giáo trình thực hành phân tích vi sinh thực phẩm

Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 2010 THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ThS Lê Thùy Linh Lưu hành nội Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM NỘI DUNG Bài 1: Định lượng Coliforms E coli Trang 1.1 Tóm tắt kiến thức 1.2 Quy trình định lượng Coliforms E coli phương pháp MPN 1.3 Cách tiến hành thí nghiệm 1.4 Cách tính kết 10 Bài Định lượng Staphylococcus aureus 10 2.1 Tóm tắt kiến thức 2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus phương pháp MPN 2.3 Cách tiến hành cách tính kết Bài Định tính Salmonella 10 10 11 14 3.1 Tóm tắt kiến thức 3.2 Qui trình định tính Salmonella thực phẩm Bài Định lượng Bacillus cereus 14 14 20 4.1 Tóm tắt kiến thức 4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus phương pháp đếm khuẩn lạc Bài Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí tổng nấm men-nấm mốc 20 20 24 5.1 Tóm tắt kiến thức 5.2 Quy trình phân tích 24 26 Tài liệu tham khảo Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, NXB Giáo dục, 2006 http://www.microbelibrary.org http://www.chromagar.com http://www.rapidmicrobiology.com http://www.marietta.edu Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bài 1: Định lượng Coliforms E coli 1.1 Tóm tắt kiến thức 1.1.1 Định nghĩa Hình 1: phát Coliforms E coli thực phẩm hay nước môi trường CHROMagar ECC Coliforms trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí kỵ khí tùy ý, có khả lên men lactose sinh acid sinh 370C 24 – 48 Coliforms xem nhóm vi sinh vật thị: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay loại mẫu môi trường dùng để thị khả diện loại vi sinh vật khác Nhóm Coliforms gồm giống là: E coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter Tính chất sinh hóa đặc trưng nhóm thể qua thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) Citrate (iC) thường gọi IMViC Coliforms chịu nhiệt Coliforms có khả lên men lactose sinh khoảng 24h ủ 440C môi trường canh EC Coliforms phân (Faecal Coliforms) Coliforms chịu nhiệt có khả sinh indole ủ khoảng 24h 440C canh Trypton E coli Coliforms phân cho kết thử nghiệm IMViC ++ (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -) 1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN) Đây phương pháp định lượng dựa kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha lỗng khác Thơng thường, việc định lượng thực lặp lại lần độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng x = ống nghiệm Quy trình thực sau: Pha lỗng mẫu phân tích nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp Kết biểu kiến chứng minh tăng trưởng vi sinh vật cần kiểm định Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính độ pha loãng Tra bảng Mac Crady Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Chú ý: Đa số bảng MPN cung cấp số liệu dạng số MPN 100ml dung dịch sử dụng để phân tích liều lượng 10ml, 1ml, 0.1 ml Trên thực tế phân tích, người ta thường dùng 1ml cho mẫu pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Lượng mẫu với độ pha loãng tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu Vậy số liệu bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha lỗng 1ml dung dịch có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3 dùng để phân tích Trường hợp mật độ vi sinh vật cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu với hệ số pha lỗng Ví dụ: sử dụng 1ml cho độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức sử dụng 1/10 lượng mẫu nồng độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Do vậy, trị số tra bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng 10 1.2 Quy trình định lượng Coliforms E coli phương pháp MPN Chuẩn bị dịch đồng pha lỗng mẫu để có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3… Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, nồng độ có ống lặp lại, ủ 370C, 48 Ghi nhận ống LSB (+) (sinh hơi) nồng độ pha loãng Cấy vào ống canh BGBL, ủ 370C ± 10C, 48 Số ống (+)(sinh )ở độ pha loãng Cấy vào ống canh EC, ủ 44.50C ± 0.20C, 24 Số ống (+) độ pha loãng Cấy lên thạch EMB, ủ 370C, 24 Coliforms Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Xem trang sau Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Tiếp theo Chọn khuẩn lạc (trịn, dẹt hình đĩa có ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate, ủ 44.50C ± 0.20C, 24 Thử nghiệm IMViC Đếm số ống canh EC (+) IMViC ++ , tra bảng MPN E coli 1.3 Cách tiến hành thí nghiệm Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho tổ) 1.3.1 Pha môi trường khử trùng dụng cụ Bước 1: pha môi trường Tên môi trường SPW (Saline Water) Thành phần NaCl : 42.5g Pepton Pepton: 5g Tryptose: 20g LSB (Lauryl Sulphate Lactose: 5g Broth) Sodium chloride: 5g KH2PO4: 2.75g K2HPO4: 2.75g Lauryl sulphate: 0.1g BGBL Peptone: 10g Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Tổng thể tích Ghi 500 ml nước Phân phối cho tổ 27ml cất SPW (9ml/ống nghiệm) trước khử trùng (buổi 1) 1000 ml nước Phân phối 90ml LSB cho cất tổ (10ml/ống nghiệm) pH 6.8 ± 0.2 trước khử trùng (buổi 1) 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM (Brilliant Bile Green Lactose: 10g Lactose Mật bò: 20g cất pH 7.4 tổ (10ml/ ống nghiệm có chứa ống Durham) trước Broth) Brilliant green: 0.0133g khử trùng (buổi 1) EC (E.coli medium) Trypticase or tryptose: 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho 20g cất tổ (10ml/ ống nghiệm có Muối mật No.3: 1.5g pH 6.9 chứa ống Durham) trước Lactose: 5g khử trùng (buổi 1) KH2PO4: 1.5g K2HPO4: 4g NaCl: 5g Pancreatic digest of 1000 ml nước Phân phối 100ml EMB cho EMB (Eosin Methylene gelatin: 10g cất tổ (20ml/petri) (buổi 2) Blue Agar) Lactose: 10g pH 7.1 ± 0.2 K2HPO4: 2g Eosin Y: 0.4g Methylene blue: 65mg Agar: 15g Tryptone water Tryptone trypticase:10g 1000ml nước Mỗi tổ dùng 20ml, phân cất phối 10ml/ống nghiệm pH 7.2 ± 0.2 (buổi 3) 1000ml nước MR-VP Both Môi trường 1: (Glucose Buffered peptone-water cất Phosphate) powder: 7g pH 6.9 ± 0.2 Glucose: 5g K2HPO4: 5g Mỗi tổ dùng 30ml, phân phối 10ml/ống nghiệm Kiểm tra lại môi trường cung cấp để pha môi trường (buổi 3) Môi trường 2: Casein Pancreatic Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM pH 6.9 ± 0.2 Môi trường 3: Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g pH 7.5 ± 0.2 Sodium citrate: 2g SCA (Simmons Citrate NaCl: 5g K2HPO4: 1g NH4H2PO4: 1g thoảng MgSO4: 0.2g Bromothymol 0.08g Agar: 15g Agar) 1000ml nước Mỗi tổ dùng 50ml, phân cất Đun nóng phối 10ml/ống nghiệm nhẹ thỉnh (buổi 3) Đun sôi 1-2 blue: phút hòa tan hết pH 6.8 ± 0.2 lắc Bước 2: khử trùng dụng cụ môi trường pha Bao gói dụng cụ phân phối mơi trường vào dụng cụ, gắn nút bao gói Hấp tiệt trùng 1210C 15 phút 1.3.2 Cách tiến hành: Bước 3: pha loãng mẫu 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml ống mẫu 9ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Độ pha lỗng Hình 2: quy trình pha lỗng mẫu Pha lỗng mẫu thành nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 4: Cấy mẫu vào canh LSB Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, nồng độ có ống lặp lại, ủ 370C, 48 Hình 3: Sơ đồ cấy mẫu từ độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 Bước 5: Định lượng Coliform E coli Định lượng Coliform Định lượng E coli Ghi nhận số ống có sinh (+) Ghi nhận số ống có sinh (+) Dùng que cấy vịng cấy chuyển dịch mẫu Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB (+) sang ống có chứa từ ống LSB (+) sang môi trường canh canh BGBL ủ 370C ± 10C, 48 EC, ủ 44.50C ± 0.20C, 24 Ghi nhận số ống có sinh (+) ứng với Ghi nhận số ống có sinh (+) ứng với độ pha lỗng độ pha lỗng Tính kết (xem 1.4) Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ ống (+) canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Ủ 370C, 24 Chọn khuẩn lạc đường kính lớn 1mm (trịn, dẹt hình đĩa có ánh kim xanh) (xem hình 4), cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate, ủ 44.50C ± 0.20C, 24 Page | Trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm TP.HCM Hình 4: E.coli nuôi môi trường thạch EMB cho khuẩn lạc màu kim xanh (theo Naowarat Cheeptham, Thompson Rivers University, Kamloops, BC, Canada) Bước 6: thử nghiệm IMViC Hình 5: Kết IMViC Escherichia coli sau 24giờ ủ 37°C (Anne Hanson, University of Maine, Orono) Ống A: dương tính thử nghiệm indole môi trường tryptone Xuất lớp màu đỏ bề mặt môi trường sau nhỏ thuốc thử Kovács Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất màu đỏ methyl red Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu qua khơng thay đổi màu sau cho thuốc thử Barritt’s A Barritt’s B Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu qua thay đổi màu sắc khơng có khuẩn lạc ống nghiệm a Thử nghiệm Indol (I): Nguyên tắc: Tryptophan acid amin bị oxi hóa số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên sản phẩm chứa gốc indol Việc phát indol thực phản ứng phân tử với thuốc thử chứa pDimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm nước tryptone Sinh khối chủng cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ nhiệt độ 370C 24-48 Bổ sung 1ml ether xylene vào ống nghiệm, lắc để chiết Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM tách indol lên lớp dung môi hữu Nhỏ giọt thuốc thử vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi tạo màu đỏ lớp dung môi hữu Đọc kết quả: (+) xuất lớp màu đỏ bề mặt môi trường (-) lớp màu vàng thuốc thử Đơi có xuất màu cam skatol, tiền chất methyl hóa indol, tạo Hình 6: thử nghiệm Indol b Thử nghiệm Methyl Red (MR): Nguyên tắc: thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H+ diện môi trường sau vi sinh vật lên men glucose Chỉ thị thay đổi màu sau: pH6.0 màu vàng Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm mơi trường lỏng Glucose Phosphate (MR-VP Broth) Dùng que vịng cấy lượng nhỏ khuẩn lạc môi trường MR-VP, ủ 370C khoảng 2-5 ngày Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ methyl red (0.02% hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo quản 40C) vào ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết Đọc kết quả: (+) mơi trường có màu đỏ sau bổ sung thuốc thử (-) có màu vàng Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống mơi trường có giống ngày thực lại Hình 7: thử nghiệm MR thử nghiệm c Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) (xem mục 3.3, 3) d Thử nghiệm Citrate (iC) Nguyên tắc: biến dưỡng citrate vi sinh vật tạo CO2 làm kềm hóa mơi trường Mặt khác VSV có khả sử dụng citrate làm nguồn carbon có khả dùng muối ammonium làm nguồn đạm Sự phân giải muối ammonium dùng làm nguồn đạm mơi trường sinh NH3 làm kiềm hóa mơi trường Sự gia tăng giá trị pH thị đổi màu thị pH môi trường Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 2: khử trùng dụng cụ môi trường pha Bao gói dụng cụ phân phối mơi trường vào dụng cụ, gắn nút bao gói Hấp tiệt trùng 1210C 15 phút Bước 3: đồng mẫu pha loãng mẫu Cân 10g mẫu túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dich SPW, đồng mẫu máy dập mẫu khoảng 30 giây Pha loãng mẫu (xem 1, mục 1.3.2) Bước 4: Cấy mẫu vào canh MSB Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh MSB, nồng độ có ống lặp lại, ủ 370C, 48 (xem 1, mục 1.3.2) Chọn ống (+) có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn BPA Bước 5: phân lập khuẩn lạc đơn BPA Dùng kỹ thuật cấy ria lên đĩa thạch BPA, ủ 370C, 48 Chọn khuẩn lạc đặc trưng :trịn lồi, đen bóng, có quầng quầng sáng xung quanh; xuất quầng (xem Hình 10: hình dạng S aureus BPA hình 10) Chọn khuẩn lạc đặc trưng S aureus BPA để thử nghiệm sinh hóa coagulase Bước 6: thử nghiệm sinh hóa coagulase Nguyên tắc: lồi thuộc giống Staphylococcus có khả tiết mơi trường enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ thành phần huyết tương, tạo thành khối đông làm đông huyết tương Phương pháp tiến hành: Huyết tương người hay thỏ đông khô thương phẩm dùng cho thử nghiệm Cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương người hay thỏ khơng pha lỗng, bổ sung 0.5ml dịch nuôi cấy chủng lượng lớn sinh khối khuẩn lạc Xoay nhẹ ống để trộn VSV Ủ ống thử nghiệm 370C Quan sát, ghi nhận ngưng kết 30 phút Tiếp tục ủ đến 24 không thấy xuất khối kết tụ Đọc kết quả: (+) có kết tụ; (-) khơng có kết tụ, hỗn hợp đồng Hình 11: thử nghiệm coagulase Ống (+); ống (-) Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 13 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bài Định tính Salmonella 3.1 Tóm tắt kiến thức Hình 12: Salmonella thạch XLD Salmonella trực trùng gram âm, hiếu khí kị khí tùy ý, có khả di động khơng tạo bào tử, lên men glucose mannitol sinh acid không lên men saccharose lactose, không sinh Indole, không phân giải ure, khơng có khả tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết chủng sinh H2S Salmonella phân tích định tính mộ quy trình gồm bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập khẳng định Salmonella thường có mặt mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương diện chung với số lượng lớn với loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh ức chế tăng trưởng Salmonella 3.2 Quy trình định tính Salmonella thực phẩm Đồng 25g mẫu 225ml môi trường tăng sinh BPW, ủ 370C, 18-24 Cấy 0.1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV, ủ 420C, 18-24 Phân lập khuẩn lạc đơn môi trường chọn lọc đặc biệt (XLD, HE, BS, SS…), ủ 370C, 24 Chọn khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang BHI hay TSA, ủ qua đêm Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả: - Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/khơng H2S, sinh hơi/khơng - Urea (-); Indol (-); VP (-); LDC (+); ODC (+); Manitol (+); Sorbitol (+) Salmonella dương tính/ âm tính 25g mẫu Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 14 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 3.3 Cách tiến hành tính kết Mẫu phân tích: cá ruột cá, khối lượng 25g cho lớp Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi Pepton: 10g BPW (Buffered Pepton NaCl : 5g 1000 ml nước Phân phối cho tổ 20ml cất BPW trước khử trùng Water) pH 7.2 ± 0.2 (buổi 2) 1110 ml Phân phối 30ml RV cho pH 5.5 ± 0.2 tổ (10ml/ống nghiệm) trước Na2HPO4: 3.5g KH2PO4: 1.5g RV Môi trường (RappaportTryptone:5g Vassiliadis Soya NaCl: 8g Pepton) KH2PO4: 1.6g Nước cất: 1000 ml khử trùng (buổi 2) Dung dịch MgCl2 MgCl2.6H2O: 400g Nước cất: 1000 ml Dung dịch Malachite green oxalate Malachite green oxalate: 0.4g Nước cất: 100 ml Môi trường hồn chỉnh Mơi trường bản: 1000ml Dung dịch MgCl2: 100ml Dung dịch Malachite green oxalate: 10ml Cao nấm men: 3g XLD (Xylose Lysine L-lysine: 5g Desoxycholate) Xylose: 3.75g Lactose: 7.5g Sucrose: 7.5g Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com 1000 ml nước Phân phối 50ml XLD cho cất tổ (25ml/petri) (buổi 3) pH 7.4 ± 0.2 Đun sôi môi trường Page | 15 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Sodium deoxycholate: 2.5g Không Không hấp giữ Ferric ammonium ngày citrate: 0.8g Sodium thiosulfate: 6.8g NaCl: 5g Agar:15g Phenol red: 0.08g HE (Hektoen Agar) TSA (Tryptone Agar) KIA (Kliger Agar) Proteose Peptone: 12.0g Entric Yeast Extract: 3.0g Bile Salts No 3: 9.0g Lactose: 12.0g Saccharose: 12.0g Salicin: 2.0g Sodium Chloride: 5.0g Sodium Thiosulfate: 5.0g Ferric Ammonium Citrate : 1.5g Agar: 14.0g Bromthymol Blue: 65.0mg Acid Fuchsin : 0.1g Trypticase peptone: 15g Soya Phytone peptone: 5g NaCl: 5g Agar: 15g Polypeptone peptone: Iron 20g Lactose: 20g Dextrose: 1g NaCl: 5g Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com 1000 ml nước Phân phối 50ml HE cho cất tổ (25ml/petri) (buổi 3) pH 7.5± 0.2 Đun sôi môi trường Không hấp 1000 ml nước Phân phối 50ml TSA cho cất tổ (25ml/petri) (buổi 4) pH 7.3± 0.2 1000 ml nước Phân phối 20ml KIA cho cất tổ (10ml/ống nghiệm) pH 7.4± 0.2 (buổi 5) Page | 16 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Ferric ammonium citrate: 0.5g Sodium thiosulfate: 0.5g Agar: 15g Phenol red: 0.025g MR-VP Both Môi trường 1: (Glucose Buffered peptone-water Phosphate) powder: 7g 1000ml nước Mỗi tổ dùng 40ml, phân cất phối 10ml/ống nghiệm pH 6.9 ± 0.2 Kiểm tra lại môi trường cung Glucose: 5g cấp để pha môi trường K2HPO4: 5g (buổi 5) Môi trường 2: Casein Pancreatic Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g pH 6.9 ± 0.2 Môi trường 3: Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g pH 7.5 ± 0.2 RSU (Rustigian-Stuart Urea Broth) Dipotassium Phosphate: 9.5g Yeast Extract: 0.1g Urea: 20g Monopotassium Phosphate: 9.1g Phenol Red: 0.01g Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com 1000ml nước Mỗi tổ dùng 30ml, phân cất phối 3ml/ống nghiệm pH 6.8 ± 0.2 (buổi 5) Page | 17 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 2: khử trùng dụng cụ mơi trường pha Bao gói dụng cụ phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút bao gói Hấp tiệt trùng 1210C 15 phút Bước 4: Tăng sinh Đối với loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW đồng mẫu Stomacher 15 30 giây Ủ 370C, 18-24 Đối với số loại thực phẩm (mẫu gia cầm tươi sống, sữa khô, gia vị hay loại thực phẩm chứa nhiều gia vị, casein, mát, bơ, sản phẩm chứa cocoa, sản phẩm dừa) có chứa chất gây độc ức chế tăng trưởng Salmonella cần thực quy trình tăng sinh đặc biệt (xem TLTK) Bước 5: Tăng sinh chọn lọc Lắc để trộn dịch tăng sinh, chuyển 0.1ml sang 10ml môi trường tăng sinh RV ủ ấm 420C Ủ 420C, 18-24 Khi cần thiết kéo dài thời gian ủ thêm 24 Bước 6: Phân lập nhận diện Dùng que cấy vòng thực kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella XLD HE Biểu Salmonella môi trường sau: + Mơi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng suốt, có hay khơng có tâm đen Một số dịng Salmonella có tâm đen bóng lớn chiếm gần hết khuẩn lạc Hình 14: khuẩn lạc Salmonella HE Hình 13: khuẩn lạc Salmonella XLD + Mơi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh lục, có hay khơng có tâm đen Một số dịng Salmonella có tâm đen bóng lớn chiếm gần hết khuẩn lạc Bước 7: Khẳng định Từ môi trường chọn lọc phân biệt chọn cấy chuyền khuẩn lạc nghi ngờ sang mơi trường không chọn lọc TSA Ủ 370C, 18-24 Các khuẩn lạc xuất môi trường sử dụng cho thử nghiệm sinh hóa sau: Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 18 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM + Thử nghiệm sinh H2S môi trường KIA (Kligler Iron Agar): Môi trường KIA sử dụng để thử nghiệm khả sử dụng nguồn carbon khác (glucose, lactose) khả sinh H2S Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa loại đường 1% lactose 0.1% glucose Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trường có trường hợp xảy tăng trưởng VSV: sử dụng glucose, sử dụng glucose lactose, không sử dụng hai đường Salmonella lên men đường glucose phần nghiêng mơi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng Thời gian ủ từ 18-24 Về sinh hơi: đa số dịng Salmonella có khả sinh H2S nên có xuất vệt màu đen mơi trường Có thể thấy tượng sinh qua tượng làm vỡ thạch môi trường môi trường bị đẩy lên tạo khoảng không bên đáy ống nghiệm Hình 15: thử nghiệm KIA Ống 1: mơi trường KIA khơng có VSV Ống 2: xuất màu vàng chứng tỏ VSV lên men lactose tốt (lên men glucose tốt) Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên men có sinh khí Ống 4: màu đỏ phần thạch nghiêng, màu vàng đáy chứng tỏ VSV lên men glucose Ống 5: màu đen xuất chứng tỏ có q trình khử lưu huỳnh sinh H2S + Thử nghiệm urea (-): thực môi trường urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Broth), chứa thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu pH 6.8-8.4) Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc chủng vào ống chứa 3ml môi trường vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn vi khuẩn ủ 370C 48 Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường; sau nuôi cấy môi trường giữ nguyên màu vàng cam Hình 16: kết thử nghiệm Urea + Thử nghiệm VP (-): môi trường sử dụng môi trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), pH 6.9 Dùng que cấy vịng cấy vào ống mơi trường MR-VP sinh khối từ khuẩn lạc chủng ủ 18-24 môi trường KIA Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A 5% α-naphthol cồn Hình 17: kết thử nghiệm VP Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 19 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM tuyệt đối, dung dịch B 40% NaOH hay KOH Trước tiên nhỏ giọt dung dịch A, sau nhỏ giọt dung dịch B Đọc kết sau 20 phút chậm Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có tượng không đổi màu bề mặt môi trường Thử nghiệm VP (+) có màu đỏ bề mặt mơi trường Bài Định lượng Bacillus cereus 4.1 Tóm tắt kiến thức B cereus trực khuẩn, gram dương, hiếu khí kỵ khí tùy ý, di động, tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả sử dụng nitrate Loài tăng trưởng khoảng nhiệt độ từ 50C – 500C, tối ưu 350C – 400C; pH dao động từ 4.5-9.3, dễ tạo bào tử bào tử nảy mầm dễ dàng Trên môi trường chọn lọc loài tạo khuẩn lạc lớn, mọc lan, rìa nhăn 4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus phương pháp đếm khuẩn lạc Cân 25g mẫu, đồng 225ml BPW, đồng Stomacher, độ pha loãng 10-1 Pha loãng đến độ pha loãng 10-2, 10-3 Trãi 0.1ml độ pha lỗng lên mơi trường thạch MYP, ủ 300C, 24 Chọn khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase dương tính (tủa lecithinase bao quanh khuẩn lạc) cấy sang thạch nghiêng MYP, ủ 300C, 24 Nhuộm Gram thử nghiệm sinh hóa như: lên men glucose, thử nghiệm VP Kết luận B cereus Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 20 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 4.3 Cách tiến hành tính kết Mẫu phân tích: tôm khô, khối lượng 50g cho lớp Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi Pepton: 10g BPW (Buffered Pepton NaCl : 5g Water) Na2HPO4: 3.5g 1000 ml nước Phân phối cho tổ 50ml cất BPW trước khử trùng pH 7.2 ± 0.2 (buổi 4) KH2PO4: 1.5g MYP (Mannitol-Egg Yolk-Polymycin) Môi trường Cao thịt: 1g Pepton: 10g Mannitol: 10g NaCl: 10g Phenol red (1% ethanol 90%): 2.5ml Agar: 15g Nước cất: 900 ml Môi trường Phân phối 100ml MYP cho đem tổ (12.5ml/petri) (buổi khử trùng, để 4) nguội 500C Sau trộn thành phần lại Dung dịch Polymixin 0.1% Hòa tan 500 000 đơn vị polymixin B sulfate 50ml nước cất Lọc vô trùng cất tối 40C dùng Egg yolk emulsion 50% (sản phẩm thương mại) Môi trường cuối Môi trường bản: 225ml (ở 500C) Dung dịch Polymixin B: Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 21 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 2.5ml Egg yolk emulsion (lòng đỏ trứng): 12.5ml Proteose peptone No 3: 1000 ml nước Phân phối 30ml PRG cho Red 10 g cất tổ (3ml/ống nghiệm) Glucose Broth) NaCl: g pH 7.4 ± 0.2 (buổi 4) Beef extract (optional): PRG (Phenol 1g Dextrose: g Phenol red (7.2 ml of 0.25% solution): 0.018 g 1000ml nước MR-VP Both Môi trường 1: (Glucose Buffered peptone-water cất pH 6.9 ± 0.2 Phosphate) powder: 7g Glucose: 5g K2HPO4: 5g Mỗi tổ dùng 50ml, phân phối 10ml/ống nghiệm Kiểm tra lại môi trường cung cấp để pha môi trường (buổi 4) Môi trường 2: Casein Pancreatic Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g pH 6.9 ± 0.2 Môi trường 3: Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g pH 7.5 ± 0.2 Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 22 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 2: khử trùng dụng cụ môi trường pha Bao gói dụng cụ phân phối mơi trường vào dụng cụ, gắn nút bao gói Hấp tiệt trùng 1210C 15 phút Bước 3: Pha loãng mẫu Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường BPW đồng để có độ pha lỗng 10-1, đồng Stomacher phút Mẫu tiếp tục pha loãng thành 10-2, 10-3 Bước 4: Phát mơi trường chọn lọc Trãi 0.1ml độ pha lỗng môi trường thạch MYP, ủ 30 C, 24 Do B cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase kháng polymycin nên môi trường khuẩn lạc B cereus có màu hồng eosin, bao quanh vùng có tủa chứng tỏ lecithinase tạo thành Chọn khuẩn lạc (+) cấy sang thạch Hình 18: khuẩn lạc B cereus MYP nghiêng để chuẩn bị cho phản ứng khẳng định Bước 5: Các thử nghiệm khẳng định - Nhuộm Gram: nhỏ giọt nước cất lên phiến kính sạch; dùng que cấy vịng lấy sinh khối vi khuẩn chuyển vào giọt nước phiến kính, khuấy nhẹ Cố định vệt bơi phiến kính cách hơ lửa đèn cồn Nhỏ vài giọt methyl violet lên vệt bôi, giữ yên 20 giây Rửa phẩm nhuộm nước Nhỏ vài giọt dung dịch KI/I2 lên vệt bôi, để yên phút Rửa cồn 95% đến vừa màu Rửa lại nước Nhuộm dung dịch safranin 30 giây Rửa nước Thấm nước dư giấy lọc Quan sát vi khuẩn vật kính 100X nhúng dầu, Gram dương có màu xanh tía, Gram âm có màu đỏ hồng Thử nghiệm lên men glucose: cấy vi khuẩn vào 3ml canh PRG, ủ 350C, 24 điều kiện kỵ khí Lắc ống nghiệm thật mạnh quan sát phát triển thông qua độ đục chuyển màu từ đỏ sang vàng, chứng tỏ sinh acid từ glucose điều kiện kỵ khí Hình 19: nhuộm gram B cereus - Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 23 Trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm TP.HCM Hình 20: thử nghiệm lên men glucose Ống a: đối chứng Ống b: không lên men glucose Ống c: lên men yếu Ống d: lên men mạnh - Thử nghiệm VP (xem 3) Bài Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí tổng nấm men-nấm mốc 5.1 Tóm tắt kiến thức Vi khuẩn hiếu khí vi khuẩn tăng trưởng hình thành khuẩn lạc điều kiện có oxi phân tử Tổng số vi khuẩn hiếu khí diện mẫu thị mức độ vệ sinh thực phẩm Chỉ số xác định phương pháp đếm khuẩn lạc mọc môi trường thạch dinh dưỡng từ lượng mẫu xác định sở xem khuẩn lạc sinh khối phát triển từ tế bào diện mẫu biểu diễn dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) đơn vị khối lượng thực phẩm Nấm mốc vi nấm dạng sợi, sinh sản bào tử khuẩn ty Nấm men tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, tồn dạng khuẩn ty giả tế bào kết thành chuỗi Đơn vị hình thành khuẩn lạc nấm mốc nấm men mầm để tạo nên khuẩn lạc ni cấy mơi trường Mầm bào tử, tế bào hay đoạn khuẩn ty Trong thực phẩm, nấm mốc nấm men diện tăng trưởng làm thay đổi màu thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu thực phẩm Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 24 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 5.2 Quy trình phân tích Đồng pha lỗng mẫu để có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4… Xác định tổng số VK hiếu khí kỷ thuật hộp đổ Xác định tổng số nấm men nấm mốc kỷ thuật hộp trải Chọn nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vơ trùng (mỗi nồng độ cấy đĩa) Trải 0.1ml mẫu lên đĩa DRBC, ủ ngửa đĩa 250C, 5-7 ngày (mỗi nồng độ cấy đĩa) Rót vào đĩa petri 1015ml môi trường PCA làm nguội đến 450C, lắc cho mẫu phân tán vào môi trường, ủ 300C 72 Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men Chọn đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25-250 khuẩn lạc/đĩa để đếm Tính kết quả: tổng số vi sinh vật hiếu khí tổng số nấm men nấm mốc mẫu (CFU/g CFU/ml) 5.3 Cách tiến hành thí nghiệm Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho tổ) 1.3.1 Pha môi trường khử trùng dụng cụ Bước 1: pha môi trường Tên môi trường SPW (Saline Water) Thành phần NaCl : 42.5g Pepton Pepton: 5g Tổng thể tích Ghi 500 ml nước cất Phân phối cho tổ 27ml SPW (9ml/ống nghiệm) trước khử trùng (buổi 5) Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 25 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM PCA (Plate Agar) Casein enzymic Count hydrolysate: 5g Yeast extract: 2.5 g 1000 ml nước Phân phối 100ml PCA cho cất tổ (15ml/petri) (buổi pH 7.0 ± 0.2 5) Dextrose: 1g Agar: 15g Glucose: 10g DRBC (Dichloran Rose Peptone: 5g Bengal KH2PO4: 1g Chloramphenicol MgSO4: 0.5g Agar) 1000 ml nước Phân phối 100ml DRBC cất cho tổ (15ml/petri) pH 5.6 ± 0.2 (buổi 5) Lưu ý: trộn lẫn Rose bengal (dung dịch thành phần 5%, w/v): 0.5ml trừ Dichloran (0.2%(w/v) chloramphenicol, ethanol): 1ml đun nóng để hịa Chloramphenicol: 0.1g tan hết agar, hấp Agar: 15g khử trùng Để nguội đến 500C, bổ sung 1ml dung dịch kháng sinh 100X vào 100ml môi trường Bước 2: khử trùng dụng cụ mơi trường pha Bao gói dụng cụ phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút bao gói Hấp tiệt trùng 1210C 15 phút Bước 3: pha loãng mẫu (xem 1, mục 1.3.2) Bước 4: thực qui trình Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 26 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Cách tính kết Đếm tất khuẩn lạc xuất đĩa sau ủ Chọn số đĩa có số đếm khoảng 25-250 để tính kết Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí hay tổng số nấm men nấm mốc tính sau: Trong đó: A (CFU/g hay CFU/ml) = N n1 x V x f1 + ⋯ + ni x V x i A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm men) 1g hay 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn ni: số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa fi: độ pha loãng tương ứng Nếu độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm đĩa >250, ví dụ nồng độ 10-5 số đếm lớn 250, kết ghi: >2.5 x 107 CFU/g Nếu độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm đĩa