu khoáng số giếng API 20E? - Có thể dùng hệ thống API 20E để xác định loại vi khuẩn Gram (-), oxidase (+) không? R O L A IN IG Hình 26.3 Các bước thực xác định vi sinh vật API 20E L A IN IG R O View publication stats ... dung dịch vi sinh vật khử trùng cách nhúng vào cồn 96o đốt, không hơ trực tiếp lửa đèn cồn Thực tập Vi sinh vật học 114 V BÁO CÁO THỰC TẬP - Trình bày phương pháp định lượng tổng vi khuẩn hiếu... cụ, thiết bị nhóm (3 sinh vi? ?n) Đơn vị tính Số lượng Giá ống nghiệm Cái Ống nghiệm ‫׎‬18 Cái 15 Bình tam giác 25 0 ml Cái Cốc 100 ml Cái Bình tia Cái Thực tập Vi sinh vật học 122 STT Tên dụng cụ,... R O - Tính mật độ coliforms có mẫu ban đầu, đơn vị CFU/ml Thực tập Vi sinh vật học 126 Bài 17 ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM – LÀM TƯƠNG ĐẬU I NGUYÊN TẮC Tương loại nước chấm