Tài liệu Bài thực hành Vi sinh vật học thú y gồm có những nội dung thực hành sau: Chuẩn bị đủ các phương tiên cần thiết để pha chế và nhuộm vi khuẩn, thực hiện pha chế và nhân đinh kết quả 3 loại thuốc nhuôm vi khuẩn, tiến hành nhuộm và nhân định kết quả 2 phương pháp nhuộm đơn và nhuộm kép. Mời các bạn cùng tham khảo.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y BỘ MÔN : VSV – GP - BL ThS Nguyễn Mạnh Cường BÀI THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC THÚ Y Số tín chỉ: 02 Mã số học phần: VMO221 Thái Nguyên, 3/2016 Kiến thức bắt buộc vi sinh vật đại cương CHUẨN BỊ PHA CHẾ MỘT SỐ THUỐC NHUỘM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM VI KHUẨN MỤC TIÊU HỌC TẬP Chuẩ n bi đu ̣ ̉ các phương tiê ̣n cầ n thiế t để pha chế và nhuô ̣m vi khuẩ n Thưc hiê ̣n pha chế và nhâ ̣n đinh ̣ kế t quả loa ̣i thuố c nhuô ̣m vi khuẩ n Tiế n hành nhuô ̣m và nhâ ̣n đinh ̣ kế t quả phương pháp nhuô ̣m đơn và nh ̣m kép NỢI DUNG Pha chế thuố c nhuô ̣m 1.1 Pha chế thuố c nhuộm Gram : Quá trình pha chế và đánh giá kỹ thuâ ̣t thao tác đươ ̣c thực hiêṇ theo quy trình sau: STT NỘI DUNG THỰC HIỆN Chuẩ n bi du ̣ ̣ng cu ̣: - lo ̣ sa ̣ch loa ̣i 200ml, có nút kín - pipet - Ống đong - Giấ y lo ̣c - Cối sứ - Cân Chuẩ n bi ho ̣ ́ a chấ t và cách pha - Thuố c nhuô ̣m tím gentian + tím gentian, dung dich ̣ baõ hòa cồ n 9510ml + Axit phenic 1ml + Nước cấ t 100ml Lắ c đề u, lo ̣c quá giấ y lo ̣c - Dung dich ̣ lugol + Iod 1g + Kali lodua 2g + Nước cấ t 5ml Nghiề n tan cố sứ rồ i rồ i cho thêm nước cấ t cho đủ 200ml - Thuố c nhuô ̣m Fucsin kiề m + Fucsin kiề m, dung dich ̣ baõ hòa cồ n o 95 10ml + Axit phenic 5ml + Nước cấ t 100ml Lắ c đề u, lo ̣c quá giấ y lo ̣c Nhân đinh ̣ kế t quả đạt - Thuố c nhuô ̣m phải tan đề u - Thuố c nhuô ̣m khố ng quá đă ̣c hoă ̣c quá loañ g - Thuố c nhuô ̣m phải không có váng hoă ̣c có cặn Có Không Điể m Điể m chuẩ n đa ̣t 2,0 2,5 2,0 2,5 1,0 Pha chế thuố c nhuộm Ziehl neelsen STT NỘI DUNG THỰC HIỆN Chuẩ n bi du ̣ ̣ng cu ̣: - Lo ̣ sa ̣ch có nút - Ống đong - Pipet - Cân Chuẩ n bi ho ̣ ́ a chấ t và cách pha: Fuscin của Ziehl: Có Không Điể m Điể m chuẩ n đa ̣t 1,0 2,5 2,5 - Dung dich 0,3g ̣ A: Fuscin kiể m Cồ n etylic 10ml - Dung dich 0,5g ̣ B : Axit phenic Nước cấ t 95ml Trô ̣n dung dich ̣ A với dung dich ̣ B - Hố n hơ ̣p cồ n axit ( cồ n etylic 95o + HCL 3%, mỗi thứ mô ̣t nửa) - Xanh methylen kiề m: Dung dich 0,3g ̣ A: Xanh methylen Cồ n etylic 30ml Dung dich ̣ B: Dung dich ̣ KOH 0,01% 100ml Trô ̣n dung dich ̣ A với dung dich ̣ B Nhân xét kế t quả - Thuố c nhuô ̣m phải tan đề u - không có váng că ̣n - không quá đă ̣c hoă ̣c quá loañ g 2,5 2,5 1,5 Nhuô ̣m vi khuẩ n 2.1 Nḥm Gram STT NỢI DUNG THỰC HIỆN Chuẩ n bi phương tiênL: ̣ ̣ - Du ̣ng cu ̣: + Lam kính sa ̣ch + Que cấ y, đèn cờ n + Ớng hút pipet + Giá nhuô ̣m, giá cắ m, bô can + Đồ ng hồ phút - Hóa chấ t: + thuố c nhuô ̣m tim gentian +Dung dich ̣ lugol o + cồ n 90 + Dung dich ̣ fucsin kiề m + Nước muôi sinh lý - vi khuẩ n: Vi khuẩ n từ môi trường nuôi cấ y hoă ̣c từ bê ̣nh phẩ m Tiế n hành nhuô ̣m : - Đánh dấ u lam kính _ Dán bênh ̣ phẩ m hoă ̣c vi khuẩ n lam kính, để khô tiêu bản - Cố đinh ̣ tiêu bản bằ ng cách hơ qua ngo ̣n lửa đèn cồ n 3-4 lầ n - Phủ tím gentian 45 giây , rửa nước - Nhỏ dung dich ̣ lugol lầ n 1,30 giây , hấ t - Nhỏ dung dich ̣ lugol lầ n 2,30 giây , hấ t - Tẩ y mầ u băng cồ n 90o đế n ba ̣c mầ u , rồ i rửa - Phủ thuố c nhuô ̣m fucsin kiề m 30 giây, rửa nươc, để khô - soi dướii kính hiể n vi Nhâ ̣n xét kế t quả - Vi khuẩ n Gram dương: bắ t mầ u tím đen - Vi khuẩ n Gram âm: bắ t mầ u hồ ng đỏ có không Điể m Điể m chuẩ n đa ̣t 1,5 0,5 1,0 0,5 1,0 0,5 0,5 0,5 1,0 2,5 2.2 Nhuô ̣m Ziehl neelsen STT NỘI DUNG THỰC HIỆN Chuẩ n bi phương tiên: ̣ - Du ̣ng cu ̣: + Lam kính + Que khuấ y, đèn cồ n + Que có cán băng kim loa ̣i + Giá nhô ̣m, giá cắ m, bô cam … + Đồ ng hồ phút - hóa chấ t: + Thuố c nhuô ̣m Fucsin Ziehl + Hỗn hơ ̣p cồ n axit + Dung dich ̣ xanh methylen + Cồ n đố t + Nước cấ t - Bê ̣nh phẩ m: Đờm hoă ̣c các chấ t dich ̣ khác Tiế n hành nhuô ̣m: - Đánh dáu tiêu bản - Lấ y bê ̣nh phẩ m dàn đò phiên, để khô - Cố đinh ̣ tiêu bản bằ ng cach nhỏ vài gio ̣t cồ n o 90 l;ên tiêu bản, châm lửa đố t cháy cồ n - Phủ thuố c nhuô ̣m Fucsin của Ziehl kiń hế t tiêu bản Dùng que cồ n đố t chấ y từ từ dưới lam đế n mă ̣t đồ phiế n bốc hế t thì Đốt lầ n phút - Rủa sa ̣ch thuố c nhuô ̣m dưới vòi nuóc nhe ̣ - Tẩ y màu với hỗn hơ ̣p cồ n axit bằ ng cách nhúng tiêu bản vào dung dich ̣ cồ n axit, đưa lên xem chỉ có vế t đỏ nha ̣t của bênh ̣ phẩ m là đươ ̣c - Rửa dưới vòi nước nhe ̣ - Nhuô ̣m xanh methylen 30 giây, rửa nước, để khô, soi kính hiể n vi Nhâ ̣n đinh ̣ kế t quả - Vi khuẩ n kháng cồ n và axit : Bắ t mầ u đỏ - Những vi khuẩ n khác và tế bào không kháng cồ n và axit : Bắ t mầ u xanh lam Có Không Điể m Điể m chuẩ n đa ̣t 1,5 0,5 1,0 0,5 1,5 0,5 0,5 0,5 1,0 3,0 2.3.Nh ̣m Albert STT NỢI DUNG THỰC HIỆN Chuẩ n bi phương tiêṇ ̣ - Du ̣ng cu ̣: + Lam kính sa ̣ch + Que cấ y, đèn cồ n, đồ ng hồ phút + Giá nhuô ̣m, giá cắ m, bô cân - Hóa chấ t: + Dung dich ̣ I: Xanh toluidin 0,15g Lu ̣c malasit 0,2 g Axit axetic 1ml o Cồ n 95 2ml Nước 100ml Nghiề n xanh toluidin và lu ̣c malasit cố i sứ, cho cồ n vào, quấ y tan, cho axit axetic rồ i cho nước, Đổ vào lo ̣, để tủ ấ m 37oC Sau 24 giờ đem lo ̣c rồ i dùng + Dung dich ̣ II: kali iodua 2g Iod 3g Nước cấ t 300ml Tiế n hành nhuô ̣m - Đánh dấ u tiêu bản - lấ y bê ̣nh phẩ m dàn tiêu bản, đẻ khô - cố đinh ̣ tiêu bản bằ ng ngo ̣n lửa đèn cồ n - nhỏ dung dich ̣ I lên tiêu bản để 15 phút, rửa nước - Nhỏ dung dich ̣ II để phút , rửa nước, để khô Soi kiń h hiể n vi Nhâ ̣n đinh ̣ kế t quả Trực khuẩ n ba ̣ch hầ u bắ t mầ u xanh, thân có những ̣t nhiễm sắ c bắ t mầ u đâ ̣m Có Không Điể m Điể m chuẩ n đa ̣t 0,5 2,5 1,0 0,5 1,0 0,5 1,0 1,0 2,0 2.4 Nhuô ̣m đơn xanh methylen STT NỘI DUNG THỰC HIỆN Chuẩ n bi phương tiêṇ ̣ - Du ̣ng cu ̣: + Lam kính, que cấ y, đèn cồ n, đồ ng hồ , giá nhuô ̣m, giá cắ m, bô cân - Hóa chấ t: Nhuô ̣m xanh methylen - Bê ̣nh phẩ m: Tiế n hành nhuô ̣m - Đánh dấ u tiêu bản - Dán tiêu bản, để khô - Cố đinh ̣ tiêu bản bằ ng ngo ̣n lửa đèn cồ n - Nhỏ thuố c nhuô ̣m xanh methylen 30giây, rửa nước để khô - Soi khin ́ h hiể n vii Nhâ ̣n đinh ̣ kế t quả: Các vi khuẩ n có bênh ̣ phẩ m đề u bắ t mầ u xanh Có Không Điể m Điể m chuẩ n đa ̣t 1,0 1,0 1,0 0,5 1,5 0,5 1,0 0,5 3,0 PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN DÙNG ĐỂ NUÔI CẤY VI KHUẨN MỤC TIÊU HỌC TẬP Phân biêṭ đươ ̣c thành phầ n và mu ̣c đích sử du ̣ng các loa ̣i môi trường bản, môi trường tăng sinh, môi trường phân lâ ̣p và môi trưỡng xác đinh ̣ Chuẩ n bi ̣ đủ phương tiêṇ cầ n thiêt và tiế n hành pha chế từng môi trường cu ̣ thể đươ ̣c dùng cho viê ̣c phân lâ ̣p, xác đinh ̣ từng loa ̣i vi khuẩ n Nhâ ̣n đinh ̣ môi trường sau pha chế va nế u nguyên nhân làm mơi trường khơng đa ̣t u cầ u NỢI DUNG Môi trường bản Môi trường bản là môi trường có đủ các chấ t cầ n thiế t cho đa số các loa ̣i vi khuẩ n gây bê ̣nh phát triể n đươ ̣c Môi trường này thường đươ ̣c dùng để nuôi cấ y những vi khuẩ n dễ phát triể n 1.1 Nước thi ̣t - Công thức + Thiṭ bò, thiṭ lơ ̣n hoă ̣c thiṭ trâu 500g + Nước cấ t 1000ml - Pha chế : Có Không Điể m Điể m STT NỘI DUNG THỰC HIỆN chuẩ n đa ̣t Chuẩ n bi ̣ du ̣ng cu ̣: Nồ i nhôm, ố ng đong , 1,0 giấ y lo ̣c, dao, máy say thit,̣ cân Lo ̣c hế t gân, mỡ của thit,̣ say hoă ̣c băm nhỏ, 2,0 cân 500g Ngâm thiṭ vào 1000ml nước cấ t, để tủ la ̣nh 1,0 qua đêm Đun từ từ cho tới sôi, vớt bo ̣t khuấ y đề u 1,5 Duy trì sôi âm ỉ giờ, thỉnh thoảng khuấ y đề u 1,5 Lo ̣c qua giấ y lo ̣c để loa ̣i mỡ và bã thit.̣ 0,5 Thêm nước cấ t cho đủ 1000ml 1,0 Nế u cấ t giữ để dành thì đóng chai hấ p 110oC 30 phút 1,0 Nhâ ̣n đinh ̣ kế t quả 1.2 Nước thịt thường - Công thức: + Nước thiṭ 1000ml +Pepton bô ̣t 10g +NaCL thinh khiêt 5g Nế u không có nước thiṭ bò thì thay 5g cao thit.̣ - Pha chế STT Có Không Điể m Điể m chuẩ n đa ̣t Chuẩ n bi ̣ du ̣ng cu ̣: Ống nghiê ̣m, giấ y lo ̣c, 1,0 cân, nồ i nhôm,dề n cồ n, bình cầ u Cân đong đủ các thành phầ n vào nồ i nhôm 1,0 Đun sôi, khuấ y đề u cho tan hế t thành phầ n 1,0 Điề u chin̉ h pH 7,8-8- bằ ng dung dich 0,5 ̣ NaOH 20% 1,0 o Hấ p 120 C/30 phút, để nguô ̣i cho nắ ng că ̣n 1,0 Chắ t nấ y nước trong, điề u chỉnh pH7,4-7,6 1,5 Đun la ̣i lo ̣c qua giấ y lo ̣c cho 2,0 Đóng ông 16 mm, mỗi ông 5ml, hấ p ,10 o 110 C/30 phút Nhâ ̣n xét kế t quả Yêu cầ u môi trường phải trong, màu vàng nha ̣t hoă ̣c xám NỘI DUNG THỰC HIỆN 1.3 Thạch thường - Công thức: + Nước thiṭ 1000ml (có thể thay bằ ng cao thiṭ 5g) + Pepton bô ̣t 10g + NaCL thinh khiêt 5g + Tha ̣ch sợi 20g - Pha chế STT NỘI DUNG THỰC HIỆN Chuẩ n bi ̣ du ̣ng cu ̣: Điã petri, ố ng nghiêm ̣ , ga ̣c, ố ng đo, cân, nồ i nhôm, đèn cồ n, bình cầ u Cân, đong đủ nước thit,̣ pepton, muố i cho vào nồ i, đun nóng cho tan Điề u chỉnh đô ̣ ph 7,8-8 băng dung dich ̣ Có Không Điể m Điể m chuẩ n đa ̣t 1,5 1,5 0,5 0,5 NaOH 20% Cho tha ̣ch đã rửa sa ̣ch , cắ t nhỏ vào nồ i Hấ p 120oC/30 phút Kiể m tra la ̣i pH 7,4-7,6 Lo ̣c qua ga ̣c môi trường còn nóng rồ i phân phố i vào bin ̣ ̀ h cầ u hoă ̣c ố ng nghiêm o Hấ p 110 C/30 phút, lấ y Các ố ng nghiê ̣m phải để nằ m nghiêng cho tha ̣ch đông 1,0 0,5 2,0 1,5 1,0 Nhâ ̣n xét: Yêu cầ u của môi trường: tha ̣ch phải tan đề u, môi trường không đươ ̣c quá cứng hoă ̣c quá mề m Môi trường tăng sinh (Tham khảo thêm) Môi trường phân lập (Đọc thêm) Bài 1+ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI KHUẨN VÀ CÁC MÔI TRƯỜNG MỤC TIÊU HỌC TẬP Chuẩ n bi đu ̣ ̉ phương tiê ̣n cầ n thiêt để nuôi cấ y vi khuẩ n Tiế n hành nuôi cấ y vi khuẩ n môi trường đă ̣c và lỏng theo đúng quy trình Nhâ ̣n biế t đươ ̣c tin ́ h chấ t phát chiể n của vi khuẩ n môi trường lỏng và các loa ̣i kh̉ n la ̣c mơi trường đă ̣c NỢI DUNG Chuẩ n bi phương tiên ̣ ̣ 1.1.Dụng cụ: - Pipet pasteur - Que cấ y, que tăm vô khuẩ n - đèn cồ n - giá cắ m ố ng nghiê ̣m , giá cắ m pipet 1.2 Hóa chấ t môi trường - Nước muố i sinh lý vô khuẩ n - Môi trường lỏng vô khuẩ n - Môi trường đă ̣c vô khuẩ n - Dung dich ̣ sát khuẩ n Creryl 5% 1.3 Vi khuẩn hoặc bê ̣nh phẩm Vi khuẩ n đã nuôi cấ y môi trường hoă ̣c bê ̣nh phẩ m cầ n phân lâ ̣p Tiế n hành kỹ thuâ ̣t 2.1 Nuôi cấ y môi trường lỏng có không Điể m Điể m STT NỘI DUNG THỰC HIỆN chuẩ n đa ̣t Chuẩ n bi ̣ đủ phương tiêṇ cầ n thiế t, pipet 1,0 pasteur nế u bênh ̣ phẩ m lỏng hoă ̣c que cấ y nế u bênh ̣ phẩ m đă ̣c Đánh dấ u ố ng môi trường cho phù hơ ̣p với 0,5 bênh ̣ phẩ m Cấ y bằ ng pipet pasteur: - Dùng tay trái bẻ đầ u pipet cầ m ở tay 0,5 phải 0,5 -Khử khuẩ n pipet qua lửa đèn cồ n 0,5 -Tay trái cầ m ố ng bênh ̣ phẩ m, dung ngón tay út phải mở nút của ố ng, hơ miê ̣ng ố ng qua lửa để khử khuẩ n - Cho pipet pasteur vào ố ng đựng bênh ̣ phẩ m để bênh ̣ phẩ m từ từ vào pipet theo sức mao dẫn, nhanh chóng đă ̣t ngón tay chỏ lên đầ u pipet, rút pipet khỏi ông, đă ̣t ố ng bênh ̣ phẩ m vào giá - Cầ m ố ng môi trường nuôi cấ y bằ ng tay trái, mở nút bằ ng ngón tay út phải, khử khuẩ n miê ̣ng ố ng, cho pipet vào tới đầ u pipet cha ̣m vào môi trường và để chảy vài gio ̣t bênh ̣ phẩ m Rut pipet ra, khử khuẩ n miê ̣ng ố ng, đâ ̣y nút - Đă ̣t pipet vào vào bình đựng thuố c sát khuẩ n Cấ y bằ ng que cấ y: - Các thao tác tiế n hành cấ y băng pipet pasteur - Khi que cấ y cha ̣m vào môi trường thì để bênh ̣ phẩ m vi khuẩ n vào thành ố ng, dùng que cấ y hòa tan và lắ c nhe ̣ que cấ y cho bênh ̣ phẩ m tan môi trường - Khử khuẩ n que cấ y bằ ng cách đố t ngon lửa đèn cồ n - Sau nuôi cấ y xong, đă ̣t môi trường vào tủ ấ m ở nhiêṭ đô ̣, thời gian thích hơ ̣p tùy từng vi khuẩ n Nhâ ̣n đinh ̣ kế t quả: - Vi khuẩ n làm đu ̣c đề u môi trường - Vi khuẩ n phát triể n lắ ng xuố ng đáy của môi trường - Vi khuẩ n mo ̣c thành váng mă ̣t môi trường 1,0 1,5 0,5 1,0 1,0 0,5 0,5 1,0 2.2 Nuôi cấ y mơi trường đặc STT NỢI DUNG THỰC HIỆN Chuẩ n bi ̣ đủ du ̣ng cu ̣, môi trường tha ̣ch điã , tha ̣ch ố ng Đánh dáu môi trườngnuôi cấ y phù hơ ̣p với bênh ̣ phẩ m Nuôi cấ y môi trường tha ̣ch điã : - Tay trái cầ m điã môi trường, khử khuẩ n nơi đinh ̣ mở ngo ̣n lửa đèn cồ n, dùng ngón cái và ngón giữa tay trái cầ m lắ p hô ̣p lồ ng lên - Tay phải cầ m que cấ y lấ y mô ̣t quai bênh ̣ phẩ m, ria cấ y mă ̣t môi trường theo phương pháp va ̣ch hoă ̣c phương pháp khác - Đâ ̣y nắ p môi trường, đố t qua ngo ̣n lửa đèn cồ n, đố t đỏ que cấ y Nuôi cấ y môi trường tha ̣ch ố ng - Lấ y mô ̣t quai que cấ y bê ̣nh phẩ m cho vào ố ng tha ̣ch nghiê ̣m, nhúng vào bên có nước đo ̣ng ở phía dưới, kéo từ từ lên phầ n của mă ̣t tha ̣ch nghiêng, vừa kéo vừa đưa que cấ y sang ngang theo va ̣ch chữ chi và tránh ria sát vào thành ố ng - Dùng que cấ y đó cấ y tiế p sang ố ng thứ 2, thứ - Để tủ ấ m, nhiêṭ đô ̣ thích hơ ̣p, thời gian 2448 giờ Nhâ ̣n xét kế t quả: nhâ ̣n xét hình thái khuẩ n la ̣c mầ u sắ c Kić h thước, dang S hoă ̣c M, da ̣ng R có không Điể m chuẩ n Điể m đa ̣t ... m + Nước muôi sinh lý - vi khuẩ n: Vi khuẩ n từ môi trường nuôi cấ y hoă ̣c từ bê ̣nh phẩ m Tiế n hành nhuô ̣m : - Đánh dấ u lam kính _ Dán bênh ̣ phẩ m hoă ̣c vi khuẩ n lam... ̣ sát khuẩ n Creryl 5% 1.3 Vi khuẩn hoặc bê ̣nh phẩm Vi khuẩ n đã nuôi cấ y môi trường hoă ̣c bê ̣nh phẩ m cầ n phân lâ ̣p Tiế n hành kỹ thuâ ̣t 2.1 Nuôi cấ y môi trường lỏng... giữa tay trái cầ m lắ p hô ̣p lồ ng lên - Tay phải cầ m que cấ y lấ y mô ̣t quai bênh ̣ phẩ m, ria cấ y mă ̣t môi trường theo phương pháp va ̣ch hoă ̣c phương pháp khác - Đâ ? ?y nắ