Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 24 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com - Thử nghiệm VP (xem bài 3) Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc 5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có oxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty. Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm. Hình 20: thử nghiệm lên men glucose. Ống a: đối chứng. Ống b: không lên men glucose. Ống c: lên men yếu. Ống d: lên men m ạ nh. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 25 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com 5.2 Quy trình phân tích 5.3 Cách tiến hành thí nghiệm Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ) 1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú SPW (Saline Pepton Water) NaCl : 42.5g Pepton: 5g 500 ml nước cất Phân phối cho mỗi tổ 27ml SPW (9ml/ống nghiệm) trước khi khử trùng. (buổi 5) Đồng nhất và pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 … Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa) Trải 0.1ml mẫu lên đĩa DRBC, ủ ngửa đĩa ở 25 0 C, 5-7 ngày (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa) Rót vào mỗi đĩa petri 10- 15ml môi trường PCA đã được làm nguội đến 45 0 C, lắc cho mẫu phân tán đều vào môi trường, ủ ở 30 0 C trong 72 gi ờ Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250 khuẩn lạc/đĩa để đếm Tính kết quả: tổng số vi sinh vật hiếu khí và tổng số nấm men nấm mốc trong mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml) Xác định tổng số VK hiếu khí bằng kỷ thuật hộp đổ Xác định tổng số nấm men nấm mốc bằng kỷ thuật hộp trải Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 26 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com PCA (Plate Count Agar) Casein enzymic hydrolysate: 5g Yeast extract: 2.5 g Dextrose: 1g Agar: 15g 1000 ml nước cất pH 7.0 ± 0.2 Phân phối 100ml PCA cho mỗi tổ (15ml/petri). (buổi 5) DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar) Glucose: 10g Peptone: 5g KH 2 PO 4 : 1g MgSO 4 : 0.5g Rose bengal (dung dịch 5%, w/v): 0.5ml Dichloran (0.2%(w/v) trong ethanol): 1ml Chloramphenicol: 0.1g Agar: 15g 1000 ml nước cất pH 5.6 ± 0.2. Lưu ý: trộn lẫn các thành phần trừ chloramphenicol, đun nóng để hòa tan hết agar, hấp khử trùng. Để nguội đến 50 0 C, bổ sung 1ml dung dịch kháng sinh 100X vào 100ml môi trường. Phân phối 100ml DRBC cho mỗi tổ (15ml/petri). (buổi 5) Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 121 0 C trong 15 phút. Bước 3: pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2) Bước 4: thực hiện như qui trình Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 27 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Cách tính kết quả Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn số đĩa có số đếm trong khoảng 25-250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí hay tổng số nấm men nấm mốc được tính như sau: !"#$%&'!()*!#$%&+, / 01!2!3!2!4156507!2!3!2!87 Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm men) trong 1g hay 1ml mẫu. N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng. Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa >250, ví dụ ở nồng độ 10 -5 số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 10 7 CFU/g. Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa <25, ví dụ ở nồng độ 10 -1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2.5 x 10 2 CFU/g. . 42.5g Pepton: 5g 50 0 ml nước cất Phân phối cho mỗi tổ 27ml SPW (9ml/ống nghiệm) trước khi khử trùng. (buổi 5) Đồng nhất và pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 …. nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 25 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com 5. 2 Quy trình phân tích 5. 3 Cách tiến hành thí. nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 24 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com - Thử nghiệm VP (xem bài 3) Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm