giáo trình thực hành vi sinh vật kỹ thuật môi trường

Máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm: Dụng cụ bằng thuỷ tinh hoặc kim loại: - Các dụng cụ đựng môi trường dinh dưỡng phải được khử khuẩn tuyệt đối trước khi sử dụng.. Số môi trường ch

Trang 1

1 Khi làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh học phải tuyệt đối vệ sinh, tôntrọng tính ngăn nắp và trật tự của phòng thí nghiệm.

2 Mỗi cá nhân, mỗi nhóm làm thí nghiệm với dụng cụ riêng, không được mượndụng cụ của các nhóm khác Nếu thiếu phải hỏi cán bộ PTN hoặc GVHD, không được tựđộng sử dụng dụng cụ của người khác

3 Phải mặc áo bluose

4 Không nói chuyện, không ăn uống, không hút thuốc lá, không đi lại lộn xộntrong PTN

5 Không để các vật phẩm, canh trường vi sinh vật hoặc môi trường nuôi cấy visinh vật gây bẩn ra bàn ghế, sách vở hoặc quần áo Trường hợp gây bẩn phải vệ sinh ngay

6 Sau khi làm xong, phải vệ sinh nơi làm việc của mình, vệ sinh các dụng cụ,máy móc thí nghiệm Rửa tay sạch và lấy cồn sát khuẩn trước khi ra khỏi PTN

7 Khi tiến hành thí nghiệm phải có sổ ghi chép các công việc thí nghiệm Trong

sổ ghi chép các điều kiện liên quan đến bài thí nghiệm Phải ghi chép đầy đủ, cẩn thận, rõràng

Trang 2

BÀI 1: CÁC QUY TẮC PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ KỸ

THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

1 CÁC QUY TẮC PHÒNG THÍ NGHIỆM

1.1 Tiệt trùng bề mặt và môi trường làm việc

Phòng thí nghiệm vi sinh phải được vệ sinh trước và sau khi sử dụng

Dụng cụ thiết bị được khử trùng hay vệ sinh sạch sẽ và sắp sếp ngăn nắp

Bề mặt làm việc phải được tiệt trùng bằng cồn 700

1.2 Máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm:

Dụng cụ bằng thuỷ tinh hoặc kim loại:

- Các dụng cụ đựng môi trường dinh dưỡng phải được khử khuẩn tuyệt đối trước khi

sử dụng Sau khi sử dụng xong phải rửa sạch và khử khuẩn lại, sấy khô, bao gói và để vàonơi quy định

- Các máy móc, thiết bị cần có độ chính xác cao (cân phân tích, buồng đếm…) càngcần phải chú ý vệ sinh trong và sau khi tiến hành thí nghiệm

Có hai phương pháp tiệt trùng: nhiệt khô hoặc nhiệt ẩm

*Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt khô: Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 150 -1800C

*Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt ẩm: Được thực hiện trong thiết bị tiệt trùng áp

suất 1atm, 1210C trong thời gian 20-30 phút

Dụng cụ bằng plastic chịu nhiệt: Tiệt trùng bằng nhiệt ẩm

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Thường được tiệt trùng trong thiết bị tiệt trùng ở

1210C, 15-30 phút

Đối với những thành phần của môi trường dinh dưỡng nhạy cảm với nhiệt độ caokhông thể sử dụng phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt trong thiết bị tiệt trùng Trong nhữngtrường hợp đó cần sử dụng màng lọc vi khuẩn để tiệt trùng

Trang 3

2 KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụduy trì thế oxi hoá khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường

Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết; Có độ pH thích hợp; Có độ nhớt nhất định; Khôngchứa các yếu tố độc hại; Hoàn toàn vô trùng

Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồngthời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng

2.2 Pha môi trường

Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tựhướng dẫn trong tài liệu

+ Môi trường lỏng: Cân, đong các chất rồi cho hoà tan vào nước

+ Môi trường đặc: Cân agar và hoá chất cho vào bình tam giác hay becher rồi hoàtan trong nước, đun trên bếp hay hấp trong autoclave

2.3 Chuẩn bị môi trường

a Thạch nghiêng

Cho vào ống nghiệm với một lượng môi trường đặc 1/3 đến 1/4 ống nghiệm

Để ống thạch ở vị trí nghiêng thích hợp cho đến lúc thạch đặc lại hoàn toàn

Vị trí đầu trên của mặt nghiêng không vượt quá 2/3 chiều cao ống nghiệm

Không để thạch chạm vào nút bông, khi làm nghiêng tốt, mặt thạch nghiêng bằng phẳng, không bị đứt, chiều dài vừa phải, không ngắn quá, dài quá

b Thạch đứng

Cho vào ống nghiệm với một lượng môi trường chiếm 1/2 đến 2/3 ống nghiệm.Thạch nguội sẽ đông lại và ta sẽ có ống thạch đứng

Trang 4

Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường chiếm 1/2 - 1/3 bình

c Làm thạch hộp petri

Đun thạch chảy lỏng, để nguội đến 50-600C

Tay phải cầm bình (hoặc ống) môi trường đã chảy lỏng, giữ hơi nghiêng, dùng taytrái xoay và rút nút bông ra, vô khuẩn miệng bình (hoặc miệng ống trên đèn cồn)

Dùng tay trái hé mở nắp hộp vừa phải và nhanh tay rót vào hộp một lượng môitrường thích hợp

Nhanh chóng đậy nắp hộp lại, xoay tròn hộp từ từ trên bàn để thạch dàn thành mộtlớp đều trên đáy hộp Không xoay mạnh làm thạch bắn tung lên

Hé mở nắp hộp và để yên cho đến lúc thạch đặc lại hoàn toàn

Đậy nắp lại, lật ngược hộp cho đáy lên trên

Hộp thạch đổ tốt, mặt thạch phải đều, bằng phẳng, lớp thạch không dày quá hoặcmỏng quá (thường khoảng 2mm)

Hình 1: Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và đĩa petri

Trang 5

Số môi trường chưa dùng đến phải bảo quản ở chỗ mát, nhiệt độ từ 0 - 50C, không đểmôi trường bị khô, bị tác dụng của ánh sáng.

Dù môi trường mới chuẩn bị hay đã bảo quản lâu, trước khi đem dùng đều phải kiểmtra sự vô khuẩn Muốn vậy, ta để môi trường trong tủ ấm có nhiệt độ từ 37 - 380C trong 2 –

3 ngày lấy ra quan sát và loại bỏ những ống (hoặc bình) môi trường có vi sinh vật phát triển(bị đục hoặc có khuẩn lạc)

2.4 Điều chỉnh độ pH của môi trường:

Điều chỉnh độ pH của môi trường dùng HCl 10% hay NaCl 10%

Ngoài ra có một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3 Lập nhãn môi trường vừa thực hiện:

Tên môi trường:

Trang 6

Chuẩn bị môi trường PCA (plate count agar)

Viết báo cáo

5 CHUẨN BỊ

Mẫu nước: sinh hoạt và nước thải

Mẫu đất

Trang 7

HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 1

1 Số liệu báo cáo

ỐNG NGHIỆM

……….

ỐNG NGHIỆM ………

ĐẠT KHÔNG ĐĨA PETRI ……….

ĐĨA PETRI ………

ĐẠT KHÔNG ĐĨA PETRI (PCA) ……….

ĐĨA PETRI (PCA) ………

ĐẠT KHÔNG Nhận xét kết quả:

2 Câu hỏi ôn bài:

2.1 Tại sao phải vô trùng? Các phương pháp vô trùng và tiệt trùng?

Trang 8

2.2 Tại sao lại mở nắp đĩa petri khi chuẩn bị môi trường thạch? Tại sao phải điều chỉnh

độ pH?

2.3 Có mấy dạng môi trường thạch ống nghiệm? Nêu các đặc trưng cho từng loại môitrường?

3 Yêu cầu bài học

- Nắm vững nội dung bài học

- Lập báo cáo kết quả và nhận xét

- Trả lời câu hỏi

Trang 9

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Xác định hay định lượng vi sinh vật là xác định số lượng cá thể tồn tại trong một đơn

vị vật phẩm hoặc canh trường Để định lượng, cần phải thao tác đúng quy cách một số vấn

đề như: lấy mẫu, pha loãng mẫu…

1 PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU

Để đánh giá chính xác số lượng vi sinh vật, yêu cầu đầu tiên là mẫu phải được lấy vàbảo quả đúng kỹ thuật

Tùy theo yêu cầu nghiên cứu, đối tượng nghiên cứu và các chỉ tiêu sinh học cần phântích mà khối lượng mẫu cũng như quy cách lấy mẫu (số lượng, vị trí, thời gian…) khácnhau.Tuy nhiên, việc lấy mẫu cần tuân theo những yêu cầu sau:

- Dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải vô trùng: đẩm bảo độ thuần khiết, tránh tạpnhiễm … đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích

- Dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải sạch, không độc hại với vi sinh vật, tránh làmchết hoặc ức chế vi sinh vật trong vận chuyển và bảo quản

- Các yêu cầu về khối lượng và tính đặc thù của mẫu:

+ Đủ khối lượng theo yêu cầu phân tich

+ Đúng nơi quy định và vào thời điểm phù hợp với yêu cầu nghiên cứu

+ Mẫu trung bình và điển hình

- Bảo quản: mẫu lấy xong phân tích ngay Nhiệt độ thường không để mẫu quá 30 phút.Nếu lấy mẫu xa, cần có thiết bị phân tích hiện trường hoặc bảo quản ở nhiệt độ thấp (0-50C),thời gian bảo quản không quá 24 giờ

- Các yêu cầu khác: mẫu cần được dán nhãn và ghi rõ

+ Mã số của mẫu

+ Loại và mục đích lấy mẫu

+ Tên và chức năng của người lấy mẫu

+Yêu cầu phân tích

2 PHA LOÃNG MẪU

5.1 Chuẩn bị mẫu

Yêu cầu của việc lấy mẫu:

- Lấy mẫu có tính chất đại diện

- Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý, hoá, sinh học

Trang 10

- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng

- Lấy mẫu xong phải phân tích ngay và không được để quá 24h

- Ghi nhật ký của mẫu và nơi thu mẫu

5.2 Pha loãng mẫu :

- Chuẩn bị một bình chứa mẫu cần phân tích

- Một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng

- Một số pipet vô trùng

- Pha loãng mẫu cần phải thực hiện trong tủ cấy hoặc phòng vô trùng

a Mẫu ở trạng thái lỏng :

Pha loãng mẫu theo dãy thập phân 1/10 (10-1), 1/100 (10-2), 1/1000 (10-3),… 10-n

Hình 2.1: Phương pháp pha loãng mẫu nước theo dãy thập phân

b Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực phẩm)

Môi trường đất nhìn chung rất thuận lợi cho nhiều nhóm vi sinh vật phát triển Hệ visinh vật đất rất đa dạng gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn… Số lượng vi sinh vật phụ thuộc vàohàm lượng chất hữu cơ, tính chất cơ lý cũng như độ ẩm của đất, số lượng cá thể thường rấtlớn

Các bước tiến hành:

Trang 11

- Lấy mẫu đất: mẫu đất mang phân tích có tính đại diện nên số lượng mẫu tùy theoyêu cầu nghiên cứu khác nhau Mẫu đất lấy từ 10-20g cho mỗi vị trí, lấy 4 mẫu của 4 gócvuông và 1 mẫu ở tâm, độ sâu nhất định và mẫu phải được trộn đều trước khi sử dụng.

- Chuẩn bị dụng cụ:

Một bình tam giác 250 ml chứa 90ml nước cất vô trùng

Một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng

Một số pipet vô trùng

- Pha loãng mẫu: cân 10 g đất (hoặc mẫu) cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất

vô trùng Lắc 10 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như trạng thái lỏng

Tuỳ theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít

Hình 2.2: Phương pháp pha loãng mẫu đặc theo dãy thập phân

Trang 12

6 KỸ THUẬT TRẢI ĐĨA

Hình 2.3: Minh họa kỹ thuật trải đĩaDùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch (tươngđương với 2 giọt dịch)

Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều và khoảng 25-300 CFU (coliformunit: đơn vị khuẩn lạc)

Sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch, que gạtthuỷ tinh được vô khuẩn bằng cách nhúng vào trong cồn, đốt cháy phần cồn còn lại trên quecấy trên ngọn lửa đèn cồn Làm nguội que cấy bằng cách nhẹ nó vào bề mặt thạch, rồi dànđều lượng chất lỏng chứa tế bào trên đó

Lớp chất lỏng trên thạch càng mỏng, sự hấp thu xảy ra càng nhanh

Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài ở nhiệt độ 300C và ủ trong 48 giờ

Trang 13

7.2 Hóa chất và môi trường

Môi trường Plate count agar (PCA) tổng hợp 23,5g hay môi trường thành phầngồm: Trypton, 5.0g; Yeast extract, 2.5g; Glucose, 1.0g; Agar,15g

Cân chính xác khối lượng môi trường cho vào becher 1,5 lít và thêm vào 1 lít

nước cất Đun nóng hỗn hợp đến khi tan đều rồi cho vào erlen 1,5 lít đem hấp khử trùng.Lưu ý, trong khi đun môi trường cần phải khuấy thường xuyên để môi trường không bịlắng và khét

Sau đó, hấp khử trùng ở 1210C, 1atm và thời gian 30 phút

- Pha nước muối sinh lý 0,9%

- Pha loãng mẫu (mẫu nước và đất)

- Đổ đĩa

- Trải đĩa

Đọc kết quả và viết báo cáo

Trang 14

Nồng độ pha loãng

1

………

2 ………

3 ……….

ĐẠT Số khuẩn lạc KHÔNG Nhận xét kết quả:

2.1 Tại sao phải pha loãng mẫu? Các bước pha loãng mẫu?

2.2 Vi sinh vật hiếu khí có ở đâu trong môi trường? ý nghĩa của việc xác định tổng vi khuẩn hiếu khí?

2.3 Tại sao phải khử trùng hay sát trùng toàn bộ: môi trường, dụng cụ, tay… trong quá trình thao tác? Ý nghĩa việc khử trùng và sát trùng?

Trang 15

BÀI 3: XÁC ĐỊNH TỔNG VI KHUẨN KỴ KHÍ

1 KỸ THUẬT ĐỔ MÔI TRƯỜNG VI KHUẨN KỴ KHÍ

Phân lập các vi sinh vật kị khí trên môi trường đặc ở đĩa petri

Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không khí trong môi trường

Để nguội môi trường còn 45 - 500C

Hút 0,1 ml mẫu vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa petri và đậy thật nhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí

Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri

Nuôi trong bình yếm khí: sau khi cấy vi khuẩn xong, cho vào bình yếm khí Thoamột lớp parafin lỏng lên miệng bình, đốt đèn cồn hay đèn cầy lên và đặt vào bình, đậy nắplại, hoặc dùng máy hút chân không Cho vào tủ ấm, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường,dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp

Ngoài ra, người ta còn sử dụng phương pháp xác định tổng vi khuẩn kị khí bằng ốngnghiệm đậy nút cao su nhưng môi trường nuôi cấy phải bổ sung đầy đủ glucose, trypticase,yeast và một số các muối khoáng khác cho vi khuẩn phát triển, đặc biệt phải bổ sung các tácnhân khử như cystein và Na2S vào môi trường.

Thao tác thực hiện:

Môi trường sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-460C Bổ sung vài giọt

Na2S + NaHCO3 để khử hết O2 trong môitrường

Cân 1g mẫu đất và pha loãng mẫu bằng nước cất vô trùng theo dãy thập phân liêntiếp, tiến hành pha loãng đến nồng độ thích hợp sao cho khuẩn lạc mọc trên đĩa khoảng 30 -

300 Không để mẫu trong nước pha loãng lâu hơn 30 phút

Hút 1ml mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm vô trùng

Trang 16

Rót môi trường ở nhiệt độ 40-460C vào ống nghiệm có chứa mẫu Rót môi trườngnhẹ nhàng tránh không tạo bọt khí và không để môi trường tràn ra ngoài.

Đậy ống nghiệm bằng nút cao su vô trùng Chờ cho thạch đông cứng lại và đem ủ ởnhiệt độ phòng

Sau 3 ngày đếm các khuẩn lạc riêng rẽ quan sát được

Sau khi khử trùng ở 1210C trong 15 phút, môi trường có pH 7.0 – 7.2

Cách pha hỗn hợp Na2S + NaHCO3: Cân 0,75g Na2S và 0,3g NaHCO3 pha trong

Trang 17

- NaCl tinh khiết 10g

Trang 18

Nồng độ pha loãng

1

………

2 ………

3 ……….

2.1 Tại sao phải sử dụng dung dịch Na2S + NaHCO3 ?

2.2 Vi sinh vật kỵ khí có ở đâu trong môi trường? ý nghĩa của việc xác định tổng vi khuẩn kỵ khí?

2.3 Phân biệt sự khác nhau giữa vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí?

2.4 Ý nghĩa việc xác định tổng vi khuẩn kỵ khí trong môi trường?

Trang 19

BÀI 4: XÁC ĐỊNH TỔNG VI NẤM

1 NGUYÊN TẮC

Nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triểntrong khoảng 20 – 280C, một số ít là ưa nóng và ưa lạnh Vi nấm có khả năng sinh trưởngtrong vùng pH từ 2-9, nhưng pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 – 6,5 Hầu hết vi nấmđều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí

Mật độ vi nấm trong mẫu được xác định dưới dạng tổng vi nấm bằng kỹ thuật phaloãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường thích hợp

10.2 Hóa chất và môi trường

Thành phần môi trường PGA:

Trang 20

- Nước muối sinh lý 1 lít

Trang 21

………

2 ………

3 ……….

2.1 Vi nấm là gì?

2.2 Phương pháp xác định tổng vi nấm?

2.3 Phân biệt khuẩn lạc vi khuẩn và vi nấm?

Trang 22

BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

- Hút 0.02-0.2 ml dung dịch pha loãng , nhỏ vào giữa hình vuông, ở mặt trên lam

- Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy ở đầu que dàn đều giọt mẫu ra xungquanh, vừa chạm vào cạnh hình vuông

- Cố định tiêu bản, nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm blue methylen

- Nhỏ một giọt dầu soi, xem ở vật kính x100

b Cách đếm

- Đếm số tế bào VSV/ 1VT (VT: vi trường)

- Đếm hết tất cả từ 30 – 50 VT/ hình vuông phết kính Theo sơ đồ hình vẽ

c Công thức tính

Trang 23

Trong đó:

X = Số VK đếm được trong một vi trường

400 = diện tích hình vuông phết kính, bằng 400mm2

0.0004 = diện tích của vi trường, πRR2 = 0.0004 mm2

Số vi trường có được trong S: 4cm2

V = thể tích giọt VK phết kính

H = hệ số pha loãng mẫu

11.2 Đếm trong buồng đếm:

a Cấu tạo buồng đếm.

- Buồng đếm là một phiến kính trong, dày, hình chữ nhật

- Giữa là phần lõm phẳng, có kẻ một hoặc hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ Bên ngoài

có ghi tên loại buồng đếm, và ghi các thông số kỹ thuật như hình trên

Hình 5.2: Cấu tạo buồng đếm

Trang 24

b Cấu tạo khung đếm.

Hình 5.3 Cấu tạo khung đếm

Cấu tạo một khung đếm có:

- Trường hợp1: 1 khung có 16 ô lớn, 1 ô lớn có 25 ô nhỏ Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ

- Trường hợp 2: 1 khung có 25 ô lớn, 1 ô lớn có 16 ô nhỏ Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ.

- Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400 mm2

Vậy Vô nhỏ = 0.1 mm x 1/400 mm2 = 1/4000mm3

c/ Cách tiến hành

- Đặt lammen sạch phủ lên khung đếm

- Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch nấm men đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu, bơmnhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm và lammen

- Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lammen, hơithừa một ít Nếu bị bọt kẹt lại trong lammen thì phải làm lại

- Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm

- Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó dùng vậtkính x40 để đếm

Trang 25

- Đếm số tế bào trong 5 ô lớn (4 ô ở cạnh, 1 ô ở giữa), đếm lần lượt từng ô nhỏtrong 1 ô lớn Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm

số tế bào nằm ở cạnh phía trên và cạnh bên phải ô

H = hệ số pha loãng (ví dụ: H = 10-2)

e Chú ý:

- Phương pháp này chỉ sử dụng để quan sát những vi sinh vật có kích thước lớn nhưbào tử của nấm men và nấm mốc

- Chỉ đếm được tổng số tế bào, không thể biết tế bào nào còn sống hay đã chết

- Nên nhuộm màu (methylene blue) để dễ quan sát và đếm chính xác

- Nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10

tế bào

- Sử dụng xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô

- Để đạt độ chính xác cao, thì số tế bào trung bình đếm được trong 1 ô nhỏ: 2.5 < a

<10

11.3 Phương pháp trải đĩa

Tương tự thao tác trải đĩa, số lượng tế bào vi sinh vật được xác định qua khuẩn lạc.Khuẩn lạc là các cá thể hay tế bào vi sinh vật được nuôi cấy trong các điều kiện môi trườngthích hợp, sau đó phân chia tạo thành nhiều cá thể hay quần thể vi sinh vật mà mắt thườngnhìn thấy được

Trang 26

11.4 Phương pháp MPN (Most Probable Number)

Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất; số tối khả) còn được gọi làphương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ

Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệmđược lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau Thông thường, việc định lượng này đượcthực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm

Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm địnhtrong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục …), ghi nhận

số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng

Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật đượctrình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu Độ chính xác của trị số MPN phụthuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng

Cụ thể là xác định số lượng Coliforms trong thực phẩm, nước uống, nước sinh hoạthoặc nước thải

Thao tác:

Trang 27

Bước 1: Lấy mẫu và pha loãng mẫu đến 3 nồng độ liên tiếp thích hợp.

Bước 2: Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 3 ống nghiệm môi trườngLauryl Sulphate broth (LSB) Hút 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ 3 ống nghiệm

Bước 3: Ủ ấm từ 35 – 370C, thời gian 24 - 48 giờ

Bước 4: Ống dương tính là có bọt khí trong ống durham

Bước 5: Tra bảng Mac Crady – loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ liên tiếp

Bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10 ml, 1ml và 0,1ml tương đương MPN/mlcủa mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2 và 10-3 dùng phân tích

Kết quả tra bảng MPN/ml = kết quả tra bảng x f/10

Trang 28

Nước cất 5 lít

12.3 Thực hành

Mẫu nước: nước thải và nước sinh hoạt

Mẫu đất

Định lượng trực tiếp số lượng tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu

Định lượng E.coli và Coliforms bằng phương pháp MPN.

Trang 29

1.1 Kết quả quan sát trên buồng đếm hồng cầu:

2.1 Nhược điểm của phương pháp điếm tế bào vi sinh vật bằng buồng đếm hồng cầu làgì?

2.2 Thao tác sử dụng kính hiển vi quan sát và đếm tế bào vi sinh vật?

Trang 30

2.3 Tại sao phải sử dụng môi trường BGBL sau khi xác định bằng môi trường LSB?

Trang 31

BÀI 6: XÁC ĐỊNH E.COLI VÀ COLIFORM

1 TỔNG QUAN

Vi khuẩn Coli (Total coliform) tồn tại trong tự nhiên, trong phân người, phân gia súc,trong nước, trong nước thải hay trong các vật phẩm có nguồn gốc khác nhau Theo đặc tínhnuôi cấy, người ta chia chúng làm hai nhóm:

- Fecal Coli (Escherichia coli - E.coli) có nguồn gốc từ phân (người, động vật, cá )

- Non fecal Coli (Bacterium coli) có nguồn gốc khác (đất, cây cỏ, nước thải…)

Vi khuẩn E.coli thuộc nhóm vi trùng đường ruột Enterobacteriaceae, chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng Vi khuẩn E.coli nhiễm vào đất,

nước… từ phân của động vật Sự có mặt của chúng chứng tỏ nước bị nhiễm phân hoặc nướcthải sinh hoạt Chúng sẽ gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chúng

- Hình dạng: Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh

tế bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không có độc lực không cócapsul Kích thước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu tròn Một số dòng có lông bám (pili)

- Đặc điểm nuôi cấy và sinh hóa: Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi Nhiệt độthích hợp 370C nhưng có thể mọc trên 400C, pH 7,4

- Trên môi trường VRBA tạo khuẩn lạc màu tím

- E.coli gây bệnh truyền nhiễm tiêu chảy hay nhiễm trùng huyết trẻ sơ sinh… Ngoài

ra, nước thải nhiễm E.coli còn có thể nhiễm các vi sinh vật khác có trong đường ruột như vi khuẩn tả (Vibrio choleras), vi khuẩn lỵ (Shigella), …

2 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG

Trang 32

Mẫu nước và mẫu đất:

- Pha loãng mẫu theo dãy nồng độ thập phân

- Chọn nồng độ thích hợp, lấy một lượng mẫu vừa phải cho vào đĩa petri có chứa môitrường VRB

- Trải đĩa và đem ủ ở nhiệt độ thích hợp, sau 24 giờ đọc kết quả

Đọc kết quả:

Sau 24 giờ các khuẩn lạc đặc trưng là E.coli và Coliform có màu đỏ tía, đường kính

0.5mm hoặc hơn, đôi khi được bao quanh bởi một vùng hơi đỏ của mật kết tủa

Viết báo cáo

15 CHUẨN BỊ

Môi trường NA

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	2,49 MB