Giáo trình Thực hành Vi sinh vật học cung cấp cho người học những kiến thức như: Chuẩn bị dụng cụ - pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật; Phân lập vi sinh vật; Nuôi cấy, quan sát sự phát triển của vi sinh vật;...Mời các bạn cùng tham khảo!
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN LANG KHOA CƠNG NGHỆ Giáo trình thực hành: VI SINH VẬT HỌC (LƯU HÀNH NỘI BỘ) GVTH: TS VÕ THỊ XUYẾN ` TP HỒ CHÍ MINH - 2020 MỤC LỤC NGUYÊN TẮC CHUNG KHI LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT I NGUYÊN TẮC LÀM VIỆC II MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẰM ĐẠT KẾT QUẢ TỐT TRONG THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC III ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC TẬP BÀI 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU II VẬT LIỆU III CHUẨN BỊ DỤNG CỤ Bao gói dụng cụ Phương pháp khử trùng dụng cụ IV PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG Khái niệm chung Các yêu cầu môi trường dinh dưỡng Phương pháp làm môi trường V THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ 11 BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT 12 I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU 12 II VẬT LIỆU 12 III KHÁI NIỆM 12 IV PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT 12 Tạo khuẩn lạc riêng rẽ (từ quần thể vi sinh vật) môi trường phân lập 13 Phân lập vi sinh vật môi trường đặc đĩa petri 13 Kiểm tra độ khiết giống phân lập 14 V PHÂN LẬP MỘT SỐ GIỐNG VI SINH VẬT 15 Phân lập nấm men 15 Phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger Mucor 16 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 17 Phân lập xạ khuẩn 17 VI THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ 17 BÀI 3: NUÔI CẤY, QUAN SÁT SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 18 I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU 18 II VẬT LIỆU 18 III PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT 18 Khái niệm 18 Mục đích việc ni cấy 18 Nguyên tắc 18 Các phương pháp nuôi cấy 19 IV CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI VI SINH VẬT 22 Nhiệt độ 22 Độ ẩm 22 Điều kiện hiếu khí yếm khí: 22 V QUAN SÁT ĐẶC TÍNH SINH LÝ CỦA VI SINH VẬT NI CẤY 23 Quan sát đặc tính phát triển vi sinh vật môi trường đặc 23 Quan sát đặc tính phát triển vi sinh vật môi trường lỏng 23 VI THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ 24 BÀI 4: ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT 25 I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU 25 II VẬT LIỆU 25 III THU VÀ PHA LOÃNG MẪU 25 Thu mẫu 26 Pha loãng mẫu 26 IV XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT 27 Xác định trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật phòng đếm hồng cầu 27 Xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc môi trường thạch 29 V THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ 30 BÀI 5: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI 31 I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU 31 II VẬT LIỆU 31 III QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT 32 Quan sát vi sinh vật trạng thái sống – làm tiêu tạm thời 32 Quan sát vi sinh vật trạng thái chết – làm tiêu cố định (tiêu vi sinh vật chết nhuộm màu) 34 IV THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 NGUN TẮC CHUNG KHI LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT I NGUYÊN TẮC LÀM VIỆC Khi làm việc với vi sinh vật, sinh viên thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật Bên cạnh lồi có ích, có nhiều lồi gây bệnh cho người, động vật, thực vật Vì vậy, trình nghiên cứu, việc tiếp xúc thường xuyên với vi sinh vật vật phẩm có vi sinh vật điều khơng thể tránh khỏi Do đó, để giữ gìn sức khỏe đạt hiệu cao công tác nghiên cứu, người làm thí nghiệm cần phải thực nghiêm ngặt quy tắc sau: Phải mặc áo blouse thời gian thực tập phịng thí nghiệm Khơng nói chuyện, không ăn uống, không hút thuốc không lại lộn xộn phịng thí nghiệm Khi làm việc phịng thí nghiệm vi sinh vật phải tuyệt đối giữ vệ sinh, tôn trọng ngăn nắp trật tự phịng thí nghiệm Tuyệt đối khơng để canh trường hay vật phẩm, môi trường nuôi cấy vi sinh vật gây bẩn bàn ghế, sách vở, quần áo hay vật dụng khác Trường hợp gây bẩn phải làm vệ sinh Khi sử dụng trang thiết bị, dụng cụ… phải thận trọng, tránh làm đổ vỡ hư hỏng Khi xảy tai nạn cố, cần báo với cán phụ trách để có biện pháp xử lý thích hợp, kịp thời Sau kết thúc thực hành, phải vệ sinh nơi làm việc mình, vệ sinh dụng cụ máy móc, dụng cụ thí nghiệm xếp vào nơi qui định Rửa tay dùng cồn sát khuẩn trước rời khỏi phịng thí nghiệm II MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẰM ĐẠT KẾT QUẢ TỐT TRONG THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC - Trước vào thực hành: Cần nghiên cứu kỹ mục đích – yêu cầu nội dung tồn hướng dẫn để hình dung công việc làm Hiểu thật rõ nguyên tắc thí nghiệm để thấy sở khoa học việc đề phương pháp thực nghiệm Đọc thật cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm để hiểu tiến trình Nếu có vấn đề khơng rõ phải xem lại khái niệm, kiến thức có liên quan với lý thuyết để làm sáng tỏ vấn đề - Trong thực hành: Cần có sổ ghi chép cơng việc thí nghiệm ví dụ: tên thí nghiệm, đối tượng nghiên cứu, nguyên tắc phương pháp, kết đạt được… Cần thực thao tác quy trình thí nghiệm để đạt mục đích yêu cầu đề - Sau thực hành: Phải làm đầy đủ tường trình theo phần câu hỏi tập (nếu có) nêu cuối III ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC TẬP Kết cuối đợt thực tập đánh giá dựa vào mức độ chuyên cần (hiện diện đầy đủ, nghiêm túc học tập), mức độ hiểu nguyên tắc, nhớ thao tác thực tập mức độ thành thạo thao tác Hai tiêu sau đánh giá dựa vào kiểm tra viết (hoặc vấn đáp) thực hành cuối đợt thực tập BÀI 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Biết cách bao gói, làm nút bơng, khử trùng dụng cụ nồi hấp khử trùng áp suất cao tủ sấy - Nắm vững yêu cầu, nguyên tắc, bước thực pha chế khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật II VẬT LIỆU - Ống nghiệm, bình tam giác, pipet, đĩa petri … để bao gói - Ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri để pha mơi trường - Gịn khơng thấm, giấy báo, thun… - Cân loại - Máy đo pH giấy đo pH - Cốc thủy tinh, đũa khuấy, phễu thủy tinh, muỗng cân hóa chất, giấy lọc - Bếp điện, nồi đun - Dao, kéo, giá ống nghiệm - Agar, khoai tây, nước cất - Xilen - Giấy lau kính hiển vi - Các loại hóa chất cần cho pha chế môi trường dinh dưỡng III CHUẨN BỊ DỤNG CỤ Bao gói dụng cụ 1.1 Nguyên tắc - Dụng cụ bao gói để ni cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, phải thật khô, không bị nứt mẻ - Việc bao gói phải thật kín cẩn thận để dụng cụ sau khử trùng đảm bảo vô trùng lớp giấy gói lấy sử dụng dễ dàng 1.2 Phương pháp bao gói dụng cụ Việc bao gói dụng cụ gồm hai khâu: - Làm nút bông: ống nghiệm, bình tam giác, pipet… - Bao gói: cho hầu hết dụng cụ thủy tinh 1.3 Cách làm nút bơng Dùng miếng gịn khơng thấm nước cuộn lại, nhét vào miệng ống nghiệm cho vừa đủ chặt u cầu: - Nút gịn có kích thước độ chặt vừa phải - Đầu nút phải trịn, gọn, phần ngồi lớn phần ống nghiệm - Lấy nút hay đóng vào dễ dàng Cách làm nút gòn áp dụng cho chai lọ, bình cầu, bình tam giác… cách làm tương tự ống nghiệm Nhưng lượng gòn sử dụng phải nhiều bọc lớp vải gạc 1.4 Cách bao gói dụng cụ Với dụng cụ sau làm nút bông, cần bao gói phần có nút bơng giấy dầu hay giấy báo để hấp khử trùng nút không bị ướt đảm bảo điều kiện vô trùng tốt Cách làm sau: gói Cắt mảnh giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao - Quấn giấy quanh phần đầu nút - Gập ống giấy sát vào nút mặt trước hai bên - Gập nốt phần giấy lại cài sâu vào bên Yêu cầu: + Phần giấy bao phải chặt kín + Bao giấy dầu với dụng cụ hấp ướt + Bao giấy báo với dụng cụ sấy khô khử trùng Với dụng cụ pipet, đĩa pêtri, que gạt phải dùng giấy bao kín tồn Có thể thay giấy báo hộp nhơm kín đựng tất dụng cụ để khử trùng Phương pháp khử trùng dụng cụ Có thể khử trùng số tác nhân lý hóa nhiệt độ, xạ, lọc hóa chất Tác nhân khử trùng chọn tùy mục đích vật liệu cần khử trùng - Các dụng cụ thủy tinh bền với nhiệt nên thường khử trùng phương pháp nhiệt khô tủ sấy Các gạt thủy tinh khử trùng cách đốt với cồn 700C que cấy kim loại khử trùng cách đốt trực tiếp lửa - Trường hợp cần khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật, phương pháp nhiệt ẩm nồi hấp áp lực (autoclave, 1atm, 1210C) thường sử dụng để thành phần hữu mơi trường khơng bị cháy, biến tính môi trường không bị nước - Trường hợp môi trường chứa chất phân tử lượng nhỏ không bền với nhiệt vitamin, amino acid, huyết chứa protein nhân tố tăng trưởng, phương pháp nhiệt ẩm làm biến tính thành phần nên thường khử trùng riêng phương pháp lọc qua màng 2.1 Khử trùng dụng cụ, môi trường nồi hấp áp lực Phương pháp thực nồi hấp vô trùng áp suất cao Là thiết bị làm kim loại, chịu nhiệt độ áp suất cao, có khả tự động điều chỉnh áp suất thời gian khử trùng theo yêu cầu người sử dụng - Nguyên tắc hoạt động Làm gia tăng nhiệt độ nước bảo hòa áp suất lớn áp suất bình thường khí Khi áp suất nước tăng lên nhiệt độ tăng theo nhờ hệ thống van chặt chẽ Mối quan hệ áp suất ghi áp kế với nhiệt độ nồi biểu qua bảng sau đây: Áp suất (atm) Nhiệt độ (0C) 100 0,5 112 1,0 121 1,5 128 2,0 134 Phương pháp khử trùng nhiệt ẩm cho phép diệt tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử vi sinh vật - Trình tự bước sử dụng nồi hấp áp lực sau + Bổ sung nước đáy nồi đến vạch quy định + Xếp dụng cụ vật liệu cần khử trùng vào giá đặt bên nồi hấp, không nên xếp chặt để nước lưu thơng dễ dàng + Đậy kín nắp nồi hấp Trường hợp nắp có nhiều ốc vặn, cần vặn ốc theo cặp đối xứng + Mở van thông nồi (trường hợp nồi hấp lớp) + Bật công tắc, đun nồi hấp + Khi nhiệt độ lên đến 800C 0,5 atm, mở từ từ van xả để đuổi hết khơng khí khỏi nồi vòng – phút luồng nước liên tục, đóng van lại + Khi áp suất lên đến mức cần thiết bắt đầu tính thời gian khử trùng + Khi đủ thời gian khử trùng, tắt điện, chờ nhiệt độ áp suất hạ xuống giá trị mờ nắp để tránh gây tai nạn tránh áp suất thay đổi đột ngột làm hư môi trường Một số nồi hấp đại tự kiểm sốt thời gian, áp suất tự đuổi khí khỏi nồi, cho phép bỏ qua số thao tác tương ứng phần Chú ý: để đảm bảo an toàn hiệu việc hấp khử trùng, ngồi việc thận trọng thực qui trình dẫn, người làm thí nghiệm cần phải + Kiểm tra mực nước bổ sung lượng nước cần thiết trước sử dụng + Với nắp nồi có nhiều ốc vặn, cần phải xiết ốc theo cặp đối xứng để đảm bảo độ kín, tránh làm nắp nồi bị chênh hư vòng đệm cao su + Tuyệt đối không mở nắp nồi kim nhiệt độ áp suất chưa trở + Trực dõi trình hấp khử trùng kết thúc ngắt điện Các bình tam giác, chai lọ, ống nghiệm chứa môi trường trước khử trùng phương pháp nhiệt ẩm cần đậy chặt đảm bảo cho phép khơng khí nước thông qua Thông thường, hộp petri nút cịn bao gói giấy giấy nhơm để tránh nguy bị nhiễm sau khử trùng Sau hấp hộp petri cần sấy khô trước dùng 2.2 Khử trùng dụng cụ thủy tinh phương pháp nhiệt khô Các hộp petri, ống hút thủy tinh bền với nhiệt khử trùng phương pháp sấy 1700C trong tủ sấy Trong trường hợp này, ống hút cần nhét nút không thấm nước đầu hút Hộp petri, ống hút, dụng cụ cần khử trùng khác gói kín giấy giấy nhơm trước sấy IV PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG Khái niệm chung Môi trường dinh dưỡng hỗn hợp gồm chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu tế bào ổn định pH môi trường Các yêu cầu môi trường dinh dưỡng Bất kỳ môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật cần đạt yêu cầu sau đây: - Có đủ chất dinh dưỡng cần thiết - Có độ pH thích hợp - Có độ nhớt định Thu mẫu Tùy theo loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu để nghiên cứu với số lượng khối lượng khác cho phù hợp Việc thu mẫu phải bảo đảm yêu cầu sau đây: - Lấy mẫu có tính chất đại diện - Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích đặc tính lý, hóa, sinh học - Dụng cụ lấy mẫu chứa mẫu phải vơ trùng - Lấy mẫu xong phải phân tích không để 24 - Mẫu lấy phải ghi vào nhãn ký hiệu ghi vào sổ đặc điểm mẫu nơi thu mẫu Pha lỗng mẫu Chuẩn bị số bình tam giác chứa 99 ml nước cất vô trùng, số ống nghiệm chứa ml nước cất vô trùng số ống hút (1ml) vô trùng a Nếu mẫu nghiên cứu trạng thái lỏng - Hút ml mẫu nghiên cứu cho vào ống nghiệm có ml nước cất vô trùng - Trộn dung dịch cách hút lên thổi xuống – lần ta độ pha loãng 1/10 hay 10-1 - Tiếp tục hút ml ống nghiệm cho vào ống nghiệm chứa ml nước cất vô trùng thứ - Trộn dung dịch ta có độ pha loãng 1/100 hay 10-2 - Tiếp tục hút từ ống sang ống 3, từ ống sang ống ta có độ pha lỗng tương ứng 10-3, 10-4… Hình 7: Sơ đồ pha lỗng mẫu nghiên cứu trạng thái lỏng cấy vào môi trường đặc 26 b Nếu mẫu nghiên cứu trạng thái đặc (như đất, thực phẩm …) - Chuẩn bị bình tam giác có dung tích 250 ml + Bình chứa 99 ml nước cất vơ trùng + Bình vơ trùng khơng chứa - Khử trùng cối chầy sứ cho cồn vào đốt lên Sau để nguội - Cân 1g mẫu cho vào cối sứ nghiền nát mẫu - Dùng tồn nước bình để chuyển tồn mẫu sang bình - Lắc khoảng phút, để lắng 30 giây tiếp tục pha loãng mẫu mẫu trạng thái lỏng - Tùy theo ước đoán số lượng vi sinh vật mẫu mà pha lỗng nhiều hay Sau có độ pha lỗng thích hợp tiến hành xác định số lượng tế bào vi sinh vật Hình 8: Sơ đồ pha loãng mẫu nghiên cứu trạng thái đặc cấy vào môi trường đặc IV XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT Xác định trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật phòng đếm hồng cầu Phòng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men, bào tử nấm mốc) Người ta thường dùng loại phòng đếm hồng cầu Thomas phòng đếm Geriep 27 Nguyên tắc cấu tạo loại phòng đếm giống Đó phiến kính dày hình chữ nhật, chia thành khoảng ngang Khoảng chia thành hai khoảng nhỏ Trên khoảng nhỏ có kẻ lưới đếm, gồm 400 vng Có diện tích tổng cộng 1mm2 Vì diện tích ô vuông 1/400 mm2 chiều cao 1/10 mm Như thể tích nhỏ 1/4000 mm3 Phịng đếm có kính dày để đậy Hình 9: Khung đếm Geriep; Nhìn nghiêng; Nhìn xuống; Khung phóng đại Tiến hành đếm: - Lắc ống nghiệm pha loãng mẫu - Đậy kính lên lưới đếm - Dùng ống hút vơ trùng lấy mẫu, cho giọt vào mép kính, sức mao dẫn dịch tự tràn vào mặt lưới đếm Chú ý khơng để tạo bọt khí lưới đếm tràn mẫu xuống rãnh - Đặt phòng đếm lên bàn kính hiển vi để yên – phút, tiến hành đếm tế bào ô lớn chéo nhau, đếm tế bào nằm lồng ô tế bào nằm cạnh liên tiếp chiều Đếm từ ô đến ô 16 Số lượng tế bào ml mẫu nghiên cứu xác định công thức: - Số tế bào/mL = a x 4000 x 103 b x 1/10-n a : số tế bào ô lớn (80 ô con) b : số ô ô lớn (16 ô x = 80 ô con) 103 : số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1ml) 28 10-n : độ pha lỗng mẫu Lưu ý: số tế bào lớn phải 200 đảm bảo mức độ xác phương pháp Xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc môi trường thạch - Nguyên tắc + Cấy thể tích xác định dịch huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng đĩa petri + Xác định số số lượng tế bào cách đếm số khuẩn lạc mọc lên sau thời gian ni cấy khuẩn lạc kết phát triển tế bào - Cách tiến hành + Trước tiên phải ghi độ pha loãng ngày cấy nắp petri + Pha loãng dịch huyền phù nồng độ khác nhau: 10-3, 10-4, 10-5, … + Chuẩn bị môi trường ống nghiệm (khoảng 20 ml) khử trùng giữ lại trạng thái lỏng cách đặt tủ ấm nồi cách thủy có nhiệt độ 450C + Dùng pipet vơ trùng hút 0,5 1ml dịch pha lỗng mẫu cho vào đĩa petri vơ trùng + Sau đổ môi trường thạch từ ống nghiệm sang Dùng tay xoay trịn đĩa cho mẫu hịa vào mơi trường + Chờ môi trường đặc lật úp đĩa lại đặt vào tủ ấm có nhiệt độ thời gian thích hợp Sau lấy kiểm tra kết + Mỗi mẫu cấy nồng độ liên tiếp Mỗi nồng độ cấy đĩa petri lấy kết trung bình Việc tính số lượng khuẩn lạc mọc lên tiến hành sau thời gian xác định, phụ thuộc vào tốc độ sinh trưởng loại vi sinh vật cần phát môi trường Kết lần cấy lặp lại tổng hợp trích số khuẩn lạc trung bình mọc lên cấy từ độ pha loãng - Cách đếm Lấy bút mực kẻ đường kính giao đáy hộp petri Đếm số khuẩn lạc vùng nhớ đánh dấu khuẩn lạc đếm Số lượng tế bào vi sinh vật 1g mẫu tính sau: Số tế bào / gam mẫu = 29 M V xHxN M : Số khuẩn lạc trung bình đĩa petri H : hệ số pha loãng = 1/10-n V : thể tích mẫu cấy N : Hệ số tính theo khối lượng khơ tuyệt đối mẫu Chú ý: Độ pha lỗng thích hợp nồng độ cấy thạch đĩa cho số khuẩn lạc trung bình từ 50 –150 với vi khuẩn, xạ khuẩn; 30 – 50 với nấm mốc V THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ - Thực hành đếm số lượng tế bào nấm men, vi khuẩn dịch nuôi cấy nồng độ pha loãng khác - Thực hành kiểm tra số lượng tế bào nấm men mẫu bánh men cơm rượu nồng độ 10-5, 10-6 Câu hỏi: Tại kiểm tra số lượng tế bào vi sinh vật loại mẫu người ta phải pha lỗng mẫu? Kiểm tra số lượng tế bào nấm men dịch nuôi cấy cách đếm buồng đếm hồng cầu, kiểm tra số tế bào nấm men bánh men cơm rượu theo phương pháp đếm số khuẩn lạc Từ tính số tế bào nấm men ml dịch nuôi cấy 1g mẫu bánh men? Xác định số lượng tế bào vi khuẩn nồng độ pha lỗng cách đếm số khuẩn lạc mơi trường thạch Tính số lượng tế bào vi khuẩn từ ml mẫu ban đầu? 30 BÀI 5: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Nắm vững cách sử dụng kính hiển vi quang học, đặc biệt kỹ sử dụng vật kính dầu - Biết cách làm tiêu (tạm thời) quan sát số đặc điểm vi sinh vật kính hiển vi - Nắm vững phương pháp làm tiêu phòng ẩm để quan sát cuống sinh bào tử nấm mốc - Nắm vững nguyên tắc, bước thực làm tiêu cố định nhuộm màu quan sát đặc điểm sinh học vi sinh vật kính hiển vi II VẬT LIỆU - Kính hiển vi, dầu soi - Đèn cồn, cồn 700, 900 - Gòn thấm - Que cấy vịng, que cấy móc - Phiến kính kính - Hộp petri có chứa phiến kính kính vơ trùng - Ống nghiệm chứa nước cất vô trùng - Pipet ml, 10 ml vô trùng - 200 ml môi trường PGA vô trùng - Thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% - Mẫu cấy vi khuẩn, nấm men, nấm mốc môi trường thạch đĩa - Tiêu nhuộm đơn vi khuẩn E coli, Bac.subtilis, Streptococcus …và nấm men - Tiêu phòng ẩm nấm sợi: Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus… - Thuốc nhuộm đơn, nhuộm bào tử, nhuộm gram - Giá mâm nhuộm - Bình tia, giấy lọc, giấy thấm - Đèn cồn, que cấy vòng - Cồn 950, HCl 0,5%, H2SO4 1% - Dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn E coli, Bac.subtilis (1 – tuần), nấm men 31 III QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT Quan sát vi sinh vật trạng thái sống – làm tiêu tạm thời Là quan sát vi sinh vật trạng thái tự nhiên hình dạng, cấu tạo, chuyển động, tăng trưởng phát triển… 1.1 Cách làm làm tiêu giọt ép a Đối với vi khuẩn nấm men - Cho giọt nước vơ trùng lên phiến kính - Dùng que cấy vòng lấy vòng dịch vi khuẩn nấm men hịa vào giọt nước - Đậy kính lên giọt canh trường thật nhẹ để tránh khơng tạo bọt khí - Đặt tiêu lên bàn kính hiển vi - Quan sát vật kính 10x 40x Chú ý: Nếu giọt dịch nhiều quá, tràn phần tiếp xúc phiến kính kính ta dùng giấy thấm bớt Trong trường hợp mẫu dạng khuẩn lạc mơi trường thạch, dùng que cấy vịng chấm nhẹ vào bìa mép khuẩn lạc hịa vào giọt nước vơ trùng chuẩn bị sẵn phiến kính Hình 10: Cách làm tiêu giọt ép b Đối với nấm sợi xạ khuẩn Do nấm mốc xạ khuẩn phát triển thành hệ sợi Do làm tiêu phải dùng kim dìm khuẩn ty vào dịch thấm ướt Đồng thời tách sợi rời Sau đậy kính lên Quan sát kính hiển vi vật kính 10x 40x Dịch thấm ướt xạ khuẩn nước nấm mốc phải dùng dung dịch lactophenol Ngoài ra, để giữ nguyên cấu trúc hệ sợi nấm mốc xạ khuẩn, quan sinh sản (cuống sinh bào tử, cách đính bào tử …) chuẩn bị tiêu phương pháp ni cấy phịng ẩm Các bước tiến hành sau: 32 - Cho vào đĩa petri tờ giấy thấm, đặt vào phiến kính Đậy lại, gói giấy đem hấp khử trùng - Đun chảy môi trường dinh dưỡng khử trùng ống nghiệm (môi trường PGA cho nấm mốc Gause cho xạ khuẩn) - Mở nắp petri gần lửa đèn cồn, đổ thạch ống nghiệm lên phiến kính chờ đơng lại - Lấy nước cất vô trùng đổ vào phần giấy thấm, để nước thấm tờ giấy (khơng tràn lên phiến kính) - Dùng que cấy móc, khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm mốc (hoặc xạ khuẩn) chấm lên phần thạch phiến kính phịng ẩm - Gói hộp lại nuôi ủ nhiệt độ thường – ngày (nấm mốc), - ngày (xạ khuẩn) - Mở hộp petri lấy phiến kính bên - Dùng giấy thấm lau mặt đáy phiến kính Đậy kính lên chỗ có khuẩn lạc mọc đặt kính hiển vi để quan sát mẫu (ở trạng thái sống với vật kính có độ phóng đại 10x 40x) 1.2 Phương pháp làm tiêu giọt treo Loại tiêu theo dõi sinh sản, hình thành bào tử, khả di động … vi sinh vật Cách tiến hành sau: + Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình trịn + Bôi vazơlin quanh phần lõm phiến kính + Cho giọt canh trường lên kính + Cẩn thận úp ngược kính lên chỗ lõm phiến kính + Được quan sát kính hiển vi Chú ý: khơng để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào đáy phần lõm 1.3 Cách làm tiêu tạm thời có nhuộm màu Nguyên tắc: phương pháp sử dụng thuốc nhuộm không độc với vi sinh vật pha loãng nồng độ đảm bảo cho tế bào sống hoạt động sau nhuộm Cách nhuộm: + Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% lên phiến kính + Nhỏ giọt canh trường lên giọt thuốc nhuộm + Đậy kính lên giọt dịch + Quan sát tiêu vật kính 10x 40x 33 Quan sát vi sinh vật trạng thái chết – làm tiêu cố định (tiêu vi sinh vật chết nhuộm màu) 2.1 Cách làm tiêu Quan sát tiêu cố định phương pháp phổ biến nghiên cứu vi sinh vật học có ưu điểm sau: - Thao tác phức tạp tiêu có màu sắc đẹp, giữ lâu - Cho phép ta quan sát rõ ràng hình dạng số cấu tạo tế bào dễ dàng đếm số lượng tế bào vi sinh vật… - Không sợ bị lây nhiễm làm việc với vi sinh vật gây bệnh Quá trình làm tiêu cố định thường qua bước sau: a Làm vết bôi - Chọn phiến kính khơ Nếu chưa phải rửa lại - Lấy bút chì màu khoanh vịng trịn (1 – cm2) lên phía phiến kính, quay ngược phiến kính lại để lên giá (nếu làm quen khơng cần làm bước này) - Dùng que cấy vòng lấy giọt canh trường để vào vòng khoanh Nếu canh trường đặc dùng que cấy lấy giọt nước vơ trùng để lên vịng khoanh, sau lấy khuẩn lạc vi sinh vật hòa với nước - Nghiêng que cấy 10 –15 độ, nhẹ nhàng dàn giọt canh trường khắp diện tích khoanh, khơng sát mạnh - Khử trùng que cấy để vào giá - Để vết bôi khô tự nhiên Chú ý: + Lượng vi sinh vật lấy vừa phải + Vết bôi trịn, gọn thật mỏng, vi sinh vật khơng tập trung vào chỗ chồng chất thành nhiều lớp, mà phải phân phối vết bơi + Kích thước vết bôi vừa phải khoảng 1- cm2, bé khó quan sát, lớn thời gian, tốn thuốc nhuộm b Cố định vết bôi Việc cố định vết bơi nhằm mục đích sau: + Giết chết vi sinh vật để an toàn tiếp xúc + Gắn chặt vi sinh vật vào phiến kính để lúc nhuộm rửa khơng bị trơi + Làm cho vi sinh vật dễ bắt màu Có nhiều phương pháp cố định, phương pháp đơn giản hơ nóng đèn cồn, cách làm sau: kẹp phiến kính ngón tay ngón trỏ, đưa 34 qua lại – lần phần khơng nóng đèn cồn, tránh khơng để tiêu nóng q Khi nghiên cứu cấu tạo tế bào việc cố định cách hơ nóng khơng có lợi, mà phải cố định hóa chất, thường dùng chất rượu axêton Các cách cố định sau: + Nhúng vết bôi vào rượu Với rượu 950 ngâm vết bôi từ – 15 phút Với rượu metylic ngâm khoảng – phút + Ngâm vết bôi vào dung dịch axêton phút + Nhỏ vài giọt rượu 90 – 950 lên vết bôi Đốt cháy dập tắt Làm vài lần để khô c Nhuộm màu tiêu Nguyên tắc: Sử dụng thuốc nhuộm có khả thẩm thấu qua màng tế bào kết hợp với thành phần khác tế bào thành hợp chất màu đặc trưng bền vững - Tùy theo mục đích nghiên cứu khả bắt màu khác thành phần tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm cho phù hợp - Có hai cách nhuộm chính: + Nhuộm đơn giản: dùng lọai thuốc nhuộm tiêu + Nhuộm phức tạp (nhuộm kép): dùng đồng thời hay nhiều loại thuốc nhuộm tiêu Ví dụ: nhuộm gram, nhộm bào tử, nhuộm tiêm mao… Như vậy, tùy mục đích nghiên cứu mà ta áp dụng phương pháp nhuộm thích hợp Cách nhuộm: Vết bơi cố định phải để khô đem nhuộm - Đặt tiêu có vết bơi lên cầu thủy tinh (được đặt nằm ngang miệng bôcan) - Đặt miếng giấy lọc phủ lên tồn vết bơi - Dùng ống nhỏ giọt nhỏ thuốc nhuộm phủ vết bôi Chú ý không cho thuốc nhuộm nhiều thời gian nhuộm vết bơi ln ln có phủ lớp thuốc nhuộm - Thời gian nhuộm tùy tính chất tiêu thuốc nhuộm - Thường nhuộm nhiệt độ phòng Để tăng cường tác dụng thuốc nhuộm rút ngắn thời gian ta hơ nóng đèn cồn - Khi nhuộm xong, rửa vết bôi cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dịng nước chảy nhẹ qua vết bôi đến nước chảy không cịn màu 35 - Dùng giấy thấm khơ tiêu hơ nhẹ tiêu đèn cồn - Quan sát tiêu vật kính 40x chuyển sang vật kính 100x có dầu Hình 11: Trình tự bước làm tiêu cố định 2.2 Các phương pháp nhuộm tế bào vi sinh vật a Nhuộm đơn giản Là phương pháp hay dùng phịng thí nghiệm, cho phép ta nhận định nhanh chóng hình dạng vi sinh vật Tiến hành nhuộm tế bào vi khuẩn E coli, Bac.subtilis, tế bào nấm men theo trình tự sau: - Làm vết bơi, để khơ tự nhiên - Cố định cách hơ nhẹ đèn cồn - Đặt giấy lọc lên vết bôi cố định - Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm Fuchsin loãng – phút xanh metylen – phút - Dùng nước rửa - Thấm khô giấy thấm - Quan sát vật kính 100x (có dầu) b Nhuộm phức tạp (nhuộm kép) Phương pháp dựa đặc tính cấu tạo hóa học tế bào, dùng để nghiên cứu cấu tạo đặc tính tế bào khác loài vi sinh vật 36 NHUỘM GRAM Nguyên tắc: Dựa khả bắt màu với thuốc nhuộm tím kết tinh iod mà chia thành nhóm lớn + Nhóm giữ phức chất tạo thành tím kết tinh iod xử lý cồn Nhóm vi khuẩn có tính chất gọi vi khuẩn gram dương + Nhóm khơng giữ phức chất tạo thành tím kết tinh iod xử lý cồn Nhóm vi khuẩn có tính chất gọi vi khuẩn gram âm Tiến hành nhuộm tế bào E coli Bac.subtilis Chuẩn bị tiêu - Làm vết bôi, để khô - Cố định nhẹ lửa đèn cồn (tránh làm nóng quá) Nhuộm tiêu - Đặt giấy lọc lên vết bôi - Nhuộm tiêu tím kết tinh – phút - Đổ hết thuốc đi, nhỏ dung dịch lugol lên để phút - Rửa nước, thấm khô - Nhúng vào cồn 950 30 giây Cần làm cẩn thận kết phụ thuộc nhiều vào động tác - Rửa nước, thấm khô - Nhuộm bổ sung Funshin lỗng phút - Rửa nước, thấm khơ - Xem tiêu vật kính dầu Kết quả: Bac.subtilis bắt màu tím, E coli bắt màu hồng NHUỘM BÀO TỬ (NHA BÀO) Nguyên tắc: Dựa cấu trúc đặc biệt màng bào tử dày, chắc, khó bắt màu nên nhuộm cần phải dùng thuốc nhuộm đặc, xử lý tế bào chất bào tử dễ bắt màu nhiệt axit Có nhiều phương pháp nhuộm bào tử, tất phương pháp dựa nguyên tắc: - Đầu tiên nhuộm toàn (cả tế bào chất bào tử tế bào) loại thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh - Làm màu tế bào (nhưng bào tử màu) - Nhuộm lại tế bào loại thuốc nhuộm khác 37 Nhờ mà tế bào chất bào tử tế bào chất tế bào bắt màu khác Làm tiêu nhuộm (Theo phương pháp Ogietska) - Làm vết bôi với Bac.subtilis nuôi cấy tuần tuổi ống thạch nghiêng, để khô tự nhiên - Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng đèn cồn cho bốc hơi, giữ phút rửa nước - Đặt giấy lọc lên vết bôi - Nhỏ Fuchsin Ziehl – phút Trong nhuộm hơ nóng bốc nhẹ Nếu thuốc nhuộm cạn phải thêm vào, không để bị khô - Rửa vết bôi, để khô - Tẩy màu cách nhúng phiến kính vào dung dịch H2SO4 1% – phút - Rửa nước - Nhuộm vết bôi xanh metylen Loeffler – phút - Rửa sạch, để khô - Quan sát tiêu vật kính dầu Kết quả: bào tử màu đỏ, tế bào chất màu xanh IV THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ Thực hành quan sát đại thể khuẩn lạc vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Thực hành sử dụng kính hiển vi Làm tiêu tạm thời quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn, nấm men Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn, nấm men vật kính dầu nhuộm đơn Thực hành làm tiêu phòng ẩm Quan sát sợi khuẩn ty cuống sinh bào tử nấm mốc tiêu chuẩn bị sẵn Thực hành làm tiêu nhuộm đơn để quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn, nấm men Thực hành làm tiêu nhuộm gram nhuộm bào tử vi khuẩn Câu hỏi: Cho biết ý nghĩa việc nghiên cứu đặc điểm sinh học vi sinh vật? Vẽ mơ tả hình dạng tế bào vi khuẩn, nấm men quan sát kính hiển vi? 38 Trình bày phương pháp làm tiêu phịng ẩm Mơ tả vẽ hình cấu trúc sợi nấm, cuống sinh bào tử nấm mốc quan sát được? Trình bày nguyên tắc ý nghĩa việc nhuộm đơn, nhuộm kép (nhuộm gram, nhuộm bào tử) nghiên cứu vi sinh vật? Tóm tắt phương pháp nhuộm đơn Vẽ hình tế bào quan sát được? Tóm tắt phương pháp nhuộm gram Vẽ hình giải thích kết nhuộm? Tóm tắt phương pháp nhuộm bào tử Vẽ hình thích kết quan sát được? 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Linh Thước, 2011 Thực tập vi sinh vật học, NXB ĐHQGTP Nguyễn Đức Lượng, 2011 Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB ĐHQGTP Lê Văn Việt Mẫn (chủ biên), 2014 Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, ĐHQG TP HCM Trần Thanh Thủy, 1998 Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXBGD 40 ... khâu tách rời trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật Mục đích vi? ??c ni cấy - Phát có mặt vi sinh vật vật liệu nghiên cứu - Tiến hành vi? ??c nhân giống vi sinh vật cách nhanh chóng - Cấy truyền từ... trọng vi? ??c nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật Vi sinh vật dạng khiết giống vi sinh vật tạo từ tế bào ban đầu IV PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT Nguyên tắc: tách rời tế bào vi sinh vật, ... công? 11 BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU - Nắm vững nguyên tắc mục đích vi? ??c phân lập vi sinh vật - Thực bước phân lập làm chủng vi sinh vật II VẬT LIỆU - Cỏ khô ngâm nước – ngày;