Giáo trình thực hành vi sinh vật kỹ thuật môi trường

VỆ SINH CÁ NHÂN VÀ NGUYÊN TẮC LÀM VIỆC Khi làm việc phòng thí nghiệm vi sinh học phải tuyệt đối vệ sinh, tôn trọng tính ngăn nắp trật tự phòng thí nghiệm Mỗi cá nhân, nhóm làm thí nghiệm với dụng cụ riêng, không mượn dụng cụ nhóm khác Nếu thiếu phải hỏi cán PTN GVHD, không tự động sử dụng dụng cụ người khác Phải mặc áo bluose Không nói chuyện, không ăn uống, không hút thuốc lá, không lại lộn xộn PTN Không để vật phẩm, canh trường vi sinh vật môi trường nuôi cấy vi sinh vật gây bẩn bàn ghế, sách quần áo Trường hợp gây bẩn phải vệ sinh Sau làm xong, phải vệ sinh nơi làm việc mình, vệ sinh dụng cụ, máy móc thí nghiệm Rửa tay lấy cồn sát khuẩn trước khỏi PTN Khi tiến hành thí nghiệm phải có sổ ghi chép công việc thí nghiệm Trong sổ ghi chép điều kiện liên quan đến thí nghiệm Phải ghi chép đầy đủ, cẩn thận, rõ ràng HỌ VÀ TÊN SINH VIÊN MSSV ……………………………………… …………………… Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường BÀI 1: CÁC QUY TẮC PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG CÁC QUY TẮC PHÒNG THÍ NGHIỆM 1.1 Tiệt trùng bề mặt môi trường làm việc Phòng thí nghiệm vi sinh phải vệ sinh trước sau sử dụng Dụng cụ thiết bị khử trùng hay vệ sinh sếp ngăn nắp Bề mặt làm việc phải tiệt trùng cồn 700 1.2 Máy móc, dụng cụ phòng thí nghiệm: Dụng cụ thuỷ tinh kim loại: - Các dụng cụ đựng môi trường dinh dưỡng phải khử khuẩn tuyệt đối trước sử dụng Sau sử dụng xong phải rửa khử khuẩn lại, sấy khô, bao gói để vào nơi quy định - Các máy móc, thiết bị cần có độ xác cao (cân phân tích, buồng đếm…) cần phải ý vệ sinh sau tiến hành thí nghiệm Có hai phương pháp tiệt trùng: nhiệt khô nhiệt ẩm *Phương pháp tiệt trùng nhiệt khô: Sấy tủ sấy nhiệt độ 170 -1800C *Phương pháp tiệt trùng nhiệt ẩm: Được thực thiết bị tiệt trùng áp suất 1atm, 1210C thời gian 20-30 phút Dụng cụ plastic chịu nhiệt: Tiệt trùng nhiệt ẩm Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Thường tiệt trùng thiết bị tiệt trùng 1210C, 20-30 phút Đối với thành phần môi trường dinh dưỡng nhạy cảm với nhiệt độ cao sử dụng phương pháp tiệt trùng nhiệt thiết bị tiệt trùng Trong trường hợp cần sử dụng màng lọc vi khuẩn để tiệt trùng KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG Môi trường dinh dưỡng hỗn hợp gồm chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxi hoá khử, áp suất thẩm thấu tế bào ổn định độ pH môi trường Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Có đủ chất dinh dưỡng cần thiết; Có độ pH thích hợp; Có độ nhớt định; Không chứa yếu tố độc hại; Hoàn toàn vô trùng Làm môi trường để thực việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy nghiên cứu đặc điểm sinh học chúng 2.1 Nguyên tắc Dựa sở nhu cầu chất dinh dưỡng khả đồng hoá chất dinh dưỡng loại sinh vật Đảm bảo cân áp suất thẩm thấu môi trường tế bào vi sinh vật Đảm bảo điều kiện hoá lý cần thiết cho hoạt động trao đổi chất vi sinh vật 2.2 Pha môi trường Cân, đong thật xác thành phần môi trường pha chế theo trình tự hướng dẫn tài liệu + Môi trường lỏng: Cân, đong chất cho hoà tan vào nước + Môi trường đặc: Cân agar hoá chất cho vào bình tam giác hay becher hoà tan nước, đun bếp hay hấp autoclave 2.3 Chuẩn bị môi trường a Thạch nghiêng Cho vào ống nghiệm với lượng môi trường đặc 1/3 đến 1/4 ống nghiệm Để ống thạch vị trí nghiêng thích hợp lúc thạch đặc lại hoàn toàn Vị trí đầu mặt nghiêng không vượt 2/3 chiều cao ống nghiệm Không để thạch chạm vào nút bông, làm nghiêng tốt, mặt thạch nghiêng phẳng, không bị đứt, chiều dài vừa phải, không ngắn quá, dài b Thạch đứng Cho vào ống nghiệm với lượng môi trường chiếm 1/2 đến 2/3 ống nghiệm Thạch nguội đông lại ta có ống thạch đứng Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường chiếm 1/2 - 1/3 bình c Làm thạch hộp petri Đun thạch chảy lỏng, để nguội đến 50-600C Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Tay phải cầm bình (hoặc ống) môi trường chảy lỏng, giữ nghiêng, dùng tay trái xoay rút nút ra, vô khuẩn miệng bình (hoặc miệng ống đèn cồn) Dùng tay trái mở nắp hộp vừa phải nhanh tay rót vào hộp lượng môi trường thích hợp Nhanh chóng đậy nắp hộp lại, xoay tròn hộp từ từ bàn để thạch dàn thành lớp đáy hộp Không xoay mạnh làm thạch bắn tung lên Hé mở nắp hộp để yên lúc thạch đặc lại hoàn toàn Đậy nắp lại, lật ngược hộp cho đáy lên Hộp thạch đổ tốt, mặt thạch phải đều, phẳng, lớp thạch không dày mỏng (thường khoảng 2mm) Hình 1: Một số dạng môi trường ống nghiệm và đĩa petri Số môi trường chưa dùng đến phải bảo quản chỗ mát, nhiệt độ từ - 0C, không để môi trường bị khô, bị tác dụng ánh sáng Dù môi trường chuẩn bị hay bảo quản lâu, trước đem dùng phải kiểm tra vô khuẩn Muốn vậy, ta để môi trường tủ ấm có nhiệt độ từ 37 - 38 0C – Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường ngày lấy quan sát loại bỏ ống (hoặc bình) môi trường có vi sinh vật phát triển (bị đục có khuẩn lạc) 2.4 Điều chỉnh độ pH môi trường: Điều chỉnh độ pH môi trường dùng HCl 10% hay NaCl 10% Ngoài có số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3 Lập nhãn môi trường vừa thực hiện: Tên môi trường: Khử trùng: ngày tháng năm DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG 3.1 Dụng cụ Dụng cụ Đèn cồn Đĩa petri Ống nghiệm Pipet 1ml Pipet 10ml Becher 100ml 3.2 Số lượng 60 60 6 12 Hóa chất môi trường Agar Môi trường tổng hợp PCA (plate count agar) Cồn 960 Nước cất 30g 23.5g lít lít THỰC HÀNH Pha cồn 700 Đổ môi trường thạch ống nghiệm đĩa petri Chuẩn bị môi trường PCA (plate count agar) Viết báo cáo CHUẨN BỊ Mẫu nước: sinh hoạt nước thải Mẫu đất Đơn vị Cái Cái Cái Cái Cái Cái Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 1 Số liệu báo cáo ỐNG NGHIỆM ………………… ỐNG NGHIỆM ỐNG NGHIỆM …………………… ………………… ĐĨA PETRI ………………… ĐĨA PETRI ĐĨA PETRI …………………… ………………… ĐĨA PETRI (PCA) ………………… ĐĨA PETRI (PCA) ĐĨA PETRI (PCA) …………………… ………………… ĐẠT KHÔNG ĐẠT KHÔNG ĐẠT KHÔNG Nhận xét kết quả: Câu hỏi ôn bài: 2.1 Tại phải vô trùng? Các phương pháp vô trùng tiệt trùng? 2.2 Tại lại mở nắp đĩa petri chuẩn bị môi trường thạch? Tại phải điều chỉnh độ pH? 2.3 Có dạng môi trường thạch ống nghiệm? Nêu đặc trưng cho loại môi trường? Yêu cầu học - Nắm vững nội dung học - Lập báo cáo kết nhận xét - Trả lời câu hỏi Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ Xác định hay định lượng vi sinh vật xác định số lượng cá thể tồn đơn vị vật phẩm canh trường Để định lượng, cần phải thao tác quy cách số vấn đề như: lấy mẫu, pha loãng mẫu… PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU - - - Để đánh giá xác số lượng vi sinh vật, yêu cầu mẫu phải lấy bảo kỹ thuật Tùy theo yêu cầu nghiên cứu, đối tượng nghiên cứu tiêu sinh học cần phân tích mà khối lượng mẫu quy cách lấy mẫu (số lượng, vị trí, thời gian…) khác nhau.Tuy nhiên, việc lấy mẫu cần tuân theo yêu cầu sau: Dụng cụ lấy mẫu chứa mẫu phải vô trùng: đẩm bảo độ khiết, tránh tạp nhiễm … đảm bảo độ xác kết phân tích Dụng cụ lấy mẫu chứa mẫu phải sạch, không độc hại với vi sinh vật, tránh làm chết ức chế vi sinh vật vận chuyển bảo quản Các yêu cầu khối lượng tính đặc thù mẫu: + Đủ khối lượng theo yêu cầu phân tich + Đúng nơi quy định vào thời điểm phù hợp với yêu cầu nghiên cứu + Mẫu trung bình điển hình Bảo quản: mẫu lấy xong phân tích Nhiệt độ thường không để mẫu 30 phút Nếu lấy mẫu xa, cần có thiết bị phân tích trường bảo quản nhiệt độ thấp (0-5 0C), thời gian bảo quản không 24 Các yêu cầu khác: mẫu cần dán nhãn ghi rõ + Mã số mẫu + Loại mục đích lấy mẫu + Tên chức người lấy mẫu +Yêu cầu phân tích PHA LOÃNG MẪU 5.1 Chuẩn bị mẫu Yêu cầu việc lấy mẫu: - Lấy mẫu có tính chất đại diện - Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích đặc tính lý, hoá, sinh học Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường - Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng - Lấy mẫu xong phải phân tích không để 24h - Ghi nhật ký mẫu nơi thu mẫu 5.2 Pha loãng mẫu : - Chuẩn bị bình chứa mẫu cần phân tích - Một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng - Một số pipet vô trùng - Pha loãng mẫu cần phải thực tủ cấy phòng vô trùng a Mẫu trạng thái lỏng : Pha loãng mẫu theo dãy thập phân 1/10 (10-1), 1/100 (10-2), 1/1000 (10-3),… 10-n Hình 2.1: Phương pháp pha loãng mẫu nước theo dãy thập phân b Nếu mẫu nghiên cứu trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực phẩm) Môi trường đất nhìn chung thuận lợi cho nhiều nhóm vi sinh vật phát triển Hệ vi sinh vật đất đa dạng gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn… Số lượng vi sinh vật phụ thuộc vào hàm lượng chất hữu cơ, tính chất lý độ ẩm đất, số lượng cá thể thường lớn Các bước tiến hành: Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường - Lấy mẫu đất: mẫu đất mang phân tích có tính đại diện nên số lượng mẫu tùy theo yêu cầu nghiên cứu khác Mẫu đất lấy từ 10-20g cho vị trí, lấy mẫu góc vuông mẫu tâm, độ sâu định mẫu phải trộn trước sử dụng - Chuẩn bị dụng cụ: Một bình tam giác 250 ml chứa 90ml nước cất vô trùng Một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng Một số pipet vô trùng - Pha loãng mẫu: cân 10 g đất (hoặc mẫu) cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng Lắc 10 phút, để lắng 30 giây tiếp tục pha loãng mẫu trạng thái lỏng Tuỳ theo ước đoán số lượng vi sinh vật mẫu mà pha loãng nhiều hay Hình 2.2: Phương pháp pha loãng mẫu đặc theo dãy thập phân Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường KỸ THUẬT TRẢI ĐĨA Hình 2.3: Minh họa kỹ thuật trải đĩa Dùng pipet vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào đĩa thạch (tương đương với giọt dịch) Số tế bào cấy bề mặt thạch phải dàn khoảng 25-300 CFU (coliform unit: đơn vị khuẩn lạc) Sử dụng que cấy gạt thuỷ tinh để dàn tế bào bề mặt thạch, que gạt thuỷ tinh vô khuẩn cách nhúng vào cồn, đốt cháy phần cồn lại que cấy lửa đèn cồn Làm nguội que cấy cách nhẹ vào bề mặt thạch, dàn lượng chất lỏng chứa tế bào Lớp chất lỏng thạch mỏng, hấp thu xảy nhanh Đặt đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài nhiệt độ 300C ủ 48 Kết quả: Số khuẩn lạc (CFU) x Độ pha loãng CFU/g = Thể tích mẫu (ml) THỰC HÀNH 7.1 Dụng cụ Tên Số lượng Đơn vị 10 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường 20.3.2 Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen: Dùng phân biệt vi khuẩn Lao với vi khuẩn khác Do tế bào vi khuẩn kháng acid có lớp vỏ sáp bao bọc nên nhuộm phức hợp màu carbolfuchsin, phức hợp không bị tẩy màu dung dịch tẩy màu mạnh (acid, alcool acid) Tuy nhiên để phức hợp màu thấm xuyên qua lớp vỏ sáp vi khuẩn, có hai cách: - Đun nóng phết nhuộm với dung dịch màu carbolfuchin, nhờ carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp vi khuẩn để nhuộm màu vi khuẩn; phương pháp nhuộm nóng Ziehl Neelsen - Phương pháp thứ hai phương pháp nhuộm lạnh gọi phương pháp Kinyoun, phương pháp người ta dùng dung dịch carbolfuchsin đậm đặc, nhờ phủ dung dịch màu đậm đặc lên phết nhuộm với thời gian lâu, carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp để nhuộm màu vi khuẩn 20.3.3.Nhuộm bào tử Một số vi khuẩn Bacillus hay Clostridium có khả tạo thành bào tử Bào tử tồn môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chịu nhiệt số hóa chất mà thể sinh dưỡng 21 THỰC HÀNH Quan sát hình thái vi sinh vật được phân lập và nuôi cấy từ các bài trước Vẽ lại hình quan sát Viết báo cáo 47 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI Số liệu báo cáo 1.1 Kết quả quan sát hình thái vi nấm kính hiển vi: Mẫu vi sinh vật …… ……… ……… …………………… …………………… Hình dạng 1.2 Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn Mẫu ………………… Hình dạng Bắt màu ( …) Nhận xét kết quả: Câu hỏi ôn bài: 2.1 Trình bày thao tác sử dụng kính hiển vi quang học? nêu khác biệt thao tác quan sát vi nấm vi khuẩn, sao? 2.2 Tại phải nhuộm Gram quan sát vi khuẩn? Phân loại vi khuẩn bắt màu nhuộm Gram? 2.3 Trình bày thao tác nhuộm Gram? Yêu cầu học - Nắm vững nội dung học - Lập báo cáo kết nhận xét - Trả lời câu hỏi 48 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường PHỤ LỤC A HÓA CHẤT Cồn – Ether Tỷ lệ thể tích 3:1 Đong 750 ml cồn 960 + 250 ml ether, ta dung dịch cồn – ether tỷ lệ 3:1 Dung dịch dùng để tẩy vật kính dầu, dụng cụ dính dầu soi Cồn – acid (dùng để nhuộm Ziehl Neelsen ) Cách pha: Đong 97 ml cồn 960 + ml acid HCl H2SO4 đậm đặc Dung dịch sunfo – cromic: K2Cr2O7 + H2SO4 Công thức: K2Cr2O7 60g H2SO4 đậm đặc 66ml Nước 1000ml Cách pha: Cân 60g K2Cr2O7, hào vào 500ml nước Thêm từ từ 66ml H 2SO4 đậm đặc, cuối lại thêm 500ml nước Bicromate kali tác dụng với acid sulfuric làm sinh acid cromic Chất có tác dụng oxi hóa mạnh tẩy vết bẩn dụng cụ thủy tinh Thời gian ngâm dụng cụ thủy tinh từ – ngày, xả thật kỹ nước sạch, rửa savon bột, rửa lại nước Dung dịch dùng nhiều lần dung dịch từ màu đỏ cam biến thành màu lục đen bỏ Lưu ý: Dung dịch độc Do ngâm phải đậy kín, lúc rửa nên đeo trang, mang găng cao su kính bảo hiểm 49 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Cồn 700: Dùng để sát khuẩn tay, bàn , ghế, tủ cấy,… Cách pha: cồn 700 từ cồn 960 Vì không đòi hỏi xác, nên áp dụng công thức: V1C1 = V2C2 Nước muối sinh lý 9‰ vô khuẩn: Cân xác 9g NaCl tinh khiết cho vào cốc có chứa 991ml nước cất (vừa đủ 1000ml ), dùng đũa thủy tinh khuấy Đem hấp vô khuẩn t = 1210C, 1atm, 15 – 20 phút B THUỐC NHUỘM Crystal violet (C25H30N3Cl 9H2O = 570,11 ): Công thức: a) Crystal violet Cồn 960 0,4g 10ml b) Phenol 1g Nước cất 100ml Cách pha: Trộn hai dung dịch a b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đem lọc Chú ý: dung dịch thuốc nhuộm bảo quản chai màu, tránh ánh sáng Lugol: Công thức: KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300ml Cách pha: Hòa 2g KI vào 5ml nước cất, sau thêm 1g iod Chờ cho iod tan hết thêm nước vừa đủ 300ml 50 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Fuchsine kiềm ( C19H18N3Cl = 323,82 ): Công thức: a) Fuchsine kiềm Cồn 960 0,3g 10ml b) Phenol 5g Nước cất 35ml Cách pha: Trộn dung dịch a b với nhau, khuấy cho tan  đem lọc Bảo quản chai màu Trước dùng pha loãng lần (dịch pha loãng không giữ lâu dịch đặc giữ nhiều tháng ) Safranin O ( C20H19N4Cl = 350,80 ): Công thức: Safranin O ( dung dịch 2,5% cồn 960 ) 25ml Nước cất 75ml Bảo quản chai màu Methylene blue ( C37H27N2S2 = 799,80 ): Công thức: a) Methylen blue 3g Cồn 96% 30ml b) Dung dịch KOH 0.01% 1000ml Cách pha: Trộn hai dung dịch a b lại với  khuấy hoà tan  đem lọc Bảo quản chai màu 51 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường MÔI TRƯỜNG I MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM MỐC VÀ NẤM MEN Môi trường Sabouraud: (để nuôi cấy nấm mốc nấm men) Công thức: Pepton 20g Mantose hay glucose 40g Agar 18g Nước cất vừa đủ 1000ml ( pH: 5,5 – 6,0 khử khuẩn nồi áp suất t0 = 1210C (1atm)/ 15- 20 phút) Môi trường PGA Thành phần môi trường PGA: Khoai tây 300g Glucose 20g Agar 15g Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ lọc lấy dịch lọc, sau bổ sung đường agar vào hấp khử trùng Sử dụng acid lactic chỉnh pH đến 5,5 để ức chế phát triển vi khuẩn Khử trùng 1210C 15 phút Môi trường PGA sau hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-46 0C đổ đĩa để nguội II MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐỐI VỚI VI KHUẨN Môi trường Nutrient Broth (NB): Công thức: Cao thịt 5g Pepton bột 10g NaCl 5g 52 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Nước cất 1000ml ( pH: 7,4 – 7,6 ) Cân 13g bột môi trường NB hòa vào 1000ml nước cất, khuấy Đem hấp khử trùng 1210C (1am)/ 15 – 20 phút Môi trường Nutrient Agar (NA): Thành phần môi trường môi trường NB có bổ sung 18g agar 1000ml môi trường Cân 13g bột môi trường NB + 18g agar hòa vào 1000ml nước cất, khuấy Khử khuẩn nồi áp suất t0 = 1210C (1atm)/ 15 – 20 phút Môi trường thạch bán lỏng di động: Công thức: Nutrient broth 13g Agar 5g Nước cất 1000ml pH: 7,2 Pha chế: Đem thành phần môi trường hòa tan nước cất, đun cách thủy cho agar hòa tan Phân vào ống nghiệm 16 x 120 mm, ống khoảng 5ml Đem hấp khử khuẩn 121 0C (1atm)/ 15 – 20 phút Lấy để đứng cho môi trường đông lại Môi trường Plate Count Agar (PCA): Thành phần: Trypton 5g Yeast extract 2.5g Glucose 1g Agar 15g Nước cất 1000ml Pha chế: Đem thành phần môi trường hòa tan nước cất, đun cách thủy cho agar hòa tan Đem hấp khử khuẩn 121 0C (1atm)/ 15 – 20 phút Phân phối vào các đĩa petri, mỗi đĩa dầy khoảng 10 - 20mm, Để nguội cho môi trường đông lại 53 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) Peptone 10g Lactose 10g Mật bò 20g Brilliant green 0,0133g Nước cất 1000 ml Hòa tan peptone va lactose vào 500ml nước cất, cho mật bò vào khoảng 200ml và brilliant green vào khoảng 100ml nước cất Trộn đều dung dịch và thêm nước đủ 1000 ml, chỉnh pH khoảng 7,4 Rót vào ống nghiệm có ống Durham 10ml môi trường BGBL Hấp 1210C, 1atm 15 phút Môi trường Lauryl Sulphate Broth (LSB) Tryptose 20g Lactose 5g Sodium chloride 5g KH2PO4 2,75g K2HPO4 2,75g Lauryl sulphate 0,1g Nước cất 1000ml Hòa tan các chất vào 1000 ml, chỉnh pH khoảng 7,4 Rót vào ống nghiệm có ống Durham 10ml môi trường LSB Hấp 1210C, 1atm 15 phút Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB hoặc VRBA) Cao nấm men 3g Peptone hoặc gelysate 7g NaCl 5g Muối mật 1,5g Lactose 10g 54 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Neutral red 0,03g Crystal violet 0,002g Agar 15g Nước cất 1000ml Hòa tan các thành phần nước, điều chỉnh pH 7,4 Đun sôi phút, không hấp khử trùng Sử dụng vào môi trường đổ đĩa Môi trường Potato Glucose Agar (PCA): - Thành phần môi trường: Khoai tây Glucose Agar 300g 20g 15g Pha chế môi trường: Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ lọc lấy dịch lọc, sau bổ sung đường agar vào hấp khử trùng Sử dụng acid lactic chỉnh pH đến 5,5 để ức chế phát triển vi khuẩn Khử trùng 1210C 15 phút 55 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Linh Thước (2005), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo dục Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh, Giáo trình THỰC TẬP VI SINH CƠ SỞ, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, Khoa Công nghệ sinh học Nguyễn Thị Sơn, Trần Lệ Minh, Tài liệu hướng dẫn thí nghiệm VI – HÓA SINH ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG, NXB Bách Khoa Hà Nội Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón, trồng 56 BẢNG TRA MPN BẢNG TRA MPN DÙNG CHO LOẠT ỐNG NGHIỆM Ở NỒNG ĐỘ PHA LOÃNG LIÊN TIẾP Số lượng ống dương tính Số ml mẫu sử dụng 10 0,1 0 0 0 0 0 1 0 2 2 3 0 3 3 0 1 1 1 1 1 2 1 2 3 1 3 Số MPN/100ml 9 12 12 16 13 16 19 11 15 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29 Số lượng ống dương tính Số ml mẫu sử dụng 10 0,1 0 2 2 2 1 2 2 2 2 2 3 3 2 3 0 3 3 3 1 3 3 3 2 3 3 3 3 3 Số MPN/100ml 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 - BẢNG TRA MPN DÙNG CHO LOẠT ỐNG NGHIỆM Ở NỒNG ĐỘ PHA LOÃNG LIÊN TIẾP Số lượng ống dương tính Số ml mẫu sử dụng 10 0,1 0 0 0 0 1 2 3 1 0 1 1 1 2 1 2 3 1 0 2 2 2 1 2 2 2 2 2 3 Số MPN/100ml 4 6 6 8 10 10 11 12 12 12 14 12 14 Số lượng ống dương tính Số ml mẫu sử dụng 10 0,1 4 4 1 4 4 2 4 4 4 4 4 5 5 0 5 5 5 1 5 5 5 2 3 5 5 Số MPN/100ml 20 25 17 20 25 20 25 30 25 35 40 35 40 45 40 50 55 25 30 45 60 75 35 45 65 85 115 50 70 95 120 150 175 80 3 3 3 3 3 3 3 4 0 1 1 2 3 4 0 0 2 1 0 15 11 13 11 14 17 20 14 17 20 17 20 20 25 25 13 17 5 5 5 5 5 5 5 5 - 3 3 4 4 4 5 5 5 - 5 - 110 140 175 200 250 130 170 225 275 350 425 250 350 550 900 1600 1800 - I II III IV HƯỚNG DẪN BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÁCH LẤY MẪU CÁC CHỈ TIÊU PHÂN TÍCH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KẾT QUẢ NHẬT KÝ LÀM VIỆC NGÀY MÔI TRƯỜNG SỐ KẾT QUẢ GHI CHÚ LƯỢNG GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN VƯU NGỌC DUNG ... 12 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường BÀI 3: XÁC ĐỊNH TỔNG VI KHUẨN KỴ KHÍ KỸ THUẬT ĐỔ MÔI TRƯỜNG VI KHUẨN KỴ KHÍ Phân lập vi sinh vật kị khí môi trường đặc đĩa petri Dùng môi. .. hỏi 30 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường BÀI 7: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN VI SINH VẬT KHÁI NIỆM Phân lập vi sinh vật trình tách riêng loài vi sinh vật từ... câu hỏi 19 Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP MPN CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT 11.1 Đếm lam phết kính Tiêu vi sinh vật